Name: live-imaging of mitochondrial system in cultured astrocytes
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes at JoVE.com

Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación Synapsis otorgada a K.R. y al Hospital Universitario de Lausana (CHUV). Los autores agradecen a Nikon su ayuda, en particular a J. Gannevat.

El presente protocolo se ha realizado con la aprobación de un comité ético (acuerdo VD3602, Lausana, Suiza) y sigue las directrices europeas para el uso de animales.
1. Cultivo primario de astrocitos del hipocampo de ratas
<ol><li>Sacrifica cinco cachorros de rata (Wistar IGS Rat) por decapitación en el día postnatal 1-2.</li>
	<li>Retire el cerebro y manténgalo en una placa de Petri que contenga 5 ml de medio de astrocito fresco (DMEM con GlutaMAX suplementado con 1% de penicilina / estreptomicina y 10% de suero de caballo fresco).</li>
	<li>Aislar el hipocampo. Disociar en 5 mL del medio astrocítico por tres pasajes a través de una aguja de 21 G y tres pasajes a través de una aguja de 25 G.</li>
	<li>Transfiera las células disociadas a un tubo centrífugo de 15 ml y cuente en un hemocitómetro.</li>
	<li>Coloque 20.000-25.000 células/cm2 en platos multipocillo (9,4 mm x 10,7 mm x 9,3 mm) y guárdelos a 37 °C bajo una atmósfera que contenga 5% de CO2 para el resto del experimento.</li>
	<li>Reemplace el medio por completo a los 3 días in vitro (DIV3).</li>
	<li>En DIV8, agregue 0.6 pg de antígeno p24 por célula del vector lentiviral que codifica para el biosensor mitocondrial MitoTimer (LV-G1-MitoTimer22)diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS + 0.01% BSA).</li>
	<li>En DIV9, lavar con PBS estéril precalentado 1x (37 °C) y añadir medio de astrocito fresco.</li>
	<li>En DIV11, realice 2 lavados con PBS estéril 1x precalentado (37 °C) y agregue medio de astrocito fresco sin rojo fenol. NOTA: La elección del recubrimiento depende del ensayo previsto. Como recubrimiento estándar para el cultivo primario de astrocitos, se recomienda utilizar 0,2 mg/ml de poli-D-lisina o 8,7 μg/cm2 de matriz de membrana basal (por ejemplo, Matrigel). Para visualizar el sistema mitocondrial de los astrocitos, es esencial trabajar en células aplanadas y estiradas. En este contexto, la combinación de la matriz de membrana basal en los u-slides ibidi es la más adecuada. También es crucial no trabajar con rojo fenol, que es tóxico para la célula bajo exposición repetida a la luz.</li>
</ol>2. Monitorización a largo plazo del sistema mitocondrial.
<ol><li>Evaluar el sistema mitocondrial astrocítico un mínimo de 3-5 días después de las infecciones lentivirales con LV-G1-MitoTimer (para permitir un nivel suficiente de fluorescencia en las mitocondrias).</li>
	<li>Imagine las células con un microscopio invertido controlado por el software de adquisición y análisis y un módulo para la automatización completa de la adquisición. NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener los detalles del software y el módulo utilizados en este estudio.</li>
	<li>Asegúrese de que el microscopio esté equipado con una incubadora de jaula (ver Tabla de materiales)para mantener el cultivo de astrocitos al 5% de CO2 y 37 °C durante todo el experimento.</li>
	<li>Capture imágenes de fluorescencia utilizando excitación secuencial a 490 nm (para canal verde) y 550 nm (para canal rojo) con detección de señales de fluorescencia verdes (500-540 nm para canal verde) y rojas (550-600 nm para canal rojo).</li>
	<li>Seleccione 5 astrocitos por pozo con una red mitocondrial que exprese niveles suficientes de LV-G1-MitoTimer utilizando un aumento de 40x. Tenga cuidado de seleccionar astrocitos lo más planos y grandes posible y no ubicados en grupos de células (para trabajar en células individuales).</li>
	<li>Guarde las coordenadas de las 5 celdas seleccionadas en un archivo xlm (map.xlm). Este map.xlm permite al usuario volver a las mismas celdas a lo largo del tiempo.</li>
	<li>Adquiera secuencias de imágenes (1 imagen/s durante 60 s) utilizando un aumento de 150x (objetivo de inmersión de aceite de 100x, aumento intermedio de 1.5x) para cada coordenada.</li>
	<li>Repetir la adquisición de imágenes (1 imagen/s durante 60 s) para los mismos astrocitos 6 h, 12 h y 24 h después de los tratamientos. NOTA: Utilice un microscopio equipado con un sistema de enfoque automático rápido y eficiente. En este contexto, se utilizó la solución de hardware denominada Perfect Focus System (PFS). PFS utiliza sensores de línea LED y CCD de 870 nm de infrarrojo cercano para combatir las fluctuaciones de enfoque axial en tiempo real durante las investigaciones de imágenes a largo plazo.</li>
</ol>3. Análisis de la morfología mitocondrial individual y la relación LV-G1-MitoTimer
NOTA: NiS General Analysis 3 (GA3) de Nikon se utilizó para automatizar el análisis morfométrico en este estudio.
<ol><li>Para cada secuencia de imagen (línea base, 6 h, 12 h, 24 h), seleccione el primer fotograma para los canales rojo y verde haciendo clic en Procesamiento ND > Seleccionar fotograma.</li>
	<li>Combine los canales rojo y verde seleccionando Conversiones > Combinar canal.</li>
	<li>Para corregir el sombreado de imagen, seleccione Preprocesamiento > Corrección automática de sombreado.</li>
	<li>Aplique el algoritmo Rolling Ball seleccionando Preprocesamiento > Rolling Ball.</li>
	<li>Para generar máscaras binarias para cada mitocondria, seleccione Segmentación > Umbral.</li>
	<li>Elimine los objetos truncados por el borde seleccionando Procesamiento binario > Borde táctil.</li>
	<li>Para medir el área de superficie, seleccione Medición > Área de objetos.</li>
	<li>Para medir el diámetro, seleccione Medición > Diámetro de ecualización.</li>
	<li>Para medir la longitud, seleccione Medición > Longitud.</li>
	<li>Para medir el ancho, seleccione Medición > Ancho.</li>
	<li>Para medir la rugosidad, seleccione Medición > Rugosidad.</li>
	<li>Para medir la circularidad, seleccione Medición > circularidad.</li>
	<li>Para medir el alargamiento, seleccione Medición > elongación.</li>
	<li>Componga un grupo (haga clic con el botón derecho) con la medida anterior y cámbiele el nombre a MorphoData.</li>
	<li>Mida la intensidad verde media seleccionando Medición > Intensidad media.</li>
	<li>Mida la intensidad roja media seleccionando Medición > Intensidad media.</li>
	<li>Para medir la relación Rojo/Verde, seleccione Medición > Ratio.</li>
	<li>Componga un grupo (haga clic con el botón derecho) con la medida anterior y cámbiele el nombre como RatioData.</li>
	<li>Exporte la tabla a un archivo CSV seleccionando Referencia > Tabla a CSV.</li>
	<li>Guarde el script de análisis GA3 seleccionando Guardar como NOTA: Una lista no exhaustiva de los criterios utilizados en este procedimiento se resume en la Figura 1, tabla 1y tabla 2. El archivo de script GA3 de análisis está disponible en suplementario (Supplemental Coding File 1 y Figure 2). Los umbrales utilizados se adaptaron para individualizar tantas mitocondrias como fuera posible (excluyendo las grandes redes mitocondriales cuando sea posible). Siempre que sea posible, las redes mitocondriales se individualizan manualmente o se excluyen de los análisis. Debido a la variabilidad intercelular, realice estos análisis en al menos 20-25 células por condición (con un mínimo de 50 mitocondrias por célula).</li>
</ol>4. Análisis de la motilidad mitocondrial
NOTA: Debido a la alta complejidad de los movimientos mitocondriales, se prefiere el análisis manual de motilidad. Aquí, el sistema NIS Element de Nikon se utilizó para rastrear manualmente las mitocondrias.
<ol><li>Abra el módulo de seguimiento en NIS, seleccione Ver análisis > > seguimiento.</li>
	<li>Haga clic en Definir nuevo ROI.</li>
	<li>Con la herramienta de detección automática,seleccione 25-50 mitocondrias en la primera imagen de la secuencia de imágenes.</li>
	<li>Haga clic en Rastrear análisis de ROI detectados automáticamente.</li>
	<li>Si es necesario, elimine las pistas de ROI incorrectas.</li>
	<li>Exporte la tabla a un archivo CSV. NOTA: Una lista no exhaustiva de los criterios utilizados en este procedimiento se resume en la Figura 1 y la Tabla 3. Un análisis de seguimiento generalmente proporciona una ruta que representa los movimientos del centro de cada objeto rastreado. Las diferentes opciones de seguimiento deben establecerse en la opción de seguimiento. Favorecer la selección de mitocondrias aisladas que estén lo suficientemente distantes entre sí para facilitar el seguimiento. Mantenga solo los objetos que se pueden rastrear de manera consistente a lo largo de toda la secuencia. Proceda de la misma manera para eliminar valores atípicos debido al seguimiento de mala calidad. En consecuencia, el conjunto de objetos analizados en esta sección es diferente del analizado para los análisis morfológicos estáticos y generalmente será más pequeño.</li>
</ol>5. Transformación de datos, normalización y análisis estadístico
NOTA: Principalmente debido a la alta heterogeneidad de las mitocondrias, los datos generados a menudo tienen una distribución no normal.
<ol><li>Transforme manualmente las mediciones antes del procesamiento.</li>
	<li>Para cada análisis y marco de tiempo, normalice manualmente los datos resultantes por la media de los obtenidos en la adquisición de referencia.</li>
	<li>Además, considere una segunda/ doble normalización a una condición de control, por ejemplo, para evaluar el efecto de un tratamiento.</li>
	<li>Luego, realice un análisis estadístico utilizando un ANOVA emparejado bidireccional. Aquí se utilizó GraphPad Prism V8.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Aquí, se propone un método novedoso para seguir longitudinalmente la dinámica y el recambio del sistema mitocondrial en un astrocito cultivado. A diferencia de un enfoque de lapso de tiempo en un grupo fijo de células o una célula individual a la vez (más utilizado en la literatura)24,25, los investigadores pueden seguir la evolución del sistema mitocondrial durante varios días en las mismas células individuales. A diferencia de las imágenes en vivo de un solo pozo donde se requieren altos niveles de exposición a la luz, y la selección de muchas células individuales es menos factible, el método propuesto aprovecha la capacidad de este microscopio para obtener imágenes de varias células diferentes en diferentes áreas de un pozo y volver a esas mismas células en varios puntos de tiempo para volver a obtener imágenes de ellas. Gracias a la normalización a una línea de base realizada para cada criterio medido en cada célula de interés, se tiene en cuenta la complejidad del sistema mitocondrial y se investiga el efecto del tratamiento en cada célula en relación con su propia imagen basal. La capacidad del microscopio para llevar a cabo de forma autónoma este tipo de imágenes en hasta 16 pocillos a la vez (imágenes de 5 células por pozo) permite que la heterogeneidad del sistema mitocondrial se tenga debidamente en cuenta durante el análisis sin la variabilidad experimental que viene con la obtención de imágenes de diversas condiciones en diferentes días.
La calidad de los cultivos, los niveles de infecciones virales que expresan el biosensor LV-G1-MitoTimer, el tipo de microscopio y los objetivos, y la selección de células adecuadas son variables críticas que deben permanecer lo más consistentes posible en este protocolo. Las densidades celulares, el tipo de vector y los títulos virales se pueden adaptar de acuerdo con la pregunta. Aunque trabajos previos muestran que la expresión de LV-G1-MitoTimer no tiene consecuencias perjudiciales para la función y dinámica mitocondrial21,22, 26,27,es esencial verificar que la concentración no sea tóxica para las células (por ejemplo, verificando bien el número total de células en control). Como se utiliza un solo plano focal, los astrocitos deben ser: (1) lo más planos posible, (2) aislados de otras células marcadas (para simplificar el análisis en caso de desplazamiento en el plato), y (3) que posean altos niveles de fluorescencia. Como las células en cultivo pueden ser muy variables en morfología, el sistema mitocondrial puede ser altamente heterogéneo. En este contexto, el análisis del ROI (y no de toda la célula) compensa algunas regiones problemáticas, como las regiones perinucleares, y disminuye la variabilidad. Es esencial hacer la línea de base en células relativamente similares y muestrear tantas células como sea posible. En consecuencia, los microscopios de adquisición y análisis de alto contenido son ideales. Durante esta monitorización longitudinal, también es importante no sobreexponer las células a la luz para evitar el blanqueamiento del biosensor.
Este método de imagen no está exento de complejidades, y a lo largo del protocolo, se incluyen varias notas, que tienen en cuenta la solución de problemas realizada durante las pruebas anteriores con el microscopio. Por ejemplo, la elección del recubrimiento de placa utilizado depende del ensayo previsto, pero se han incluido recomendaciones para las opciones más adecuadas para cultivos primarios de astrocitos. Además, la adquisición de imágenes debe realizarse en al menos 5 células por condición debido a la variabilidad intercelular. Más específicamente, algunas células seleccionadas en la imagen basal morirán, algunas se moverán fuera del marco del área de adquisición de imágenes asignada y algunas cambiarán su morfología, lo que hará que las mitocondrias sean muy difíciles de individualizar en el análisis. Las imágenes de muchas células desde el principio aumentan la probabilidad de un tamaño de muestra de células lo suficientemente grande como para analizarlas al final del experimento. Además de los aspectos más complejos de esta técnica de imagen, existen algunas limitaciones absolutas en cuanto a quién puede beneficiarse de este tipo de imágenes y análisis. Para aprovechar al máximo la automatización de la adquisición de imágenes, el microscopio utilizado debe tener un sistema de enfoque automático que pueda manejar la velocidad de los intervalos de tiempo entre las imágenes (es decir, cada 3 s en este protocolo) y pueda enfocarse constantemente en la célula en cuestión antes de tomar cada imagen. Además, sin el software JOBS, que automatiza todo el proceso de adquisición de imágenes, este método se vuelve arduo y potencialmente imposible dependiendo del número de células que se muestren, ya que requeriría encontrar manualmente y obtener imágenes de cada célula nuevamente en el punto de tiempo apropiado. Finalmente, este método de imagen no es inmune al problema del fotoblanqueo. Por esta razón, como con cualquier método de adquisición a largo plazo, es importante elegir marcadores fluorescentes que sean menos susceptibles al fotoblanqueo y adaptar la adquisición de imágenes para evitar este problema tanto como sea posible.
Esta técnica difiere de otras utilizadas actualmente de una manera crucial. A diferencia de otros estudios de lapso de tiempo, esta técnica no requiere imágenes en la misma posición en el pozo todo el tiempo, ni requiere el movimiento manual de la placa para obtener imágenes de otras áreas. Esto permite a los investigadores la capacidad de obtener imágenes de muchas células en muchas condiciones en un período de tiempo de 24 horas. En consecuencia, la capacidad de llevar a cabo estas imágenes y análisis en muchas células en cada pozo proporciona la misma información de la población que se obtendría al estudiar ampliamente un gran grupo de células, al tiempo que proporciona medidas específicas de cada célula fotografiada. Si bien algunas especificidades de este método pueden no aplicarse a otros métodos de adquisición de imágenes (descritos anteriormente), los beneficios superan las complicaciones con el tipo de análisis posible después de la adquisición. Esta técnica permite a los investigadores ver las ramificaciones exactas de varios tratamientos en el sistema mitocondrial y, en consecuencia, en los astrocitos cultivados.
Además, este método es altamente personalizable para muchas preguntas científicas diferentes con respecto al comportamiento y los roles mitocondriales en contextos específicos. Aquí el protocolo descrito se ocupa específicamente de los astrocitos cultivados. Sin embargo, se pueden usar muchos otros tipos de células, y los tratamientos que se pueden probar están limitados solo por las preguntas que se están investigando. Este tipo de imágenes tiene el potencial de avanzar en el conocimiento colectivo y la comprensión del comportamiento mitocondrial, los mecanismos subyacentes que conducen a la disfunción mitocondrial y los efectos de muchas patologías en la dinámica innata presente en diferentes tipos de células.

Los astrocitos son actores críticos en el mantenimiento de la homeostasis cerebral. Son quizás más conocidos por tener funciones estructurales significativas en el cerebro, como parte de la barrera hematoencefálica1 y al apoyar las neuronas y las sinapsis en todo el cerebro2. El apoyo de los astrocitos a las neuronas es tanto estructural3 como metabólico4,5,con astrocitos que promueven la neurogénesis y la sinaptogénesis, al tiempo que proporcionan metabolitos clave como el lactato a las neuronas activas4,6,7. Más allá del papel de soporte estructural, los astrocitos son células activas que participan en la señalización y amortiguación de Ca2+ (incluyendo afluencias mitocondriales espontáneas de Ca2+) 8,9,K+ buffering10,y pueden adaptarse y reaccionar a las necesidades del cerebro en tiempos delesión 11,12 . Al ser células tan dinámicas, los astrocitos tienen requisitos energéticos robustos, que requieren una red mitocondrial eficiente. Estas mitocondrias también tienen un papel crucial en la amortiguación de especies reactivas excesivas de oxígeno (ROS)13. Además de sus funciones individuales o locales de generación de energía y amortiguación de ROS, las mitocondrias funcionan como una red14. En este sentido, mantienen el equilibrio entre las mitocondrias fisionantes y fusionantes, representando mitocondrias nuevas/reducidas y mitocondrias más antiguas/oxidadas, respectivamente15. El estado redox general de una célula se puede medir por el estado redox de la red mitocondrial. En patología, esta es una pieza crítica de información que puede arrojar luz sobre qué células pueden no estar funcionando de manera óptima.
En los últimos años, se han desarrollado muchos sensores para estudiar la dinámica y las funciones de las mitocondrias en las células. Por ejemplo, los sensores que miden el intercambio de energía (ATP), el estado redox (NADH / NAD+,ROS) y la funcionalidad enzimática (cAMP, Ca2 +,Zn2 +)se utilizan actualmente en el estudio de la función mitocondrial16. Entre ellos, MitoTimer permite seguir los cambios en la morfología mitocondrial (tamaño, forma, área de superficie), movilidad (velocidad, desplazamiento) y dinámica (eventos de fusión y fisión), así como la tasa general de recambio mitocondrial y el estado redox. MitoTimer es una proteína fluorescente roja mutante, drFP58317,con una señal mitocondrial de la subunidad VIII de la citocromo c oxidasa humana18,19 para visualizar mitocondrias recién sintetizadas en verde (488 nm) y mitocondrias oxidadas en rojo (555 nm). El uso de la relación de fluorescencia verde (488 nm) y roja (555 nm) permite la evaluación simultánea de mitocondrias individuales, su análisis morfológico, eventos de fusión / fisión e historia del estado redox20,21. Esta propiedad única se puede utilizar para investigar muchas preguntas científicas sobre los roles fisiológicos y patológicos de las mitocondrias y, por lo tanto, es muy prometedora para revelar los mecanismos subyacentes de la dinámica mitocondrial dentro de muchos tipos celulares diferentes.
Recientemente desarrollamos un nuevo vector lentiviral (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, en adelante llamado LV-G1-MitoTimer) para estudiar la dinámica y las funciones de las mitocondrias específicamente en astrocitos in vitro e in vivo22. LV-G1-MitoTimer utiliza una versión truncada del promotor de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) gfaABC1D, con un potenciador B3 (gfaABC1D(B3), en adelante G1) combinado con el sistema de destargeting neuronal miR124T descrito anteriormente23. Permite la expresión exclusiva del biosensor mitocondrial en astrocitos in vitro e in vivo22. Aquí se presentan los diferentes pasos para realizar un cultivo de astrocitos del hipocampo de rata y equiparlos con el biosensor LV-G1-MitoTimer, así como los diferentes pasos de microscopía para seguir el comportamiento de las mitocondrias de astrocitos durante varias horas / días consecutivos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>Plexus SANTE</td>
			<td>PL001213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Plexus SANTE</td>
			<td>PL000142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>Plexus SANTE</td>
			<td>PL000133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>LIFE TECH</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>HAMAMATSU</td>
			<td>ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM)</td>
			<td>THERMOFISHER</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>THERMOFISHER</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>CFI Plan Fluor 100x Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Engines</td>
			<td>LUMENCOR</td>
			<td>SPECTRA X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear-encoded motorized platine</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module</td>
			<td>OKOLAB</td>
			<td>H201-NIKON-TI-S-ER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x liquid</td>
			<td>THERMOFISHER</td>
			<td>20012068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mm</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Rats</td>
			<td>CHARLES RIVERS</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Nikon NIS-HC</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>NIS-Elements HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V8.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup 500 mL</td>
			<td>MERCK MILLIPORE</td>
			<td>10412701</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of mitochondrial system in cultured astrocytes

Si bien se ha prestado mucha atención a las alteraciones mitocondriales a nivel neuronal, la evidencia reciente demuestra que la dinámica y la función mitocondrial en los astrocitos están implicadas en la cognición. Este artículo describe el método para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de cultivos de astrocitos equipados con un biosensor mitocondrial: MitoTimer. MitoTimer es una herramienta poderosa y única para evaluar la dinámica mitocondrial, la movilidad, la morfología, la biogénesis y el estado redox. Aquí se presentan los diferentes procedimientos para el cultivo, la adquisición de imágenes y el posterior análisis mitocondrial.

El cultivo primario de astrocitos infectados con LV-G1-MitoTimer exhibió redes mitocondriales típicas. Antes del tratamiento, los astrocitos que expresaban LV-G1-MitoTimer mostraron el tamaño mitocondrial heterogéneo y varias intensidades de fluorescencia verde/roja(Figura 3, Figura 4y Video 1). El sistema mitocondrial de cultivos de astrocitos que expresan LV-G1-MitoTimer fue monitoreado antes y después de la incubación con H202 (10 μM). Las diferentes características mitocondriales descritas anteriormente se calcularon durante 12 h (cada 3 h) y se normalizaron (célula por célula) a su estado inicial. A nivel morfológico (Figura 3B), los efectos de H2O2 comienzan a ser visibles aproximadamente a las 6 h. De hecho, las mitocondrias estaban fragmentadas (disminución de la longitud, el área de superficie y el factor de elongación). Esta fragmentación es aún más obvia 12 h después del tratamiento. Tenga en cuenta que los diámetros, anchos y esfericidad no se redujeron. En cuanto al estado redox y el recambio(Figura 3C),3 h después del tratamiento con H2O2, la proporción de mitocondrias verdes aumentó en los astrocitos (consecuencia de un rápido aumento de la biogénesis mitocondrial). A las 6 h, la relación verde/rojo volvió a los niveles basales, pero el número de mitocondrias puramente rojas aumentó significativamente desde los niveles basales. Después de 12 h, las consecuencias del tratamiento oxidativo de H2O2 fueron visibles y dieron lugar a un aumento sustancial en la proporción y el número de puntos rojos. En cuanto a la dinámica y movilidad (Figura 3D), 3 h después del tratamiento, todos los criterios se incrementaron transitoriamente. A largo plazo (12 h), las mitocondrias se movieron más lentamente y en distancias más cortas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig01.jpg"> Figura 1: Cultivo de astrocitos que expresan el biosensor LV-G1-MitoTimer. (A) Fotografías confocales de astrocitos que expresan LV-G1-MitoTimer. (B) Selección de fotografías confocales de mitocondrias reducidas (verdes) equilibradas (naranjas) y oxidadas (rojas) con diferentes niveles de fragmentación. (C) Diagrama resumido de los diferentes criterios disponibles para el análisis en un astrocito que expresa LV-G1-MitoTimer. Barra de escala: (A) Panel superior: 50 μm, panel inferior: 10 μm, (B) 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig02.jpg"> Figura 2: Morfología mitocondrial y análisis de ratios. (A) Descripción general del script GA3 para el análisis de la morfología y la proporción mitocondrial individual. (B) Fotografías iniciales de un astrocito que expresa LV-G1-MitoTimer analizadas con el script GA3. (C) Ejemplo de máscaras binarias generadas para el sistema mitocondrial de los astrocitos. Barra de escala: 10 μm (B-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig03.jpg"> Figura 3: Los efectos de H2O2 sobre el sistema mitocondrial de los astrocitos. (A) Fotografías de astrocitos que expresan LV-G1-MitoTimer 1 h antes y 6 h, 24 h después del tratamiento con PBS (CTRL) y 10 μM de H2O2. (B) Gráficos de radar de la morfología mitocondrial, (C) estado redox y recambio, y (D) criterios de movilidad evaluados en astrocitos durante el inicio y 3 h, 6 h y 12 h después del tratamiento con H2O2. SA: Superficie; D: Diámetro; L: Longitud; W: Ancho; R: Redondez; S: Esfericidad; EF: Factor de elongación (=L/W); G/R: Relación rojo/verde individual; Gpuncta: Porcentaje de mitocondrias verdes de puncta; Rpuncta: Porcentaje de mitocondrias de puncta roja; Dis: Desplazamiento; Tr: Longitud de la pista; Sp y SpV: Velocidad y varianza de velocidad; Str: Rectitud. Barra de escala: 20 μm (A) y 2,5 μm (recuadro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig04.jpg"> Figura 4: Fotografías de astrocitos que expresan LV-G1-MitoTimer y muestran una red mitocondrial homogénea y equilibrada durante la línea de base. Barra de escala: 20 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Video 1: Efecto deltratamiento con H2O2 en el sistema mitocondrial de astrocitos cultivados. Mitocondrias astrocíticas antes del tratamiento con H2O2 (línea de base), así como 6 h y 24 h después del tratamiento con H2O2 en comparación con las células de control no tratadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/movie.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Criterios morfológicos</td>
			<td>Gama</td>
			<td colspan="3">Observaciones</td>
		</tr>
<tr>
<td>Superficie (SA)</td>
			<td>0,5–4 μm2
</td>
			<td colspan="3" rowspan="7">Estos criterios informan sobre las características fragmentadas-alargadas de las mitocondrias. Generalmente evolucionan en la misma dirección. Las mitocondrias fragmentadas tendrán un área de superficie, diámetro, longitud y factor de elongación disminuidos, mientras que la redondez, la esfericidad y el ancho pueden no cambiarse o aumentar.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Diámetro (D)</td>
			<td>0,5–1,5 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longitud (L)</td>
			<td>0,5–5 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ancho (W)</td>
			<td>0,5–2 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Redondez (R)</td>
			<td>0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Esfericidad (S)</td>
			<td>0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Factor de elongación (EF = L/W)</td>
			<td>1–10</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Resumen de parámetros seleccionados para la morfología mitocondrial.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Criterios de estado redox</td>
			<td>Gama</td>
			<td colspan="3">Observaciones</td>
		</tr>
<tr>
<td>Relación individual (G/R)</td>
			<td>0–10</td>
			<td colspan="3" rowspan="3">La relación indica el resultado del estado redox. Informa sobre el estado general y la edad de las mitocondrias en la célula. Es esencial considerar que esta proporción es el equilibrio de la biogénesis y la degradación de las mitocondrias y la fisión/fusión de las mitocondrias oxidadas con las mitocondrias reducidas. Por lo tanto, la evaluación del número de puntos verdes y rojos puede ayudar poderosamente a interpretar los resultados.  Las mitocondrias de la punta verde se determinan cuando la intensidad del verde es 10 veces mayor que la del rojo. Las mitocondrias de la puntilla roja se determinan cuando la intensidad del rojo es 10 veces mayor que la del verde. El estado redox de un astrocito es el promedio de todas las proporciones de mitocondrias de esa célula.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Porcentaje de mitocondrias de la puntería verde (Gpuncta)</td>
			<td>0%–100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Porcentaje de mitocondrias de puncta roja (Rpuncta)</td>
			<td>0%–100%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Resumen de los parámetros seleccionados para el estado redox mitocondrial.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Criterios de movilidad</td>
			<td>Gama</td>
			<td colspan="3">Observaciones</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desplazamiento (Dis)</td>
			<td>0–10 μm</td>
			<td colspan="3" rowspan="5">Juntas, estas características informan la dinámica general de motilidad de la red. Las mitocondrias estacionarias muestran un desplazamiento corto y una longitud de pista con una velocidad baja. Por otro lado, las partículas oscilatorias se pueden diferenciar con una diferencia entre la longitud de la pista y el desplazamiento (lo que resulta en una baja rectitud) y una mayor velocidad en comparación con la estática.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longitud de la pista (Tr)</td>
			<td>0–10 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Velocidad y varianza de velocidad (Sp y SpV)</td>
			<td>0–1,5 μm/s ± 0,2 μm/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rectitud</td>
			<td rowspan="2">0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Str = desplazamiento/longitud de la pista)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Resumen de los parámetros seleccionados para la movilidad mitocondrial.
Supplemental Coding File 1: Archivo de script GA3 para el análisis de la morfología mitocondrial individual. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/Mito_Morpho.ga3" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

Este artículo describe el método para la obtención de imágenes mitocondriales de lapso de tiempo de cultivos de astrocitos equipados con el biosensor MitoTimer y el análisis multiparamétrico resultante de la dinámica mitocondrial, la movilidad, la morfología, la biogénesis, el estado redox y el recambio.

Imágenes en vivo del sistema mitocondrial en astrocitos cultivados

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...

Este protocolo maximiza en gran medida el poder de la microscopía como método para rastrear la dinámica mitocondrial dentro de las células individuales durante largos períodos de adquisición. A diferencia del lapso de tiempo en un grupo fijo de células, o en una célula a la vez, la normalización a una línea de base para cada criterio medido en cada célula controla la heterogeneidad entre las células. Con un microscopio equipado con plataforma automatizada y vector viral adaptado, podemos utilizar este protocolo para todo tipo de células.Comience por emplatar de 20, 000 a 25, 000 células por centímetro cuadrado en platos de múltiples pozos y guárdelos a 37 grados centígrados bajo una atmósfera que contenga 5% de dióxido de carbono para el resto del experimento. A los ocho días in vitro, añadir 0,6 pico gramos de antígeno P24 por célula del vector lentiviral que codifica para el biosensor mitocondrial MitoTimer diluido en solución salina tamponada con fosfato. A los 11 días in vitro, realizar dos lavados con PBS estéril precalentado y añadir medio de astrocito fresco sin rojo fenol.Evaluar el sistema mitocondrial astrocítico al menos de tres a cinco días después de las infecciones lentivirales con LV-G1 MitoTimer. Seleccione cinco astrocitos por pozo con una red mitocondrial que exprese niveles suficientes de LV-G1 MitoTimer utilizando un aumento de 40 veces. Tener cuidado de seleccionar astrocitos planos y grandes como sea posible y no ubicados en grupos de células.Luego capture imágenes de fluorescencia utilizando excitación secuencial a 490 nanómetros para el canal verde y 550 nanómetros para el canal rojo con señales fluorescentes verdes y rojas y utilizando un aumento de 150 veces para cada coordenada. Seleccione el primer fotograma para los canales rojo y verde para cada secuencia de imágenes haciendo clic en Procesamiento ND y seleccione el fotograma. A continuación, fusione los canales rojo y verde seleccionando conversiones y fusione el canal.Para corregir el sombreado de imagen, seleccione preprocesamiento y, a continuación, corrección automática de sombreado. Aplique el algoritmo de bola rodante seleccionando preprocesamiento y bola rodante. Para generar máscaras binarias para cada mitocondria, seleccione segmentación y umbral.Elimine los objetos truncados por el borde seleccionando procesamiento binario y tocando el borde. Seleccione la medida y, a continuación, el área del objeto, el diámetro, la longitud, el ancho, la rugosidad, la circularidad o el alargamiento para medir el área de superficie, el diámetro, la longitud, el ancho, la rugosidad, la circularidad o el alargamiento, respectivamente. Componga un grupo con estas medidas y cámbiele el nombre como datos MOFO.A continuación, seleccione la medición y, a continuación, seleccione la intensidad media para medir las intensidades medias verde y roja. Y ratio para medir la ratio rojo por verde. Ahora el compositor agrupa con estas medidas y renombra como datos de proporción.Finalmente, exporte la tabla a un archivo CSV seleccionando referencia y tabla a CSV, y luego guarde el script de análisis GA 3 seleccionando Guardar como.Comience abriendo el módulo de seguimiento en NIS y seleccionando vista, análisis y seguimiento. Haga clic en definir nuevo ROI. Con la herramienta de detección automática, seleccione de 25 a 50 mitocondrias en la primera imagen de la secuencia de imágenes y luego haga clic en rastrear el análisis de ROI detectados automáticamente.Si es necesario, elimine las pistas de ROI incorrectas y exporte la tabla a un archivo CSV. Registre manualmente la transformación de las mediciones antes de procesarlas. Para cada análisis y marco de tiempo, normalice manualmente los datos resultantes por la media obtenida en la adquisición de referencia.A continuación, realice un análisis estadístico utilizando un Nova emparejado de dos vías. El cultivo primario de astrocitos infectados con LV-G1 MitoTimer exhibió redes mitocondriales equilibradas y oxidadas reducidas con diferentes niveles de fragmentación. Antes del tratamiento con peróxido de hidrógeno, los astrocitos que expresaban LV-G1 MitoTimer mostraron un tamaño mitocondrial heterogéneo en varias intensidades de fluorescencia verde y roja.La morfología mitocondrial de los cultivos de astrocitos se fragmentó después de seis horas de incubación con peróxido de hidrógeno. Fue aún más evidente 12 horas después del tratamiento sin sus diámetros con reducción de la esfericidad. En cuanto al estado redox y el recambio, tres horas después de un tratamiento con peróxido de hidrógeno, la proporción de mitocondrias verdes aumentó en los astrocitos.Respecto a la dinámica y movilidad tres horas después del tratamiento. Todos los criterios se incrementaron transitoriamente. Esta técnica es adecuada para muchas preguntas diferentes.Por ejemplo, en el contexto de la enfermedad neurodegenerativa, estamos investigando la toxicidad estrocítica de diferentes moléculas secretadas en el cerebro.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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