Detta protokoll maximerar kraftigt kraften i mikroskopi som en metod för att spåra mitokondriell dynamik inom enskilda celler under långa förvärvsperioder. Till skillnad från tidsfördröjning i en fast grupp celler, eller på en cell i taget, normaliseras till en baslinje för varje uppmätt kriterium i varje cell för heterogeniteten mellan celler. Med ett mikroskop utrustat med automatiserad plattform och viral vektor anpassad kan vi använda detta protokoll för alla typer av celler.
Börja med att plätera 20 000 till 25 000 celler per kvadratcentimeter i flerbrunnrätter och lagra dem på 37 grader celsius under en atmosfär som innehåller 5% koldioxid under resten av experimentet. Vid åtta dagar in vitro, tillsätt 0,6 pico gram P24 antigen per cell av lentiviral vektor kodning för mitokondriell biosensor MitoTimer utspädd i fosfat buffrad koksaltlösning. Vid 11 dagar in vitro, utför två tvättar med förvärmd steril PBS och tillsätt färsk astrocyt medium utan fenolrött.
Utvärdera det astrocytiska mitokondriella systemet minst tre till fem dagar efter lentivirala infektioner med LV-G1 MitoTimer. Välj fem astrocyter per brunn med ett mitokondriellt nätverk som uttrycker tillräckliga nivåer av LV-G1 MitoTimer med en förstoring på 40 gånger. Var noga med att välja astrocyter platt och stor som möjligt och inte placeras i kluster av celler.
Fånga sedan fluorescensbilder med sekventiell excitation på 490 nanometer för den gröna kanalen och 550 nanometer för den röda kanalen med gröna och röda fluorescerande signaler och med en förstoring på 150 gånger för varje koordinat. Välj den första bildrutan för röda och gröna kanaler för varje bildsekvens genom att klicka på ND Processing och välj bildruta. Slå sedan samman de röda och gröna kanalerna genom att välja konverteringar och slå samman kanalen.
Om du vill korrigera bildskuggning väljer du förbearbetning och sedan automatisk skuggningskorrigering. Använd rullbollsalgoritmen genom att välja förbehandling och rullande boll. Om du vill generera binära masker för varje mitokondrion väljer du segmentering och tröskelvärde.
Ta bort alla objekt som trunkeras av kantlinjen genom att välja binär bearbetning och beröringskantlinje. Välj mått och sedan objektområde, EEQ-diameter, längd, bredd, grovhet, cirkularitet eller förlängning för att mäta yta, diameter, längd, bredd, grovhet, cirkularitet respektive förlängning. Skapa en grupp med dessa mått och byt namn på den till MOFO-data.
Välj sedan mätning och välj sedan medelintensitet för att mäta medelvärdet för grön och röd intensitet. Och förhållande för att mäta det röda efter grönt förhållande. Nu är composer group med dessa mätningar och döpa om den till ratiodata.
Exportera slutligen tabellen till en CSV-fil genom att välja referens och tabell till CSV och spara sedan GA 3-analysskriptet genom att välja Spara som.Begin genom att öppna spårningsmodulen i NIS och välja vy, analys och spårning. Klicka på definiera ny ROI. Med det automatiska identifieringsverktyget väljer du 25 till 50 mitokondrier på den första bilden av bildsekvensen och klickar sedan på spår autoupptäckta ROIs-analys.
Om det behövs tar du bort de felaktiga ROI-spåren och exporterar tabellen till en CSV-fil. Logga manuellt omforma mätningarna före bearbetning. För varje analys och tidsram normaliserar du de resulterande uppgifterna manuellt med det medelvärde som erhålls vid referensförvärvet.
Utför sedan statistisk analys med en tvåvägsmatchad en Nova. Primär kultur av astrocyter infekterade med LV-G1 MitoTimer uppvisade minskade balanserade och oxiderade mitokondriell nätverk med olika nivåer av fragmentering. Före väte peroxid behandling visade astrocyter uttrycker LV-G1 MitoTimer heterogena mitokondriell storlek i olika gröna och röda fluorescence intensiteter.
Mitokondriell morfologi av astrocyt kulturer var fragmenterad efter sex timmars inkubation med väte peroxid. det var ännu mer uppenbart 12 timmar efter behandlingen utan deras diametrar med sedan sfäricitet minskning. När det gäller redox tillstånd och omsättning, tre timmar efter en väteperoxid behandling, andelen gröna mitokondrier ökade i astrocyter.
När det gäller dynamik och rörlighet tre timmar efter behandlingen. Alla kriterier höjdes tillfälligt. Denna teknik är lämplig för många olika frågor.
Till exempel, i samband med neurodegenerativ sjukdom, undersöker vi den estrocytiska toxiciteten hos olika molekyler som utsöndras i hjärnan.
