Bu protokol, uzun alım dönemlerinde tek tek hücrelerdeki mitokondriyal dinamikleri izlemek için bir yöntem olarak mikroskopinin gücünü büyük ölçüde en üst düzeye çıkarır. Sabit bir hücre grubunda veya aynı anda bir hücrede zaman atlamalı durumdan farklı olarak, hücreler arasındaki heterojenlik için her hücre denetimlerinde ölçülen her ölçüt için bir taban çizgisine normalleştirme. Otomatize platform ve viral vektör ile donatılmış bir mikroskop ile bu protokolü her tür hücre için kullanabiliriz.
Çok kuyulu tabaklarda santimetrekare başına 20.000 ila 25.000 hücre kaplayarak başlayın ve deneyin geri kalanı için% 5 karbondioksit içeren bir atmosfer altında 37 santigrat derecede saklayın. Sekiz günlük in vitroda, fosfat tamponlu salin ile seyreltilmiş mitokondriyal biyosensör MitoTimer için lentiviral vektör kodlama hücresi başına 0.6 pikao gram P24 antijeni ekleyin. 11 günlük in vitroda, önceden ısıtılmış steril PBS ile iki yıkama yapın ve fenol kırmızısı olmadan taze astrosit ortamı ekleyin.
LV-G1 MitoTimer ile lentiviral enfeksiyonlardan en az üç ila beş gün sonra Astrositik mitokondriyal sistemi değerlendirin. 40 kat büyütme kullanarak yeterli LV-G1 MitoTimer seviyelerini ifade eden bir mitokondriyal ağ ile kuyu başına beş astrosit seçin. Astrositleri mümkün olduğunca düz ve büyük seçmeye özen gösterme ve hücre kümelerinde bulunmama.
Ardından, yeşil kanal için 490 nanometrede sıralı eksize edici ve yeşil ve kırmızı floresan sinyalli kırmızı kanal için 550 nanometre ve her koordinat için 150 kat büyütme kullanarak floresan görüntüleri yakalayın. ND İşleme'ye tıklayarak her görüntü dizisi için kırmızı ve yeşil kanallar için ilk kareyi seçin ve çerçeveyi seçin. Ardından dönüşümleri seçerek kırmızı ve yeşil kanalları birleştirin ve kanalı birleştirin.
Görüntü gölgelendirmeyi düzeltmek için ön işleme'yi ve ardından otomatik gölgelendirme düzeltmesini seçin. Ön işleme ve yuvarlanan topu seçerek yuvarlanan top algoritmasını uygulayın. Her mitokondrion için ikili maskeler oluşturmak için segmentasyon ve eşiği seçin.
İkili işlemeyi seçip kenarlıklara dokunarak kenarlık tarafından kesilen nesneleri kaldırın. Yüzey alanını, çapı, uzunluğu, genişliği, pürüzlülüğü, daireselliği veya uzamayı sırasıyla ölçmek için ölçümü ve ardından nesne alanını, EEQ çapını, uzunluğu, genişliği, pürüzlülüğü, daireselliği veya uzamayı seçin. Bu ölçümlerle bir grup oluşturun ve mofo verisi olarak yeniden adlandırın.
Ardından ölçümü seçin ve sonra ortalama yeşil ve kırmızı yoğunlukları ölçmek için ortalama yoğunluğu seçin. Ve kırmızıyı yeşil oran ile ölçme oranı. Şimdi bu ölçümlerle besteci grubu ve oran verileri olarak yeniden adlandırın.
Son olarak, CSV'ye başvuru ve tablo seçerek tabloyu bir CSV dosyasına dışa aktarın ve ardından NIS'deki izleme modülini açarak ve görünüm, analiz ve izlemeyi seçerek Farklı Kaydet.Begin'i seçerek GA 3 çözümleme komut dosyasını kaydedin. Yeni yatırım getirisi tanımla'ya tıklayın. Otomatik algılama aracıyla, görüntü dizisinin ilk görüntüsünde 25 ila 50 mitokondri seçin ve ardından otomatik algılanan ROI analizini izleyin.
Gerekirse, yanlış yatırım getirisi izlerini silin ve tabloyu bir CSV dosyasına dışa aktarın. İşlemeden önce ölçümleri el ile günlüğe kaydedin. Her analiz ve zaman dilimi için, elde edilen verileri referans alımında elde edilen ortalamaya göre manuel olarak normalleştirin.
Daha sonra nova ile eşleşen iki yönlü bir yol kullanarak istatistiksel analiz yapın. LV-G1 MitoTimer ile enfekte olan astrositlerin birincil kültürü, farklı parçalanma seviyelerine sahip azaltılmış dengeli ve oksitlenmiş mitokondriyal ağlar sergiledi. Hidrojen peroksit tedavisinden önce, LV-G1 MitoTimer'ı ifade eden astrositler çeşitli yeşil ve kırmızı floresan yoğunluklarında heterojen mitokondriyal boyut gösterdi.
Astrosit kültürlerinin mitokondriyal morfolojisi hidrojen peroksit ile altı saatlik inkübasyondan sonra parçalandı. Tedaviden 12 saat sonra küresellik azalmasından bu yana çapları olmadan daha da belirgindi. Redoks durumu ve ciro ile ilgili olarak, hidrojen peroksit tedavisinden üç saat sonra, astrositlerde yeşil mitokondri oranı artmıştır.
Tedaviden üç saat sonra dinamikler ve hareketlilik ile ilgili. Tüm kriterler geçici olarak artırıldı. Bu teknik birçok farklı soru için uygundur.
Örneğin, nörodejeneratif hastalık bağlamında, beyinde salgılanan farklı moleküllerin östrositik toksisitesini araştırıyoruz.
