يقدم هذا البروتوكول نظرة ثاقبة على تكاثر الطحالب وكيفية مراقبة أنواع الطحالب السامة بشكل فعال. يساعد الإجراء على توفير إنذار مبكر بتكاثر الطحالب لحماية المجتمع من الأضرار المرتبطة به. يمكن لتحليل الميتاباركودينج الكشف عن العديد من الأنواع في عينة في وقت واحد ، لكنه يتطلب إجراءات معقدة.
يشرح هذا البروتوكول بصريا كل خطوة للمساعدة في تقليل الأخطاء البشرية أثناء التحليل. وسيبرهن هنري كاميرون من جامعة أنتوفاغاستا على إجراءات الفحص المجهري، وجمع جوناثان فيلوغرون من معهد فنتوستو بيسكيرو، وعينة قبل العلاج من كارين فيرغارا من جامعة لوس لاغوس، وتحليل ميتاباركودينغ الذي أجراه إغناسيو ريلينغ وماركو كامبوس من جامعة لا فرونتيرا. ابدأ بجمع ثلاثة لترات من عينة الماء من نقطة مستهدفة.
تصفية لتر واحد من الماء لتحليل rRNA 16S من خلال الترشيح جنبا إلى جنب لفصل البكتيريا الحية الحرة والمرفقة. بعد ذلك، قم بتصفية لتر واحد آخر من الماء لتحليل الحمض النووي الريبي 18S من خلال ترشيح واحد مع غشاء 0.2 ميكرون. ثم، وذلك باستخدام مقص الجراحية العقيمة، وقطع الغشاء المصفاة في النصف، والتفاف نصف مع رقائق الألومنيوم للتخزين، ومع النصف الآخر المضي قدما لاستخراج الحمض النووي مع طريقة Chelex.
للتحليل المجهري، قم بنقل ملليلتر واحد من عينة الماء إلى شريحة شبكة ملليلتر واحدة باستخدام ماصة. مراقبة العينة تحت المجهر وتسجيل أسماء وكمية أنواع العوالق النباتية. تنظيف ماصة في خزانة غطاء محرك السيارة صفح مع 70٪ الإيثانول، تليها التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
لأول جيل AMPLICON PCR، aliquot 22.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في شريط أنبوب ثمانية تليها 2.5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي، ثم تشغيل دورة PCR الأولى. بعد ذلك، قم بإعداد 100 ملليلتر من هلام TBE agarose بنسبة 2٪ يحتوي على 10 ميكرولترات من وصمة هلام الحمض النووي. بمجرد أن يصبح الجل جاهزا ، قم بتحميل خليط يحتوي على 1.5 ميكرولتر من صبغة تحميل الحمض النووي وأربعة ميكرولترات من منتج PCR وتنفيذ الكهروفورسيس بمعدل 100 فولت لمدة 30 دقيقة.
ثم، صورة هلام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية وتأكيد وجود 500 إلى 600 الفرقة زوج قاعدة. يمكن في بعض الأحيان حل الأمبليكونات المفقودة عن طريق تخفيف العينة إلى 1000 مرة بالماء. بعد ذلك ، استخدم نظام تنظيف الحمض النووي القائم على الخرز المغناطيسي لتنظيف منتجات PCR الأولى ، ثم نقل 20 ميكرولتر من كل منتج PCR أول تنظيف إلى لوحة جديدة من 96 بئرا وختم اللوحة بفيلم Microseal.
تخزين لوحة في ناقص 20 درجة مئوية حتى الخطوة التالية. للفهرسة بواسطة PCR الثاني، بعد تمييع كل مؤشر واحد ومؤشر اثنين من التمهيديات إلى تركيز واحد ميكرومولار مع الماء الصف PCR في ثمانية شرائط PCR أنبوب، ووضع مؤشر التمهيديات واحد في صف أفقي ومؤشر اثنين من التمهيديات في صف عمودي. ثم، وذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات في 2.5 ميكرولتر من مؤشر التمهيدي واحد لكل بئر من لوحة جديدة 96 جيدا.
بعد ذلك، إضافة 12.5 ميكرولتر من صياغة جاهزة بداية ساخنة لكل بئر. ثم، إضافة 2.5 ميكرولتر من مؤشر اثنين التمهيدي و 7.5 ميكرولتر من المنتج PCR الأولى تنقية لكل بئر. بعد خلط عن طريق pipetting صعودا وهبوطا 10 مرات، وتغطية لوحة مع فيلم Microseal وتشغيل دورة PCR الثانية.
بعد اكتمال PCR، ضع شريط شاشة الحمض النووي في محلل الأجزاء. مزيج اثنين من microliters من العازلة عينة في ثلاثة ميكرولتر من amplicon PCR الثانية في شرائط أنبوب ثمانية جديدة وإدراج شرائط في محلل جزء لبدء التحليل. تأكد من أن amplicons PCR الثانية هي تقريبا 613 أزواج قاعدة لكل من الجينات 16S و 18S rRNA.
تنقية منتجات PCR الثانية باستخدام نظام تنظيف الحمض النووي الخرز المغناطيسي، كما هو موضح سابقا. ثم قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف قياس كمي حمض نووي. في لوحة جديدة 200 ميكرولتر 96 بئر، تمييع كل منتج PCR الثاني المنقى مع الماء PCR معقمة إلى أربعة نانومول.
الخطوة التالية فصاعدا، يجب تنفيذ البروتوكول دون توقف. Aliquot ثلاثة ميكرولتر من كل منتج PCR الثانية المخففة في أنبوب جديد عقيم 1.5 ملليلتر لإنشاء مكتبة مجمعة. دائما إبقاء الأنبوب في أربع درجات مئوية.
قبل يوم واحد من التسلسل، قم بإزالة خرطوشة كاشف جاهزة للاستخدام مملوءة مسبقا من ناقص 20 درجة مئوية ووضعها عند أربع درجات مئوية للذوبان. في يوم التسلسل، ضع كتلة حرارية مناسبة لأنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر إلى 96 درجة مئوية ووضع حاجز التهجين على الجليد. ثم، تمييع هيدروكسيد الصوديوم من الدرجة الجزيئية بالماء وتمييع مكتبة التحكم الجاهزة للاستخدام مع مخزن TE المؤقت.
امزج 16 ميكرولتر من مكتبة العينات الأربعة نانومول أو المجمعة مع أربعة ميكرولترات من مكتبة التحكم في أنبوب جديد يحمل علامة واحدة. ثم، مزيج 10 ميكرولتر من العينة من أنبوب واحد مع 10 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم في أنبوب جديد وصفت بأنها اثنين. بعد الدوامة والدوران القصير ، احتضن الأنبوب الثاني في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، ثم أضف 980 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين.
بعد ذلك ، في أنبوب جديد يوصف بأنه ثلاثة ، اخلط 260 ميكرولتر من العينة من الأنبوب الثاني مع 390 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين. بعد خلط المحتويات عن طريق عكس الأنبوب ، احتضنه عند 96 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، يليه حضانة على الجليد لمدة دقيقتين. بعد ذلك، قم بإزالة الخرطوشة من الثلاجة وإعداد ورقة العينة للتسلسل مع كل فهرس واحد وفهرس محولين.
بعد إزالة خلية التدفق من مجموعة MiSeq V3 ، قم بتنظيف خلية التدفق برفق باستخدام ماء PCR الجزيئي العقيم. قم بتحميل الحجم الكامل للأنبوب ثلاثة في الخرطوشة. ثم، في برنامج تشغيل الأداة، حدد التسلسل واتبع التعليمات لإدراج خلية التدفق، المخزن المؤقت للأدماج، والخرطوشة.
وأخيرا، قم بتحميل ورقة العينة واضغط تشغيل لبدء رد الفعل. يستغرق هذا التسلسل ثلاثة إلى خمسة أيام. 18S rRNA metabarcoding تحليل لتحديد أنواع الطحالب الموجودة في مياه البحر التي تم جمعها من ميتري بويرتو مونت، تشيلي في فبراير 19، 2019، أسفرت عن 13، 750 يقرأ، مع أكثر من 30 نوعا من الطحالب.
كان نوع نافيكولا هو الغالغو المهيمن مع وفرة نسبية قدرها 70.73٪ أيضا ، لوحظ وفرة كافية لأنواع ميكروموناس وتشايتوسيروس وسكريبسيلا وبروسنتروم. الأنواع Pseudochattonella، واحدة من التسبب الرئيسي في تزهر الطحالب الضارة التشيلية، لديها وفرة 0.52٪. بما يتفق مع التحليل الجيني 18S rRNA ، أظهرت الملاحظة المجهرية أن نافيكولا هي المهيمنة وبروسنتروم كنوع ثانوي.
12.6٪ من خلايا العوالق النباتية الصغيرة التي لا يمكن التعرف عليها المسجلة عن طريق المجهر يمكن أن تكون ميكروموناس، وفقا لنتائج 18S rRNA. 16S rRNA metabarcoding تحليل لتحديد الأنواع البكتيرية في عينة المياه نفسها أظهرت 31758 يقرأ مع أكثر من 30 نوعا من البكتيريا. وكان الأنواع البكتيرية الحية الحرة المهيمنة Amylibacter، مع وفرة نسبية من 20.02٪، تليها كلاديلا في 13.53٪، وAlgiphilus في 7.06٪الوفرة النسبية لنوعين من الطحالب السامة، الكسندريوم وبسودوشاتونيلا، يتم رسمها في الوقت المناسب سبب للعثور على نمط نمو فريد من نوعه.
يتم رسم الوفرة النسبية لجميع الجنس البكتيري في الأوامر التي تم اكتشافها من مياه البحر على مدى خمسة أشهر والوقت الناجم عن تحليل التغير السكاني لبعض الكائنات الحية. من المهم أن تكون نظيفا للغاية. يجب تجنب تلوث العينة باستخدام مسح الكحول أو ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو الاحتضان التلقائي للمواد.
وينبغي عدم إعادة استخدام الحلول المخففة وينبغي دائما أن توج أنابيب. يجب إقران الكشف عن الطحالب عن طريق التنظير المجهري. ويمكن تأكيد الأنواع المهيمنة عن طريق المجهر ضمان أي خطأ بشري خلال عمليات ميتاباركودينج.
وتضر تكاثر الطحالب الضارة بالنظام الإيكولوجي البحري والاقتصاد الساحلي. في تشيلي، تزهر الطحالب تقتل سمك السلمون الزراعي، مما يضر بزراعة أغوا. هذا التحليل metabarcoding سيزيد من كفاءة تحذيرات ازهر في شيلي.
