Dit protocol geeft inzicht in algenbloei en hoe toxische algensoorten effectief kunnen worden gemonitord. De procedure helpt een vroege waarschuwing te geven voor algenbloei om de gemeenschap te beschermen tegen bijbehorende schade. Metabarcoding-analyse kan veel soorten tegelijk in een monster detecteren, maar het vereist gecompliceerde procedures.
Dit protocol legt elke stap visueel uit om menselijke fouten tijdens de analyse te minimaliseren. De microscopieprocedures zullen worden gedemonstreerd door Henry Cameron van de Antofagasta University, monsterverzameling door Jonathan Vilugron van Het Instituto de Fomento Pesquero, monstervoorbehandeling door Karen Vergara van los Lagos University en de metabarcodinganalyse door Ignacio Rilling en Marco Campos van La Frontera University. Begin met het verzamelen van drie liter watermonster van een doelplek.
Filter een liter van het water voor 16S rRNA-analyse door middel van een tandemfiltratie om de vrij levende en aangehechte bacteriën te scheiden. Filter vervolgens nog een liter water voor 18S rRNA-analyse door een enkele filtratie met een membraan van 0,2 micron. Knip vervolgens met behulp van een steriele chirurgische schaar het gefilterde membraan doormidden, wikkel de ene helft met aluminiumfolie voor opslag en ga met de andere helft verder met DNA-extractie met de Chelex-methode.
Breng voor microscopische analyse één milliliter van het watermonster over op een roosterglijbaan van één milliliter met behulp van een pipet. Observeer het monster onder een microscoop en noteer de namen en hoeveelheid van de fytoplanktonsoorten. Reinig pipetten in de laminaire kapkast met 70% ethanol, gevolgd door UV-blootstelling gedurende 30 minuten.
Voor de eerste PCR-amplicongeneratie wordt 22,5 microliter van de mastermix in een achtbuisstrip gevolgd door 2,5 microliter van het DNA-monster en vervolgens de eerste PCR-cyclus uitgevoerd. Bereid vervolgens 100 milliliter van een 2% agarose TBE-gel met 10 microliter van een nucleïnezuurgelvlek. Zodra de gel klaar is, laadt u een mengsel met 1,5 microliter van een DNA-ladende kleurstof en vier microliter van het PCR-product en voert u elektroforese uit op 100 volt gedurende 30 minuten.
Stel vervolgens de gel onder UV-licht af en bevestig de aanwezigheid van een band van 500 tot 600 basisparen. Ontbrekende amplicons kunnen soms worden opgelost door het monster met water tot 1.000 keer te verdunnen. Gebruik vervolgens een dna-opschoningssysteem op basis van magnetische kralen om de eerste PCR-producten te reinigen, breng vervolgens 20 microliter van elk gereinigd eerste PCR-product over naar een nieuwe 96-well plaat en verzegel de plaat met een Microseal-film.
Bewaar het bord bij min 20 graden Celsius tot de volgende stap. Voor indexatie door tweede PCR, na verdunning van alle index één en index twee primers tot een één micromolaire concentratie met PCR-kwaliteit water in acht buis PCR-strips, plaats de index één primers in een horizontale rij en indexeer twee primers in een verticale rij. Gebruik vervolgens een meerkanaalspipet met een index van 2,5 microliter één primer voor elke put van een nieuwe 96-putplaat.
Voeg vervolgens 12,5 microliter van een hete startklare formulering toe aan elke put. Voeg vervolgens 2,5 microliter index twee primer en 7,5 microliter van het gezuiverde eerste PCR-product toe aan elke put. Na het mengen door 10 keer op en neer te pipetteren, bedek je de plaat met een Microseal-film en voer je de tweede PCR-cyclus uit.
Nadat de PCR is voltooid, plaatst u de DNA-schermtape in een fragmentanalysator. Meng twee microliter monsterbuffer in drie microliter van het tweede PCR-amplicon in nieuwe acht buisstrips en plaats de strips in de fragmentanalysator om de analyse te starten. Zorg ervoor dat de tweede PCR-amplicons ongeveer 613 basenparen zijn voor zowel 16S- als 18S-rRNA-genen.
Zuiver de tweede PCR-producten met behulp van een DNA-opruimsysteem met magnetische kralen, zoals eerder is aangetoond. Meet vervolgens hun DNA-concentratie met behulp van een nucleïnezuurkwantificeringsspectrofotometer. Verdun in een nieuwe 200 microliter 96-well plaat elk gezuiverd tweede PCR-product met steriel PCR-water tot vier nanomol.
De volgende stap verder moet het protocol worden uitgevoerd zonder te stoppen. Aliquot drie microliter van elk verdund tweede PCR-product in een nieuwe steriele buis van 1,5 milliliter om een gepoolde bibliotheek te creëren. Houd de buis altijd op vier graden Celsius.
Verwijder een dag voor de sequencing een voorgevulde kant-en-klare reagenspatroon van min 20 graden Celsius en plaats deze op vier graden Celsius om te ontdooien. Stel op de dag van de sequencing een warmteblok in dat geschikt is voor centrifugebuizen van 1,5 milliliter tot 96 graden Celsius en plaats de hybridisatiebuffer op ijs. Verdun vervolgens natriumhydroxide van moleculaire kwaliteit met water en verdun een kant-en-klare controlebibliotheek met TE-buffer.
Meng 16 microliter van de vier nanomol of gepoolde monsterbibliotheek met vier microliter van de controlebibliotheek in een nieuwe buis die als één is gelabeld. Meng vervolgens 10 microliter van het monster uit buis één met 10 microliter natriumhydroxide in een nieuwe buis met het label twee. Na vortexing en een korte spin, incubeer buis twee bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten en voeg vervolgens 980 microliter hybridisatiebuffer toe.
Meng vervolgens in een nieuwe buis met het label drie 260 microliter van het monster uit buis twee met 390 microliter hybridisatiebuffer. Nadat u de inhoud hebt gemengd door de buis om te keren, incubeert u deze gedurende twee minuten bij 96 graden Celsius, gevolgd door incubatie op ijs gedurende twee minuten. Verwijder vervolgens de cartridge uit de koelkast en stel het monsterblad in voor sequencing met elke bijbehorende index één en index twee adapters.
Nadat u de stroomcel uit de MiSeq V3-kit hebt verwijderd, reinigt u de stroomcel voorzichtig met steriel PCR-water van moleculaire kwaliteit. Laad het volledige volume van buis drie in de patroon. Selecteer vervolgens in de instrumentbewerkingssoftware sequencing en volg de instructies om de stroomcel, de incorporatiebuffer en de patroon in te voegen.
Laad ten slotte het voorbeeldblad en druk op Uitvoeren om de reactie te starten. Deze reeks duurt drie tot vijf dagen. 18S rRNA metabarcoding analyse om algensoorten te identificeren die aanwezig zijn in zeewater verzameld uit Metri Puerto Montt, Chili op 19 februari 2019, leverde 13.750 lezingen op, met meer dan 30 algensoorten.
De Navicula-soort was de dominante algo met een relatieve abundantie van 70,73% Ook werd voldoende abundantie waargenomen voor Micromonas, Chaetoceros, Scrippsiella en Prorocentrum-soorten. De Pseudochattonella-soort, een van de belangrijkste veroorzakers van Chileense schadelijke algenbloei, heeft een abundantie van 0,52%. In overeenstemming met de 18S rRNA-genanalyse toonde microscopische observatie Navicula als de dominante en Prorocentrum als een minder belangrijke soort.
De 12,6% van de kleine, niet-identificeerbare fytoplanktoncellen die door microscopie worden geregistreerd, zou Micromonas kunnen zijn, volgens de 18S rRNA-resultaten. 16S rRNA metabarcoding analyse om bacteriesoorten in hetzelfde watermonster te identificeren toonde 31. 758 lezingen met meer dan 30 bacteriesoorten. De dominante vrijlevende bacteriesoort was Amylibacter, met een relatieve abundantie van 20,02%, gevolgd door Cladella met 13,53% en Algiphilus met 7,06%De relatieve abundantie van twee giftige algensoorten, Alexandrium en Pseudochattonella, is uitgezet in de tijd om een uniek groeipatroon te vinden.
De relatieve abundantie van alle bacteriële geslachten in orders gedetecteerd uit het zeewater gedurende vijf maanden wordt uitgezet en de tijd wordt veroorzaakt om de populatieverandering van bepaalde organismen te analyseren. Het is cruciaal om extra schoon te zijn. Monsterverontreiniging moet worden vermeden met behulp van een alcoholdoekje, UV-licht of autoclaveren van het materiaal.
Verdunde oplossingen mogen niet worden hergebruikt en buizen moeten altijd worden afgedekt. Algendetectie door metabarcoding moet gepaard gaan met microscopie. De dominante soort kan worden bevestigd door microscopie, zodat er geen menselijke fouten zijn tijdens metabarcodingprocessen.
Schadelijke algenbloei beschadigt het mariene ecosysteem en de kusteconomie. In Chili doden algenbloei gekweekte zalmsoorten en beschadigen ze aguaculturen. Deze metabarcoding-analyse zal de efficiëntie van bloeiwaarschuwingen in Chili verhogen.