Denne protokollen presenterer innsikt i algeoppblomstringer og hvordan man overvåker giftige algearter effektivt. Prosedyren bidrar til å gi en tidlig advarsel om algeoppblomstringer for å beskytte samfunnet mot tilknyttede skader. Metabarkodingsanalyse kan oppdage mange arter i en prøve samtidig, men det krever kompliserte prosedyrer.
Denne protokollen forklarer visuelt hvert trinn for å minimere menneskelige feil under analysen. Mikroskopiprosedyrene vil bli demonstrert av Henry Cameron fra Antofagasta University, prøvesamling av Jonathan Vilugron fra Instituto de Fomento Pesquero, prøveforbehandling av Karen Vergara fra Los Lagos University, og metabarkodingsanalysen av Ignacio Rilling og Marco Campos fra La Frontera University. Begynn med å samle tre liter vannprøve fra et målsted.
Filtrer en liter av vannet for 16S rRNA-analyse gjennom en tandemfiltrering for å skille de frie levende og vedlagte bakteriene. Deretter filtrerer du en annen liter vann for 18S rRNA-analyse gjennom en enkelt filtrering med en 0,2 mikronmembran. Deretter, ved hjelp av steril kirurgisk saks, kutt den filtrerte membranen i halvparten, pakk den ene halvdelen med aluminiumsfolie for lagring, og med den andre halvparten fortsett til DNA-ekstraksjon med Chelex-metoden.
For mikroskopisk analyse, overfør en milliliter av vannprøven til en milliliter rutenettsklie ved hjelp av en pipette. Vær oppmerksom på prøven under et mikroskop og registrer navnene og mengden av planteplanktonartene. Rengjør pipetter i laminært hetteskap med 70% etanol, etterfulgt av UV-eksponering i 30 minutter.
For den første PCR-amplikongenerasjonen blander aliquot 22,5 mikrolitere av masterblandingen i en åtterørs stripe etterfulgt av 2,5 mikrolitere av DNA-prøven, og kjører deretter den første PCR-syklusen. Deretter forbereder du 100 milliliter av en 2% agarose TBE gel som inneholder 10 mikroliter av en nukleinsyregelflekk. Når gelen er klar, last en blanding som inneholder 1,5 mikroliter av et DNA-lastefargestoff og fire mikroliter av PCR-produktet og utfør elektroforese ved 100 volt i 30 minutter.
Deretter kan du bilde gelen under UV-lys og bekrefte tilstedeværelsen av et 500 til 600 baseparbånd. Manglende amlikoner kan noen ganger løses ved å fortynne prøven til 1000 ganger med vann. Deretter bruker du et magnetisk perlebasert DNA-oppryddingssystem for å rengjøre de første PCR-produktene, og overfør deretter 20 mikroliter av hvert renset første PCR-produkt til en ny 96-brønnsplate og forsegle platen med en mikrosealfilm.
Oppbevar platen på minus 20 grader Celsius til neste trinn. For indeksering med andre PCR, etter å ha fortynnet alle indeks en og indeks to primere til en mikromolar konsentrasjon med PCR klasse vann i åtte rør PCR strimler, plassere indeksen en primers i en horisontal rad og indeksere to primere i en vertikal rad. Deretter bruker du en flerkanals pipette ved 2,5 mikroliter indeks en primer til hver brønn av en ny 96-brønns plate.
Deretter legger du til 12,5 mikroliter av en varm startklar formulering til hver brønn. Tilsett deretter 2,5 mikroliter indeks to primer og 7,5 mikroliter av det rensede første PCR-produktet til hver brønn. Etter blanding ved pipettering opp og ned 10 ganger, dekk platen med en Microseal-film og kjør den andre PCR-syklusen.
Når PCR er fullført, plasserer du DNA-skjermbåndet i en fragmentanalysator. Bland to mikroliter prøvebuffer i tre mikroliter av den andre PCR-amlikonen i nye åtte rørstrimler og sett strimlene inn i fragmentanalysatoren for å starte analysen. Forsikre deg om at de andre PCR-amlikonene er omtrent 613 basispar for både 16S- og 18S rRNA-gener.
Rens de andre PCR-produktene ved hjelp av et magnetisk perler DNA-oppryddingssystem, som vist tidligere. Mål deretter DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer for nukleinsyre. I en ny 200 mikroliter 96-brønns plate, fortynn hvert renset andre PCR-produkt med sterilt PCR-vann til fire nanomoler.
Deretter må protokollen utføres uten å stoppe. Aliquot tre mikroliter av hver fortynnet andre PCR produkt i en ny steril 1,5 milliliter rør for å skape et samlet bibliotek. Hold alltid røret på fire grader Celsius.
En dag før sekvensering, fjern en forhåndsfylt reagenspatron klar til bruk fra minus 20 grader Celsius og legg den på fire grader Celsius for opptining. På sekvenseringsdagen setter du en varmeblokk som passer for 1,5 milliliter sentrifugerør til 96 grader Celsius og plasserer hybridiseringsbufferen på is. Deretter fortynner du natriumhydroksid av molekylær klasse med vann og fortynner et kontrollbibliotek som er klart til bruk med TE-buffer.
Bland 16 mikroliter av de fire nanomole eller samlet prøvebibliotek med fire mikroliter av kontrollbiblioteket i et nytt rør merket som ett. Bland deretter 10 mikroliter av prøven fra rør en med 10 mikroliter natriumhydroksid i et nytt rør merket som to. Etter virveling og et kort spinn, inkuber rør to ved romtemperatur i fem minutter, legg deretter til 980 mikroliter hybridiseringsbuffer.
Deretter blander du 260 mikrolitere av prøven fra rør to med 390 mikroliter hybridiseringsbuffer i et nytt rør merket som tre. Etter å ha blandet innholdet ved å invertere røret, inkuber det ved 96 grader Celsius i to minutter, etterfulgt av inkubasjon på is i to minutter. Deretter fjerner du patronen fra kjøleskapet og setter opp prøvearket for sekvensering med hver tilsvarende indeks en og indekserer to adaptere.
Etter å ha fjernet strømningscellen fra MiSeq V3-settet, rengjør strømningscellen forsiktig med sterilt PCR-vann av molekylær klasse. Legg hele volumet på rør tre i patronen. Deretter velger du sekvensering i programvaren for instrumentdrift og følger instruksjonene for å sette inn strømningscelle, inkorporeringsbuffer og patron.
Til slutt laster du inn prøvearket og trykker kjør for å starte reaksjonen. Dette sekvensløpet tar tre til fem dager. 18S rRNA metabarkodingsanalyse for å identifisere algearter tilstede i sjøvann samlet inn fra Metri Puerto Montt, Chile 19.
Navicula-arten var den dominerende algoen med en relativ overflod på 70,73%Også tilstrekkelig overflod ble observert for Mikromonas, Chaetoceros, Scrippsiella og Prorocentrum arter. Pseudochattonella-arten, en av de viktigste årsakssammenhengene til chilenske skadelige algeoppblomstringer, har en overflod på 0,52%. I samsvar med 18S rRNA genanalyse viste mikroskopisk observasjon Navicula som dominerende og Prorocentrum som en mindre art.
De 12,6% av små, uidentifiserbare planteplanktonceller registrert ved mikroskopi kan være Micromonas, ifølge 18S rRNA-resultatene. 16S rRNA metabarkodingsanalyse for å identifisere bakteriearter i samme vannprøve viste 31 758 lesninger med over 30 bakteriearter. Den dominerende frie levende bakterielle arten var Amylibacter, med en relativ overflod på 20,02%etterfulgt av Cladella på 13,53% og Algiphilus på 7,06%Den relative overfloden av to giftige algearter, Alexandrium og Pseudochattonella, er plottet i tide for å finne et unikt vekstmønster.
Den relative overfloden av alle bakterielle slekter i ordrer oppdaget fra sjøvannet over fem måneder er plottet og tid forårsaket av å analysere befolkningsendringen av visse organismer. Det er viktig å være ekstra ren. Prøvekontaminering bør unngås ved hjelp av en alkoholserviett, UV-lys eller autoklavering av materialet.
Fortynnede oppløsninger skal ikke gjenbrukes og rør skal alltid kappes. Algedeteksjon ved metabarkoding må pares med mikroskopi. Den dominerende arten kan bekreftes ved mikroskopi som sikrer ingen menneskelig feil under metabarkodingsprosesser.
Skadelige algeoppblomstringer skader det marine økosystemet og kystøkonomien. I Chile dreper algeoppblomstringer oppdrettslaks, skadelige aguakulturer. Denne metabarkodingsanalysen vil øke effektiviteten av blomsteradvarsler i Chile.