डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक पर ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि की लाइव-सेल इमेजिंग

यह प्रोटोकॉल प्रतिलेखन घटनाओं का निरीक्षण और पता लगाने की अनुमति देता है और जीन के चल रहे प्रतिलेखन पर डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के प्रभावों के बारे में अंतर्दृष्टि देता है। तकनीक का मुख्य लाभ एक घंटे या उससे अधिक की कुल अवधि में सेकंड के समय अंतराल पर एकल कोशिकाओं में व्यक्तिगत रूप से लेबल किए गए आरएनए टेपों का अवलोकन है। यह विधि प्रतिलेखन और सेलुलर प्रक्रियाओं के बीच क्रॉसस्टॉक की जांच करने के लिए डीएनए क्षति प्रतिक्रिया में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, जैसे कि डीएनए प्रतिकृति और डीएनए घाव।

हमारी सलाह डॉक्सीसाइक्लिन का उपयोग करके कोशिकाओं का निरीक्षण करना और प्रतिलेखन साइट का पता लगाने और आरएनए अणुओं को लेबल करने के लिए अंशांकन माप करने के लिए है। एक 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में, समाधान ए तैयार करें जिसमें कम सीरम एमईएम प्लाज्मा डीएनए के 150 माइक्रोलीटर और अभिकर्मक सहायक अभिकर्मक में डीएनए के प्रति माइक्रोलीटर 2.5 माइक्रोग्राम शामिल हैं। समानांतर में, एक लिपिड-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक में डीएनए के 150 माइक्रोलीटर और डीएनए के प्रति माइक्रोलीटर 1.5 माइक्रोग्राम युक्त समाधान बी तैयार करें।

पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर दोनों समाधानों को इनक्यूबेट करें, फिर धीरे से समाधान बी में समाधान ए जोड़ें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए, प्रत्येक डिश में मिश्रित समाधान ए और बी ड्रॉपवाइज के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे धीरे से वितरित करें। ग्लास बॉटम डिश को 100 मिलीमीटर मानक सेल कल्चर डिश के अंदर स्टोर करें और इसे 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक ह्यूमिडिफाइड वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

फिनोल लाल के बिना HEPES के साथ DMEM के 200 माइक्रोलीटर के साथ 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें और 10% लकड़ी का कोयला-छीन भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, फिर टीए जोड़ें। माइक्रोस्कोपी अवलोकन शुरू करने से लगभग एक घंटे पहले, विकास माध्यम में डॉक्सीसाइक्लिन जोड़कर रिपोर्टर जीन के प्रतिलेखन को प्रेरित करें और 200 माइक्रोलीटर माइक्रोपिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग करके धीरे-धीरे मिश्रण करें। अवलोकन शुरू करने से कम से कम 30 मिनट पहले माइक्रोस्कोप में कोशिकाओं को परिवहन करें और कक्ष के पहले से गर्म बड़े माइक्रोस्कोप इनक्यूबेशन अंदर कोशिकाओं के साथ 100 मिलीमीटर पकवान रखें। इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए बड़े माइक्रोस्कोप पर्यावरण कक्ष के अंदर पूर्व-पतला टीए के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें।

ग्लास बॉटम डिश के ढक्कन को एक ढक्कन के साथ बदलें जिसमें एक ड्रिल्ड तीन मिलीमीटर व्यास का छेद है। माइक्रोस्कोप नियंत्रण कक्ष में 100X तेल विसर्जन उद्देश्य का चयन करें और उद्देश्य के लिए विसर्जन तेल की एक बूंद लागू होते हैं। कक्ष के माइक्रोस्कोप चरण के अंदर कोशिकाओं के साथ ग्लास बॉटम डिश इनक्यूबेशन सेट करें और इसे जगह में लॉक करें, फिर स्टेज इनक्यूबेटर के ढक्कन और माइक्रोस्कोप हाउसिंग के सभी दरवाजे बंद कर दें।

माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग और नियंत्रण सॉफ़्टवेयर शुरू करें, फोकस नियंत्रण विंडो खोलें और स्कोप फलक पर क्लिक करें। उत्सर्जन चयन फलक में, आंख द्वारा प्रत्यक्ष नमूना अवलोकन के लिए ओकुलर बीम पथ सेट करने के लिए 100% आंख बॉक्स पर क्लिक करें। फ़िल्टर सेट मेनू में, आई फ़िल्टर सेट पर स्विच करें और ब्राइटफ़ील्ड पर क्लिक करें, फिर खुले ब्राइटफ़ील्ड बटन दबाएँ.

जब तक तेल कांच को छूता है तब तक माइक्रोस्कोप उद्देश्य को कांच के नीचे पकवान की ओर ले जाएं। ओकुलर के माध्यम से देखें और मैन्युअल रूप से कोशिकाओं के विमान पर ध्यान केंद्रित करें, फिर खुले ब्राइटफील्ड बटन को बंद कर दें। प्रयोगात्मक टिप्पणियों को शुरू करने से पहले कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए छोड़ दें ताकि उन्हें पर्यावरणीय परिस्थितियों के अनुकूल होने की अनुमति मिल सके और तापमान ग्रेडिएंट के कारण इमेजिंग के दौरान फोकल बहाव को रोका जा सके।

कमरे के तापमान पर एक 200 माइक्रोलीटर माइक्रोपिपेट और 200 माइक्रोलीटर फ़िल्टर युक्तियाँ सेट करें। माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ़्टवेयर की फ़ोकस नियंत्रण विंडो में, लेजर तीव्रता को 5% पर सेट करें और एक्सपोज़र समय के लिए 50 मिलीसेकंड का मान दर्ज करें। तीन-आयामी टाइमलैप्स की स्वचालित छवि अधिग्रहण करने के लिए सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए कैप्चर विंडो खोलें।

3 डी कैप्चर अधिग्रहण प्रकार का चयन करें और 0.4 माइक्रोमीटर द्वारा अलग किए गए 12 से 16 ऑप्टिकल स्लाइस सेट करें। वर्तमान के आसपास की श्रेणी के चेकबॉक्स पर टिक करें और कैप्चर करने के बाद वर्तमान स्थिति में वापस आ जाएं। टाइमलैप्स कैप्चर फलक में, समय बिंदुओं की संख्या के लिए 120 और अंतराल के लिए 30 सेकंड का मान दर्ज करें.

पाठ पांडुलिपि में उल्लिखित के रूप में transected फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल के अनुसार confocal फ़िल्टर सेट का चयन करें और 50 मिलीसेकंड के लिए प्रत्येक चैनल के लिए जोखिम समय सेट करें। फ़ोकस विंडो में चयनित 5% के मान का उपयोग करने के लिए लेजर पावर के लिए सेटिंग वर्तमान का उपयोग करें. फ़ोकस नियंत्रण विंडो में, कैमरा फलक पर जाएँ, स्केल छवि प्रदर्शन नियंत्रण का चयन करें और प्रदर्शित की जाने वाली छवि तीव्रता की एक निश्चित श्रृंखला सेट करने के लिए मैन्युअल बटन चुनें.

डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के प्रेरण पर प्रतिलेखन साइटों के 3 डी टाइमलैप्स इमेजिंग के लिए कोशिकाओं का चयन करें। कक्षों को स्क्रीन करें और पाठ की चर्चा में वर्णित शर्तों के अनुसार दृश्य के तीन फ़ील्ड का चयन करें. Z-स्टैक के मध्य तल में प्रतिलेखन साइट के साथ दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में पहले स्थित प्रत्येक चयनित कक्ष पर ध्यान केंद्रित करें।

सेट बिंदु पर क्लिक करके फ़ोकस नियंत्रण विंडो के XY प्लेन में प्रत्येक XYZ स्थिति को चिह्नित करें. कोशिकाओं के लिए पूर्व-पतला टीए के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और कैप्चर विंडो पर प्रारंभ पर क्लिक करके 3 डी समय श्रृंखला इमेजिंग शुरू करें। माइक्रोस्कोप नियंत्रण कंप्यूटर हार्ड ड्राइव पर माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ़्टवेयर डेटा स्वरूप में इमेजिंग डेटा सहेजें।

माइक्रोस्कोपी छवि अधिग्रहण शुरू करने से एक घंटे पहले कोशिकाओं के विकास माध्यम में डॉक्सीसाइक्लिन के प्रति मिलीलीटर 0.5 माइक्रोग्राम जोड़ें। कक्ष के माइक्रोस्कोप चरण के अंदर कांच के नीचे डिश को माउंट इनक्यूबेशन और छवि अधिग्रहण तैयार करें जैसा कि पहले दिखाया गया था। पहले की तरह ही लेजर तीव्रता और एक्सपोजर सेटिंग्स का उपयोग करें।

2D समय श्रृंखला के लिए कैप्चर सेटिंग्स सेट करें और टाइमलैप्स कैप्चर पैनल में 500 मिलीसेकंड के अंतराल पर 120 समय बिंदु सेट करें. कई सौ एकल प्रतिलेख टीएफआई माप की गिनती करने के लिए डेटासेट उत्पन्न करने के लिए कई पदों से अंशांकन समय श्रृंखला के दर्जनों प्राप्त करें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एक ग्राफ प्राप्त किया जाता है जो घंटों तक की अवधि में सेकंड के अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ समय के साथ फ्लोरोसेंटली-लेबल रिपोर्टर जीन टेपों की संख्या प्रदर्शित करता है।

नवजात टेपों पर हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन अणुओं के साथ लेबल किए गए एमएस 2 कोट प्रोटीन के संचय द्वारा लेबल किए गए एक प्रोम रिपोर्टर जीन ट्रांसक्रिप्शन साइट के टीएफआई मूल्यों का समय पाठ्यक्रम यहां दिखाया गया है। रिपोर्टर जीन में एक एकल डीएसबी का प्रेरण चल रहे रिपोर्टर जीन प्रतिलेखन पर इसके प्रभाव का अध्ययन करना संभव बनाता है और डीएसबी साइट से उभरने वाली प्रतिलेखन घटनाओं की निगरानी, अर्थात् ब्रेक-प्रेरित प्रतिलेखन। टीए के अलावा और एक DSB के प्रेरण के बारे में 11 मिनट है कि 60 मिनट तक बहाल नहीं किया जाता है के बाद PROM रिपोर्टर जीन प्रतिलेखन के दमन की ओर जाता है.

PP7-RFP सिग्नल की पूरी वसूली ब्रेक-प्रेरित प्रतिलेखन दीक्षा दिखाती है। EXON 2 एंटीसेंस रिपोर्टर जीन प्रमोटर-संचालित ट्रांसक्रिप्शन समाप्ति को दिखाता है, जिसे तब एंटीसेंस ब्रेक-प्रेरित प्रतिलेखन द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, जैसा कि एंटीसेंस एमएस 2 स्टेम लूप अनुक्रमों से उत्पन्न आरएनए के लिए लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन बाध्यकारी के साथ लेबल किए गए एमएस 2 कोट प्रोटीन के संचय से पता चला है। इमेजिंग के लिए कोशिकाओं का चयन, प्रत्येक XY स्थिति पर लेबल किए गए प्रतिलेखन साइट की जेड स्थिति को समायोजित करने के लिए उपचारित टाइमलैप्स इमेजिंग को जेड स्टैक के केंद्र में समायोजित करने के लिए सेट करें।

और अंत में, विकास माध्यम में पतला टीए के अलावा अत्यधिक देखभाल के साथ निष्पादित किया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं के साथ पूर्व-चयनित पदों के किसी भी बदलाव को रोका जा सके। लाइव कोशिकाओं में समय के साथ 3 डी में एकल आरएनए टेपों की इमेजिंग को डीएनए प्रतिकृति या सेल चक्र प्रगति के दौरान प्रतिलेखन के परिवर्तन के दौरान आरएनए प्रतिलेखन का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।