Name: sample preparation and relative quantitation using reductive methylation of amines for peptidomics studies
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies at JoVE.com

De ontwikkeling en het gebruik van de hier beschreven technieken werden ondersteund door de Braziliaanse National Research Council subsidie 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) subsidies 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) en 21/01286-1 (MEME). De financiers hadden geen rol in de studieopzet, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiding van het artikel.

De volgende procedure voor peptide-extractie en reductieve methylatie werd aangepast van eerder gepubliceerde procedures24,25,26,27. Dit protocol volgde de richtlijnen van de National Council for Animal Experimentation Control (CONCEA) en werd goedgekeurd door de Ethics Commission for Animal Use (CEUA) van het Bioscience Institute van de Sao Paulo State University. De protocolstappen zijn weerg...

<ol>
	<li>Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+era+of+'omics+unlimited.">The era of 'omics unlimited.</a> Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).</li><li>Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+peptides+and+peptidomics.">Plant peptides and peptidomics.</a> Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).</li><li>Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peptidomics+concept.">The peptidomics concept.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).</li><li>Dallas, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+peptidomics:+applications,+purification,+identification,+quantification,+and+functional+analysis.">Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis.</a> Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).</li><li>Chard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+radioimmunoassay+and+related+techniques+(3rd+Ed).">An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed).</a> FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).</li><li>Svensson, M., Sk&#246;ld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomics-based+discovery+of+novel+neuropeptides.">Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides.</a> Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).</li><li>Baggerman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomics.">Peptidomics.</a> Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).</li><li>Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+irradiation+increases+recovery+of+neuropeptides+from+brain+tissues.">Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues.</a> Peptides. 11, 1191-1197 (1990).</li><li>Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+neuropeptidomics+of+microwave-irradiated+mouse+brain+and+pituitary.">Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+yeast+peptidome+and+comparison+with+the+human+peptidome.">Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome.</a> PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).</li><li>Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Intracellular+Peptides+from+Zebrafish+(Danio+rerio)+Brain.">Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain.</a> Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).</li><li>Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mouse+brain+peptides+using+mass+spectrometry-based+peptidomics:+implications+for+novel+functions+ranging+from+non-classical+neuropeptides+to+microproteins.">Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins.</a> Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).</li><li>Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+analysis+of+human+cell+lines.">Peptidomic analysis of human cell lines.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).</li><li>De Araujo, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+peptides+in+cell+biology+and+pharmacology.">Intracellular peptides in cell biology and pharmacology.</a> Biomolecules. 9, 150 (2019).</li><li>Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+from+natural+or+rationally+designed+sources+can+be+used+in+overweight,+obesity,+and+type+2+diabetes+therapies.">Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies.</a> Molecules. 25 (5), 1093 (2020).</li><li>Sakaya, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+profiling+of+cerebrospinal+fluid+from+patients+with+intracranial+saccular+aneurysms.">Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms.</a> Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).</li><li>Fricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics:+General+considerations.">Quantitative peptidomics: General considerations.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).</li><li>Southey, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+quantitative+peptidomics+approaches+to+characterize+diurnal+variation+of+peptides+in+the+rat+suprachiasmatic+nucleus.">Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).</li><li>Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+using+SILAC:+Principles,+applications,+and+developments.">Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments.</a> Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).</li><li>Boonen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics+with+isotopic+and+isobaric+tags.">Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).</li><li>Gewehr, M. C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+thimet+oligopeptidase+in+the+regulation+of+energy+metabolism+and+diet-induced+obesity.">The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity.</a> Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).</li><li>Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+profile+of+zebrafish+brain+in+a+6-OHDA-induced+Parkinson+model.">Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model.</a> Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics+using+reductive+methylation+of+amines.">Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).</li><li>Tashima, A. K., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics+with+five-plex+reductive+methylation+labels.">Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).</li><li>Che, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+neuropeptide+extraction+from+the+mouse+hypothalamus.">Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus.</a> Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).</li><li>Lyons, P. J., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+approaches+to+study+proteolytic+activity.">Peptidomic approaches to study proteolytic activity.</a> Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).</li><li>Udenfriend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescamine:+a+reagent+for+assay+of+amino+acids,+peptides,+proteins,+and+primary+amines+in+the+picomole+range.">Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range.</a> Science. 178 (4063), 871-872 (1972).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS:+powerful+software+for+peptide+de+novo+sequencing+by+tandem+mass+spectrometry.">PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS+DB:+de+novo+sequencing+assisted+database+search+for+sensitive+and+accurate+peptide+identification.">PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).</li><li>Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+brain+neuropeptidomics:+tissue+collection,+protease+inhibition,+neuropeptide+extraction,+and+mass+spectrometric+analysis.">Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).</li><li>Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+mass+spectrometry-based+peptidomic+approaches.">Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).</li><li>Ross, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).</li></ol>

In de meeste peptidomics-studies is een van de kritieke stappen zonder twijfel de monstervoorbereiding die zorgvuldig moet worden uitgevoerd om de aanwezigheid van peptidefragmenten gegenereerd door proteasen na een paar minuten post-mortem te voorkomen. De eerste studies op hersenextracten bereid uit niet-microgolfmonsters toonden een groot aantal eiwitfragmenten aan die aanwezig waren in de 10-kDa-microfiltraten. Er zijn verschillende benaderingen beschreven om peptidespectra van eiwitafbraak te voorkomen: gerichte <su...

"Omics" wetenschappen worden gekenmerkt door de diepe analyse van een molecuulset, zoals DNA, RNA, eiwitten, peptiden, metabolieten, enz. Deze gegenereerde grootschalige datasets (genomics, transcriptomics, proteomics, peptidomics, metabolomics, etc.) hebben een revolutie teweeggebracht in de biologie en geleid tot een geavanceerd begrip van biologische processen1. De term peptidomics begon te worden geïntroduceerd in het begin van de 20e eeuw, en sommige auteurs hebben ernaar verwezen als een tak van proteomics2. Peptidomics heeft echter verschillende bijzonderheden, waarbij het belangrijkste belang is om het natuurlijk gegenereerde peptidengehalte tijdens cellulaire processen te onderzoeken, evenals de karakterisering van biologische activiteit van deze moleculen3,4.
Aanvankelijk waren bioactieve peptidestudies beperkt tot de neuropeptiden en hormoonpeptiden door Edman-afbraak en radioimmunoassay. Deze technieken laten echter geen globale analyse toe, afhankelijk van de isolatie van elk peptide in hoge concentraties, tijd voor het genereren van antilichamen, naast kruisreactiviteitsmogelijkheid5.
Peptidomics-analyse werd pas mogelijk gemaakt na verschillende ontwikkelingen in vloeistofchromatografie gekoppelde massaspectrometrie (LC-MS) en genoomprojecten die uitgebreide datapools opleverden voor proteomics/peptidomics studies6,7. Bovendien moest een specifiek peptide-extractieprotocol voor peptidomes worden vastgesteld omdat de eerste studies die neuropeptiden wereldwijd in hersenmonsters analyseerden, aantoonden dat detectie werd beïnvloed door de massale afbraak van eiwitten, die voornamelijk in dit weefsel voorkomen na 1 minuut post-mortem. De aanwezigheid van deze peptidefragmenten maskeerde het neuropeptidesignaal en vertegenwoordigde niet de peptidome in vivo. Dit probleem werd voornamelijk opgelost met de toepassing van snelle verwarmingsinactivatie van proteasen met behulp van microgolfbestraling, die de aanwezigheid van deze artefactfragmenten drastisch verminderde en niet alleen de identificatie van neuropeptidefragmenten mogelijk maakte, maar ook de aanwezigheid van een reeks peptiden uit cytosolische, mitochondriale en nucleaire eiwitten onthulde, verschillend van degradome6,8,9.
Deze methodologische procedures maakten een uitbreiding van de peptidome mogelijk voorbij de bekende neuropeptiden, waar honderden intracellulaire peptiden die voornamelijk worden gegenereerd door de werking van proteasooms zijn geïdentificeerd in gist10, zebravis11, knaagdierweefsels12 en menselijke cellen13. Van tientallen van deze intracellulaire peptiden is uitgebreid aangetoond dat ze zowel biologische als farmacologische activiteiten hebben14,15. Bovendien kunnen deze peptiden worden gebruikt als ziektebiomarkers en hebben ze mogelijk klinische betekenis, zoals aangetoond in hersenvocht van patiënten met intracraniale sacculaire aneurysmata16.
Momenteel is het, naast de identificatie van peptidesequenties, mogelijk om door massaspectrometrie gegevens van absolute en relatieve kwantificering te verkrijgen. In de absolute kwantificering worden de peptideniveaus in een biologisch monster vergeleken met synthetische standaarden, terwijl in de relatieve kwantificering de peptideniveaus worden vergeleken tussen twee of meer monsters17. Relatieve kwantificering kan worden uitgevoerd met behulp van de volgende benaderingen: 1) "labelvrij"18; 2) in vivo metabole etikettering of 3) chemische etikettering. De laatste twee zijn gebaseerd op het gebruik van stabiele isotopische vormen die zijn opgenomen in peptiden19,20. In labelvrije analyse worden de peptideniveaus geschat door rekening te houden met de signaalsterkte (spectrale tellingen) tijdens de LC-MS18. Isotopische etikettering kan echter nauwkeurigere relatieve niveaus van peptiden verkrijgen.
Veel peptidomische studies gebruikten trimethylammoniumbutyraat (TMAB) etiketteringsreagentia als chemische etikettering, en meer recent zijn reductieve methylatie van amines (RMA) met gedeutereerde en niet-gedeutereerde vormen van formaldehyde en natriumcyanoborohydridereagentia gebruikt11,21,22. De TMAB-labels zijn echter niet commercieel verkrijgbaar en het syntheseproces is zeer arbeidsintensief. Aan de andere kant zijn de reagentia in de RMA commercieel verkrijgbaar, goedkoop in vergelijking met andere labels, is de procedure eenvoudig uit te voeren en zijn de gelabelde peptiden stabiel23,24.
Het gebruik van RMA omvat het vormen van een Schiff-base door de peptiden te laten reageren met formaldehyde, gevolgd door een reductiereactie via het cyanoborohydride. Deze reactie veroorzaakt dimethylering van vrije aminogroepen op N-terminals en lysine zijketens en monomethylaten N-terminale prolines. Hoe prolineresiduen vaak zeldzaam zijn op de N-terminal, vrijwel alle peptiden met vrije amines op de N-terminus zijn gelabeld met twee methylgroepen23,24,25.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa cut-off filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1000291000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>analytical column (EASY-Column)</td>
			<td>EASY-Column</td>
			<td>(SC200)</td>
			<td>&#160;10 cm, ID75 &#181;m, 3 &#181;m, C18-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-13C, d2, solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>596388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-d2 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>Q216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid - HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind-Protein retention tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030108116-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LTQ Velos</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>NN-ST67HSRU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n Easy-nLC II nanoHPLC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEAKS Studio</td>
			<td>Bioinformatics Solutions Inc.</td>
			<td>VERSION 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>3002</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>precolumn (EASY-Column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>(SC001)</td>
			<td>2 cm, ID100 &#181;m, 5 &#181;m, C18-A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z326K</td>
			<td>for conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Vision</td>
			<td>VS15000CFNII</td>
			<td>for microtubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed-phase cleanup columns&#160;&#160; (Oasis HLB 1 cc Cartridge)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>Oasis HLB 1 cc Cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td>NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q55-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard peptide</td>
			<td>Proteimax</td>
			<td></td>
			<td>amino acid sequence: LTLRTKL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium buffer - TEAB 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid - TFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra purified water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Direct-Q 3UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge</td>
			<td>GeneVac</td>
			<td>MiVac DNA concentrator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Cientec</td>
			<td>266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and relative quantitation using reductive methylation of amines for peptidomics studies

Peptidomics kan worden gedefinieerd als de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van peptiden in een biologisch monster. De belangrijkste toepassingen omvatten het identificeren van de peptide biomarkers van ziekte of omgevingsstress, het identificeren van neuropeptiden, hormonen en bioactieve intracellulaire peptiden, het ontdekken van antimicrobiële en nutraceutische peptiden uit eiwithydrolysaten, en kunnen worden gebruikt in studies om de proteolytische processen te begrijpen. De recente vooruitgang in monstervoorbereiding, scheidingsmethoden, massaspectrometrietechnieken en computationele hulpmiddelen met betrekking tot eiwitsequencing heeft bijgedragen aan de toename van het geïdentificeerde aantal peptiden en peptidomes gekarakteriseerd. Peptidomic studies analyseren vaak peptiden die van nature in cellen worden gegenereerd. Hier wordt een monstervoorbereidingsprotocol op basis van warmte-inactivatie beschreven, dat protease-activiteit en extractie met milde omstandigheden elimineert, zodat er geen splitsing van peptidebindingen is. Daarnaast wordt ook de relatieve kwantificering van peptiden met behulp van stabiele isotoopetikettering door reductieve methylering van amines getoond. Deze etiketteringsmethode heeft enkele voordelen omdat de reagentia in de handel verkrijgbaar zijn, goedkoop in vergelijking met andere, chemisch stabiel en de analyse van maximaal vijf monsters in een enkele LC-MS-run mogelijk maken.

De resultaten van de runs die op de massaspectrometer worden uitgevoerd, worden opgeslagen in onbewerkte gegevensbestanden die kunnen worden geopend in de massaspectrometersoftware. In de MS-spectra is het mogelijk om piekgroepen te observeren die gelabelde peptiden vertegenwoordigen volgens het gebruikte etiketteringsschema, variërend van 2-5 labels. In figuur 2 worden bijvoorbeeld paren pieken die in een chromatografische tijd zijn gedetecteerd, weergegeven in een experiment waarbij slech...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies at JoVE.com

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Dit artikel beschrijft een monstervoorbereidingsmethode op basis van warmte-inactivatie om endogene peptiden te behouden die post-mortem degradatie voorkomen, gevolgd door relatieve kwantificering met behulp van isotopische etikettering plus LC-MS.

Monstervoorbereiding en relatieve kwantificering met behulp van reductieve methylering van amines voor peptidomics-studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Hier beschrijven we een instructiemethode op basis van een snelle warmte-inactivatie van protease om natuurlijke intracellulaire peptiden te behouden, afbraak in cellen en weefsels te voorkomen, gevolgd door relatieve kwantificering van peptiden met behulp van isotopische etikettering. Deze etiketteringsmethode heeft zoveel voordelen. De reagentia zijn commercieel verkrijgbaar, goedkoop, chemisch stabiel en maken de analyse van maximaal vijf monsters in één serum mogelijk.Begin met het cultiveren van menselijke neuroblastoomcellen in een schaal van 15 centimeter in DMEM met 15% FBS en 1% penicilline streptomycine. Houd de cellen op 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide. Was de cellen twee keer met PBS, voeg dan 10 milliliter PBS toe, schraap de cellen en verzamel ze in een buis van 15 milliliter.Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten op 800 keer G en verwijder het supernatant. Resuspend de pellet in een milliliter ultragezuiverd gedeïoniseerd water bij 80 graden Celsius en breng vervolgens de inhoud van de buis over naar een microfugebuis van twee milliliter. Na warmte-inactivatie van zebravissen, verzamel de hele hersenen in een microfugebuis van twee milliliter en vries deze in bij min 80 graden Celsius tot analyse.Resuspend het weefselmonster in een milliliter ultragezuiverd gedeïoniseerd water bij 80 graden Celsius en soniceer met een sonde met behulp van 30 pulsen van één seconde. Incubeer het cellulaire lysaat of homogenaatweefsel bij 80 graden Celsius gedurende 20 minuten en koel het vervolgens 10 tot 30 minuten af op ijs. Voeg 10 microliter van één molaire zoutzuurvoorraadoplossing toe voor elke milliliter monstervolume.Meng door 20 seconden te vortexen en incubeer gedurende 15 minuten op ijs. Centrifugeer het cellulaire lysaat of het homogenaatweefsel op 12.000 keer G in vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Verzamel het supernatant in laagbindende eiwitmicrocentrifugebuizen en bewaar het bij min 80 graden Celsius.Reinig de ultrafiltratie-apparaten met water en centrifugeer gedurende drie minuten op 2, 300 maal G en gooi vervolgens het water van het ultrafiltratieapparaat weg. Pipetteer het supernatant in een voorgewassen 10 kilodalton afsnijfilter en draai in een gekoelde centrifuge bij vier graden Celsius. Controleer de pH van het monster.Breng de kolom in evenwicht met één milliliter 100% acetonitril en was deze vervolgens met één milliliter 5% acetonitril met 0,1% trifluorazijnzuur. Laad het volledige volume van het monster in de kolom en was de kolom met één milliliter 5% acetonitril met 0,1% trifluorazijnzuur. Eluteer de peptiden uit de kolom met 1,8 milliliter 1% acetonitril met 0,15% trifluorazijnzuur in eiwitarmbindende microcentrifugebuizen.Droog het monster volledig in een vacuümcentrifuge bij 30 graden Celsius en controleer de getoonde concentratietijd. Bewaar het monster bij min 80 graden Celsius. Resuspend de peptidemonsters in 100 tot 200 microliter ultragezuiverd water en pipetteer 2,5 microliter van de standaard peptideconcentraties en monsters op de witte 96-well plaat.Voeg 25 microliter 0,2 molaire fosfaatbuffer en 12,5 microliter fluorescamine toe. Homogeneer zachtjes gedurende één minuut op de orbitale rotator. Voeg vervolgens 110 microliter water toe om de reactie te stoppen.Pas de instellingen op de spectrofluorometer aan en lees vervolgens de plaat af. Voeg 1/10e volume van één molair trimethylammoniumbromide toe aan elk peptidemonster met maximaal 25 microgram van het peptide. Zorg ervoor dat de pH tussen de vijf en acht ligt, indien nodig met zoutzuur of natriumhydroxide.Voeg vier microliter niet-gedeutereerde, gedeutereerde formaldehyde of koolstof-13 gedeutereerde formaldehyde toe. Meng gedurende vijf seconden door te vortexen. Voeg vier microliter natriumcyanoboorhydride of gedeutereerd natriumcyanoboorhydride toe aan het peptidemonster.Meng het monster vervolgens gedurende vijf seconden door vortexing. Incubeer het peptidemonster gedurende twee uur in een zuurkast bij kamertemperatuur en vortex elke 30 minuten. Herhaal de toevoeging van niet-gedeutereerd, gedeutereerd of koolstof-13 gedeutereerd formaldehyde en natriumcyanoboorhydride of gedeutereerd natriumcyanoboorhydride, vortexing na elke toevoeging.Incubeer de monsters in de zuurkast 's nachts bij kamertemperatuur. Voeg 16 microliter ammoniumbicarbonaat toe en meng door vortexing. Plaats het monster op ijs.Voeg nog eens vijf seconden acht microliter mierenzuur en vortex toe. Combineer de peptidemonsters, pas de pH aan tussen twee en vier en ontzout vervolgens de gecombineerde monsters op omgekeerde faseopruimingskolommen met acetonitril en trifluorazijnzuur zoals eerder beschreven. Droog het monster volledig in een vacuümcentrifuge bij 30 graden Celsius en bewaar het vervolgens bij min 20 graden Celsius.De gelabelde peptiden worden waargenomen met behulp van massaspectra. Rode pijlen geven de aanwezigheid aan van piekparen van verschillende peptiden gelabeld met twee isotopische vormen, L1 en L5, voor vergelijking tussen twee verschillende monsters respectievelijk S1 en S2. Het massaspectrum van een peptide aanwezig in drie verschillende monsters, S1, S2 en S3, gelabeld met respectievelijk L1, L3 en L5 tags wordt hier getoond.Er werd een quadruplex labeling uitgevoerd. Controlemonsters S1 en S3 werden gelabeld met respectievelijk L1 en L3 en vergeleken met twee experimentele monsters, S2 en S4 gelabeld met L2 en L4.No significant verschil werd waargenomen. De isotopische etikettering werd gebruikt om substraten in producten in vitro weer te geven voor een bepaald protease of peptidase.Een peptide dat niet verandert in de aanwezigheid van het neurolysine-enzym wordt hier getoond. Peptiden die verdwijnen of verminderen in de aanwezigheid van het enzym zijn substraten, terwijl degenen die toenemen als producten worden beschouwd. De figuur is een voorbeeld van het identificeren van een peptidesequentie uitgevoerd door een databasezoekmachine gelabeld met drie verschillende vormen van tags.Voordat het wordt gedefinieerd, moet u ervoor zorgen dat het monster volledig koel is om te voorkomen dat de peptidebindingen worden verbroken die worden veroorzaakt door harde verzuring. Daarnaast is het reinigen van ultrafiltratie-apparaten essentieel. massaspectrometrie is een uitstekende methode om peptiden te kwantificeren tussen verschillende experimentele omstandigheden en voor analysestudies door peptidase-substraten te identificeren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Een alles-in-een monsterhouder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie met minimale achtergrond verstrooiing

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Een plasmamonstervoorbereiding voor massaspectrometrie met behulp van een geautomatiseerd werkstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Plantmonstervoorbereiding voor nucleoside/nucleotide-inhoudsmeting met een HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Grootschalige multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): richtlijnen voor monstervoorbereiding en normalisatie

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...