Name: sample preparation and relative quantitation using reductive methylation of amines for peptidomics studies
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies at JoVE.com

Le développement et l’utilisation des techniques décrites ici ont été soutenus par la subvention du Conseil national brésilien de la recherche 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) subventions 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) et 21/01286-1 (MEME). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation de l’article.

La procédure suivante pour l’extraction peptidique et la méthylation réductrice a été adaptée des procédures précédemment publiées24,25,26,27. Ce protocole suivait les directives du Conseil national pour le contrôle de l’expérimentation animale (CONCEA) et a été approuvé par la Commission d’éthique pour l’utilisation animale (CEUA) de l’Institut des biosciences de l’...

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	<li>Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+era+of+'omics+unlimited.">The era of 'omics unlimited.</a> Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).</li><li>Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+peptides+and+peptidomics.">Plant peptides and peptidomics.</a> Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).</li><li>Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peptidomics+concept.">The peptidomics concept.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).</li><li>Dallas, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+peptidomics:+applications,+purification,+identification,+quantification,+and+functional+analysis.">Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis.</a> Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).</li><li>Chard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+radioimmunoassay+and+related+techniques+(3rd+Ed).">An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed).</a> FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).</li><li>Svensson, M., Sk&#246;ld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomics-based+discovery+of+novel+neuropeptides.">Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides.</a> Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).</li><li>Baggerman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomics.">Peptidomics.</a> Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).</li><li>Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+irradiation+increases+recovery+of+neuropeptides+from+brain+tissues.">Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues.</a> Peptides. 11, 1191-1197 (1990).</li><li>Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+neuropeptidomics+of+microwave-irradiated+mouse+brain+and+pituitary.">Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+yeast+peptidome+and+comparison+with+the+human+peptidome.">Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome.</a> PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).</li><li>Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+analysis+of+human+cell+lines.">Peptidomic analysis of human cell lines.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).</li><li>De Araujo, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+peptides+in+cell+biology+and+pharmacology.">Intracellular peptides in cell biology and pharmacology.</a> Biomolecules. 9, 150 (2019).</li><li>Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+from+natural+or+rationally+designed+sources+can+be+used+in+overweight,+obesity,+and+type+2+diabetes+therapies.">Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies.</a> Molecules. 25 (5), 1093 (2020).</li><li>Sakaya, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+profiling+of+cerebrospinal+fluid+from+patients+with+intracranial+saccular+aneurysms.">Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms.</a> Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).</li><li>Fricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics:+General+considerations.">Quantitative peptidomics: General considerations.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).</li><li>Southey, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+quantitative+peptidomics+approaches+to+characterize+diurnal+variation+of+peptides+in+the+rat+suprachiasmatic+nucleus.">Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).</li><li>Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+using+SILAC:+Principles,+applications,+and+developments.">Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments.</a> Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).</li><li>Boonen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics+with+isotopic+and+isobaric+tags.">Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).</li><li>Gewehr, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics+using+reductive+methylation+of+amines.">Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).</li><li>Tashima, A. K., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics+with+five-plex+reductive+methylation+labels.">Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).</li><li>Che, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+neuropeptide+extraction+from+the+mouse+hypothalamus.">Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus.</a> Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).</li><li>Lyons, P. J., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+approaches+to+study+proteolytic+activity.">Peptidomic approaches to study proteolytic activity.</a> Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).</li><li>Udenfriend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescamine:+a+reagent+for+assay+of+amino+acids,+peptides,+proteins,+and+primary+amines+in+the+picomole+range.">Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range.</a> Science. 178 (4063), 871-872 (1972).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS:+powerful+software+for+peptide+de+novo+sequencing+by+tandem+mass+spectrometry.">PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS+DB:+de+novo+sequencing+assisted+database+search+for+sensitive+and+accurate+peptide+identification.">PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).</li><li>Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+brain+neuropeptidomics:+tissue+collection,+protease+inhibition,+neuropeptide+extraction,+and+mass+spectrometric+analysis.">Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).</li><li>Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+mass+spectrometry-based+peptidomic+approaches.">Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).</li><li>Ross, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).</li></ol>

Dans la plupart des études peptidomiques, l’une des étapes critiques est, sans aucun doute, la préparation de l’échantillon qui doit être soigneusement effectuée pour éviter la présence de fragments peptidiques générés par les protéases après quelques minutes post-mortem. Les premières études sur les extraits cérébraux préparés à partir d’échantillons non micro-ondes ont montré la présence d’un grand nombre de fragments de protéines dans les microfiltrats de 10 kDa. Différentes approches ...

Les sciences « omiques » sont caractérisées par l’analyse approfondie d’un ensemble de molécules, telles que l’ADN, l’ARN, les protéines, les peptides, les métabolites, etc. Ces ensembles de données générés à grande échelle (génomique, transcriptomique, protéomique, peptidomique, métabolomique, etc.) ont révolutionné la biologie et conduit à une compréhension avancée des processus biologiques1. Le terme peptidomique a commencé à être introduit au début du 20ème siècle, et certains auteurs l’ont appelé une branche de la protéomique2. Cependant, la peptidomique présente des particularités distinctes, où l’intérêt principal est d’étudier la teneur en peptides générés naturellement au cours des processus cellulaires, ainsi que la caractérisation de l’activité biologique de ces molécules3,4.
Initialement, les études sur les peptides bioactifs étaient limitées aux neuropeptides et aux peptides hormonaux par dégradation d’Edman et dosage radioimmunologique. Cependant, ces techniques ne permettent pas une analyse globale, en fonction de l’isolement de chaque peptide à des concentrations élevées, du temps de génération d’anticorps, en dehors de la possibilité de réactivité croisée5.
L’analyse peptidomique n’a été rendue possible qu’après plusieurs avancées dans la spectrométrie de masse couplée par chromatographie liquide (LC-MS) et des projets de génome qui ont fourni des pools de données complets pour les études protéomiques / peptidomics6,7. De plus, un protocole d’extraction peptidique spécifique pour les peptidomes devait être établi car les premières études qui ont analysé les neuropeptides à l’échelle mondiale dans des échantillons de cerveau ont montré que la détection était affectée par la dégradation massive des protéines, qui se produisent principalement dans ce tissu après 1 min post-mortem. La présence de ces fragments peptidiques masquait le signal neuropeptide et ne représentait pas le peptidome in vivo. Ce problème a été résolu principalement avec l’application de l’inactivation rapide par chauffage des protéases à l’aide de l’irradiation par micro-ondes, ce qui a considérablement réduit la présence de ces fragments d’artefacts et a permis non seulement l’identification de fragments de neuropeptides, mais a révélé la présence d’un ensemble de peptides de protéines cytosoliques, mitochondriales et nucléaires, différentes de degradome6,8,9.
Ces procédures méthodologiques ont permis une expansion du peptidome au-delà des neuropeptides bien connus, où des centaines de peptides intracellulaires générés principalement par l’action des protéasomes ont été identifiés dans la levure10, le poisson-zèbre11, les tissus de rongeurs12 et les cellules humaines13. Il a été largement démontré que des dizaines de ces peptides intracellulaires ont des activités biologiques et pharmacologiques14,15. En outre, ces peptides peuvent être utilisés comme biomarqueurs de la maladie et éventuellement avoir une signification clinique, comme démontré dans le liquide céphalo-rachidien chez les patients atteints d’anévrismes sacculaires intracrâniens16.
Actuellement, en plus de l’identification des séquences peptidiques, il est possible par spectrométrie de masse d’obtenir des données de quantification absolue et relative. Dans la quantification absolue, les niveaux de peptides dans un échantillon biologique sont comparés à des étalons synthétiques, tandis que dans la quantification relative, les niveaux de peptides sont comparés entre deux échantillons ou plus17. La quantification relative peut être effectuée à l’aide des approches suivantes : 1) « sans étiquette »18; 2) marquage métabolique in vivo ou 3) marquage chimique. Les deux derniers sont basés sur l’utilisation de formes isotopiques stables incorporées dans des peptides19,20. Dans l’analyse sans étiquette, les niveaux de peptides sont estimés en tenant compte de l’intensité du signal (comptage spectral) pendant le LC-MS18. Cependant, le marquage isotopique peut obtenir des niveaux relatifs plus précis de peptides.
De nombreuses études peptidomiques ont utilisé des réactifs de marquage du butyrate de triméthylammonium (TMAB) comme marquage chimique et, plus récemment, la méthylation réductrice des amines (RMA) avec des formes deutérées et non deutérées de formaldéhyde et de réactifs cyanoborohydrure de sodium ont été utilisées11,21,22. Cependant, les étiquettes TMAB ne sont pas disponibles dans le commerce et le processus de synthèse est très laborieux. D’autre part, dans le RMA, les réactifs sont disponibles dans le commerce, peu coûteux par rapport aux autres étiquettes, la procédure est simple à effectuer et les peptides marqués sont stables23,24.
L’utilisation de RMA consiste à former une base de Schiff en permettant aux peptides de réagir avec le formaldéhyde, suivie d’une réaction de réduction à travers le cyanoborohydrure. Cette réaction provoque la diméthylation des groupes aminés libres sur les chaînes latérales N-terminales et lysine et les monométhylates N-terminaux prolines. Comme les résidus de proline sont souvent rares sur le N-terminal, pratiquement tous les peptides avec des amines libres sur le N-terminus sont marqués avec deux groupes méthyle23,24,25.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa cut-off filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1000291000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>analytical column (EASY-Column)</td>
			<td>EASY-Column</td>
			<td>(SC200)</td>
			<td>&#160;10 cm, ID75 &#181;m, 3 &#181;m, C18-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-13C, d2, solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>596388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-d2 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>Q216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid - HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind-Protein retention tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030108116-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LTQ Velos</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>NN-ST67HSRU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n Easy-nLC II nanoHPLC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEAKS Studio</td>
			<td>Bioinformatics Solutions Inc.</td>
			<td>VERSION 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>3002</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>precolumn (EASY-Column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>(SC001)</td>
			<td>2 cm, ID100 &#181;m, 5 &#181;m, C18-A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z326K</td>
			<td>for conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Vision</td>
			<td>VS15000CFNII</td>
			<td>for microtubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed-phase cleanup columns&#160;&#160; (Oasis HLB 1 cc Cartridge)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>Oasis HLB 1 cc Cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td>NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q55-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard peptide</td>
			<td>Proteimax</td>
			<td></td>
			<td>amino acid sequence: LTLRTKL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium buffer - TEAB 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid - TFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra purified water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Direct-Q 3UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge</td>
			<td>GeneVac</td>
			<td>MiVac DNA concentrator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Cientec</td>
			<td>266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and relative quantitation using reductive methylation of amines for peptidomics studies

La peptidomique peut être définie comme l’analyse qualitative et quantitative des peptides dans un échantillon biologique. Ses principales applications comprennent l’identification des biomarqueurs peptidiques de la maladie ou du stress environnemental, l’identification des neuropeptides, des hormones et des peptides intracellulaires bioactifs, la découverte de peptides antimicrobiens et nutraceutiques à partir d’hydrolysats de protéines, et peut être utilisé dans des études pour comprendre les processus protéolytiques. Les progrès récents dans la préparation des échantillons, les méthodes de séparation, les techniques de spectrométrie de masse et les outils informatiques liés au séquençage des protéines ont contribué à l’augmentation du nombre de peptides identifiés et des peptidomes caractérisés. Les études peptidomiques analysent fréquemment les peptides naturellement générés dans les cellules. Ici, un protocole de préparation d’échantillon basé sur l’inactivation thermique est décrit, ce qui élimine l’activité de la protéase et l’extraction dans des conditions douces, de sorte qu’il n’y a pas de clivage des liaisons peptidiques. En outre, la quantification relative des peptides à l’aide du marquage isotopique stable par méthylation réductrice des amines est également montrée. Cette méthode d’étiquetage présente certains avantages car les réactifs sont disponibles dans le commerce, peu coûteux par rapport aux autres, chimiquement stables et permettent l’analyse de jusqu’à cinq échantillons en une seule série LC-MS.

Les résultats obtenus à partir des exécutions effectuées sur le spectromètre de masse sont stockés dans des fichiers de données brutes qui peuvent être ouverts dans le logiciel du spectromètre de masse. Dans les spectres MS, il est possible d’observer des groupes de pics représentant des peptides marqués selon le schéma de marquage utilisé, allant de 2 à 5 étiquettes. Par exemple, dans la figure 2, des paires de pics détectés dans un temps chromatographique sont représent...

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Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Cet article décrit une méthode de préparation d’échantillons basée sur l’inactivation thermique pour préserver les peptides endogènes en évitant la dégradation post-mortem, suivie d’une quantification relative utilisant le marquage isotopique plus LC-MS.

Préparation des échantillons et quantification relative à l’aide de la méthylation réductrice des amines pour les études peptidomiques

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Ici, nous décrivons une méthode pédagogique basée sur une inactivation thermique rapide de la protéase pour préserver les peptides intracellulaires naturels, éviter la dégradation dans les cellules et les tissus, suivie d’une quantification relative des peptides à l’aide d’un marquage isotopique. Cette méthode d’étiquetage présente de nombreux avantages. Les réactifs sont disponibles dans le commerce, peu coûteux, chimiquement stables et permettent d’analyser jusqu’à cinq échantillons dans un seul sérum.Commencez par cultiver des cellules de neuroblastome humain dans un plat de 15 centimètres dans du DMEM contenant 15% fbS et 1% de streptomycine de pénicilline. Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Lavez les cellules deux fois avec du PBS, puis ajoutez 10 millilitres de PBS, grattez les cellules et collectez-les dans un tube de 15 millilitres.Centrifugez les cellules à 800 fois G pendant cinq minutes et retirez le surnageant. Remettre la pastille dans un millilitre d’eau désionisée ultra purifiée à 80 degrés Celsius, puis transférer le contenu du tube dans un tube de microfuge de deux millilitres. Après l’inactivation par la chaleur du poisson-zèbre, recueillir tout le cerveau dans un tube de microfuge de deux millilitres et le congeler à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse.Resuspendez l’échantillon de tissu dans un millilitre d’eau désionisée ultra purifiée à 80 degrés Celsius et soniquez avec une sonde en utilisant 30 impulsions d’une seconde. Incuber le lysat cellulaire ou homogénérer le tissu à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis le refroidir sur de la glace pendant 10 à 30 minutes. Ajouter 10 microlitres d’une solution mère d’acide chlorhydrique molaire pour chaque millilitre de volume d’échantillon.Mélanger en vortexant pendant 20 secondes et incuber sur de la glace pendant 15 minutes. Centrifuger le lysat cellulaire ou le tissu homogénéate à 12 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Recueillir le surnageant dans des tubes de microcentrifugation protéique à faible liaison et le stocker à moins 80 degrés Celsius.Nettoyez les dispositifs d’ultrafiltration avec de l’eau et centrifugez à 2 300 fois G pendant trois minutes, puis jetez l’eau du dispositif d’ultrafiltration. Pipeter le surnageant dans un filtre de coupure prélavé de 10 kilodaltons et tourner dans une centrifugeuse réfrigérée à quatre degrés Celsius. Vérifiez le pH de l’échantillon.Équilibrez la colonne avec un millilitre de 100% d’acétonitrile, puis lavez-la avec un millilitre de 5% d’acétonitrile avec 0,1% d’acide trifluoroacétique. Chargez le volume complet de l’échantillon dans la colonne et lavez la colonne avec un millilitre d’acétonitrile à 5 % avec de l’acide trifluoroacétique à 0,1 %. Éluez les peptides de la colonne avec 1,8 millilitre de 1% d’acétonitrile avec 0,15% d’acide trifluoroacétique dans des tubes de microcentrifugation à faible liaison protéique.Sécher l’échantillon entièrement dans une centrifugeuse à vide à 30 degrés Celsius et surveiller le temps de concentration affiché. Conservez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius. Remettre en suspension les échantillons peptidiques dans 100 à 200 microlitres d’eau ultra purifiée et pipeter 2,5 microlitres des concentrations peptidiques standard et des échantillons sur la plaque blanche de 96 puits.Ajouter 25 microlitres de tampon phosphate molaire 0,2 et 12,5 microlitres de fluorescamine. Homogénéiser doucement pendant une minute sur le rotateur orbital. Ensuite, ajoutez 110 microlitres d’eau pour arrêter la réaction.Réglez les réglages du spectrofluoromètre, puis lisez la plaque. Ajouter 1/10e de volume d’un bromure molaire de triméthylammonium à chaque échantillon peptidique avec jusqu’à 25 microgrammes du peptide. Assurez-vous que le pH est compris entre cinq et huit, en ajustant avec de l’acide chlorhydrique ou de l’hydroxyde de sodium, si nécessaire.Ajouter quatre microlitres de formaldéhyde non deutéré, de deutéré ou de formaldéhyde deutéré au carbone 13. Mélanger pendant cinq secondes en vortexant. Ajouter quatre microlitres de cyanoborohydrure de sodium ou de cyanoborohydrure de sodium deutéré à l’échantillon peptidique.Mélangez ensuite l’échantillon pendant cinq secondes en vortexant. Incuber l’échantillon peptidique dans une hotte pendant deux heures à température ambiante, en tourbillonnant toutes les 30 minutes. Répétez l’ajout de formaldéhyde non deutéré, deutéré ou de carbon-13 depérisé et de cyanoborohydrure de sodium ou de cyanoborohydrure de sodium deutéré, en vortexant après chaque addition.Incuber les échantillons dans la hotte pendant la nuit à température ambiante. Ajouter 16 microlitres de bicarbonate d’ammonium et mélanger par vortex. Placez l’échantillon sur de la glace.Ajouter huit microlitres d’acide formique à 5% et vortex pendant cinq secondes supplémentaires. Combinez les échantillons de peptides, ajustez le pH entre deux et quatre, puis dessalez les échantillons combinés sur des colonnes de nettoyage en phase inversée à l’aide d’acétonitrile et d’acide trifluoroacétique comme décrit précédemment. Séchez l’échantillon entièrement dans une centrifugeuse à vide à 30 degrés Celsius, puis stockez-le à moins 20 degrés Celsius.Les peptides marqués sont observés à l’aide de spectres de masse. Les flèches rouges indiquent la présence de paires de pics de différents peptides marqués avec deux formes isotopiques, L1 et L5, pour la comparaison entre deux échantillons différents S1 et S2 respectivement. Le spectre massique d’un peptide présent dans trois échantillons différents, S1, S2 et S3, marqués respectivement avec des étiquettes L1, L3 et L5 est montré ici.Un étiquetage quadruplex a été effectué. Les échantillons témoins S1 et S3 ont été marqués avec L1 et L3 respectivement et comparés à deux échantillons expérimentaux, S2 et S4 marqués avec L2 et L4.No différence significative a été observée. Le marquage isotopique a été utilisé pour montrer les substrats dans les produits in vitro pour une protéase ou une peptidase donnée.Un peptide qui ne change pas en présence de l’enzyme neurolysine est montré ici. Les peptides qui disparaissent ou diminuent en présence de l’enzyme sont des substrats, tandis que ceux qui augmentent sont considérés comme des produits. La figure est un exemple d’identification d’une séquence peptidique effectuée par un moteur de recherche de base de données étiqueté avec trois formes différentes de balises.Avant qu’il ne soit défini, assurez-vous que l’échantillon est complètement frais pour éviter de briser les liaisons peptidiques causées par l’acidification dure. De plus, le nettoyage des dispositifs d’ultrafiltration est essentiel. La spectrométrie de masse est une excellente méthode pour quantifier les peptides entre différentes conditions expérimentales et pour les études d’analyse en identifiant les substrats de peptidase.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

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Recherche

Biochimie

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Un porte-échantillon tout-en-un pour la cristallographie macromoléculaire de rayon X avec la diffusion minimale de fond

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

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TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

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Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

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A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

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Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

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Études d’association multi-omiques à grande échelle à l’échelle du génome (Mo-GWAS): Lignes directrices pour la préparation et la normalisation des échantillons

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Préparation de grilles d’échantillons à haute température pour Cryo-EM

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Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

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