Name: sample preparation and relative quantitation using reductive methylation of amines for peptidomics studies
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
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여기에 설명 된 기술의 개발 및 사용은 브라질 국가 연구위원회 보조금 420811/2018-4 (LMC)에 의해 지원되었다; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 교부금 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) 및 21/01286-1 (MEME). 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 결정 또는 문서 작성에 아무런 역할이 없었습니다.

펩티드 추출 및 환원 메틸화를 위한 다음 절차는 이전에 발표된 절차24,25,26,27에서 조정되었다. 이 프로토콜은 국립 동물 실험 통제 위원회 (CONCEA)의 지침을 따랐으며 상파울루 주립 대학의 생물 과학 연구소에서 동물 사용 윤리위원회 (CEUA)의 승인을 받았습니다. 프로토콜 단계는 그림 ...

<ol>
	<li>Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+era+of+'omics+unlimited.">The era of 'omics unlimited.</a> Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).</li><li>Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+peptides+and+peptidomics.">Plant peptides and peptidomics.</a> Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).</li><li>Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peptidomics+concept.">The peptidomics concept.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).</li><li>Dallas, D. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+analysis+of+human+cell+lines.">Peptidomic analysis of human cell lines.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).</li><li>De Araujo, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+peptides+in+cell+biology+and+pharmacology.">Intracellular peptides in cell biology and pharmacology.</a> Biomolecules. 9, 150 (2019).</li><li>Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+from+natural+or+rationally+designed+sources+can+be+used+in+overweight,+obesity,+and+type+2+diabetes+therapies.">Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies.</a> Molecules. 25 (5), 1093 (2020).</li><li>Sakaya, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+profiling+of+cerebrospinal+fluid+from+patients+with+intracranial+saccular+aneurysms.">Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms.</a> Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).</li><li>Fricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics:+General+considerations.">Quantitative peptidomics: General considerations.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).</li><li>Southey, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+quantitative+peptidomics+approaches+to+characterize+diurnal+variation+of+peptides+in+the+rat+suprachiasmatic+nucleus.">Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).</li><li>Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+using+SILAC:+Principles,+applications,+and+developments.">Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments.</a> Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).</li><li>Boonen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics+with+isotopic+and+isobaric+tags.">Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).</li><li>Gewehr, M. C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+thimet+oligopeptidase+in+the+regulation+of+energy+metabolism+and+diet-induced+obesity.">The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity.</a> Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).</li><li>Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+profile+of+zebrafish+brain+in+a+6-OHDA-induced+Parkinson+model.">Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model.</a> Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics+using+reductive+methylation+of+amines.">Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).</li><li>Tashima, A. K., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics+with+five-plex+reductive+methylation+labels.">Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).</li><li>Che, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+neuropeptide+extraction+from+the+mouse+hypothalamus.">Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus.</a> Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).</li><li>Lyons, P. J., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+approaches+to+study+proteolytic+activity.">Peptidomic approaches to study proteolytic activity.</a> Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).</li><li>Udenfriend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescamine:+a+reagent+for+assay+of+amino+acids,+peptides,+proteins,+and+primary+amines+in+the+picomole+range.">Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range.</a> Science. 178 (4063), 871-872 (1972).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS:+powerful+software+for+peptide+de+novo+sequencing+by+tandem+mass+spectrometry.">PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS+DB:+de+novo+sequencing+assisted+database+search+for+sensitive+and+accurate+peptide+identification.">PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).</li><li>Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+brain+neuropeptidomics:+tissue+collection,+protease+inhibition,+neuropeptide+extraction,+and+mass+spectrometric+analysis.">Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).</li><li>Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+mass+spectrometry-based+peptidomic+approaches.">Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).</li><li>Ross, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).</li></ol>

대부분의 펩티도믹스 연구에서, 중요한 단계 중 하나는 의심할 여지없이, 몇 분 후 프로테아제에 의해 생성 된 펩티드 단편의 존재를 피하기 위해 신중하게 수행해야하는 샘플 준비입니다. 비전자래드 샘플에서 제조된 뇌 추출물에 대한 초기 연구는 10kDa 마이크로필로테스에 존재하는 많은 단백질 단편을 보여주었다. 단백질 분해로부터 펩티드 스펙트럼을 피하기 위해 다른 접근법이 설명되었습?...

"Omics" 과학은 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 대사 산물 등과 같은 분자 세트의 심층 분석을 특징으로 합니다. 이러한 생성된 대규모 데이터 세트(유전체학, 전사학, 프로테오믹스, 펩티도믹스, 메타볼로믹스 등)는 생물학에 혁명을 일으켰으며 생물학적 과정에 대한 고급 이해로 이어졌다1. 용어 펩티도믹스는 20 세기 초에 소개되기 시작하고, 몇몇 저자는 proteomics2의 분기로 그것을 언급했습니다. 그러나, 펩티도믹스는 세포 과정 동안 자연적으로 생성된 펩티드 함량뿐만 아니라 이들 분자의 생물학적 활성의 특성화를 조사하는 것이 주요 관심사인 뚜렷한 특수성을 갖는다3,4.
처음에, 생리 활성 펩티드 연구는 에드먼 분해 및 방사선 면역을 통해 신경 펩티드와 호르몬 펩티드에 제한되었다. 그러나, 이들 기술은 고농도각 펩티드의 절연에 따라, 항체의 생성을 위한 시간, 교차 반응성 가능성 외에 글로벌 분석을 허용하지 않는다5.
펩티도믹스 분석은 프로테오믹스/펩티도믹스 연구를 위한 포괄적인 데이터 풀을 전달한 액체 크로마토그래피 결합 질량 분광법(LC-MS) 및 게놈 프로젝트에서 몇 차례 발전한 후에만 가능하였다6,7. 더욱이, 펩티돔에 대한 특정 펩티드 추출 프로토콜은 뇌 샘플에서 전 세계적으로 신경펩티드를 분석한 첫 번째 연구결과에 따라 검출이 단백질의 대규모 분해에 의해 영향을 받았기 때문에 확립될 필요가 있었으며, 이는 주로 이 조직에서 발생하며, 이는 사후 1분 후에 주로 발생한다. 이러한 펩티드 단편의 존재는 신경 펩티드 신호를 마스크하고 생체 내펩티돔을 나타내지 않았다. 이 문제는 주로 전자 레인지 조사를 사용하여 프로테아제의 빠른 가열 불활성화의 적용으로 해결되었으며, 이는 이러한 유물 조각의 존재를 크게 감소시키고 신경 펩티드 조각의 식별뿐만 아니라 세포세포, 미토콘드리아 및 핵 단백질의 존재를 드러냈으며, 데그라돔6,8,9의 다른.
이러한 방법론적 절차는 잘 알려진 신경 펩티드를 넘어 펩티돔의 확장을 허용했으며, 프로테좀의 작용에 의해 주로 생성된 수백 개의 세포내 펩타이드가 효모10, 제브라피시11, 설치류 조직12 및 인간 세포13에서 확인되었다. 이러한 세포 내 펩티드의 수십 광범위하게 생물학적 및 약리학적 활동을 모두 가지고 표시되었습니다14,15. 더욱이, 이들 펩타이드는 질병 바이오마커로 사용될 수 있으며, 두개내 실동맥류16환자로부터 뇌척수액에서 입증된 바와 같이 임상적 중요성을 가질 수 있다.
현재, 펩티드 서열의 식별 외에도 질량 분석법을 통해 절대 및 상대적 수량의 데이터를 얻을 수 있다. 절대 수량에서, 생물학적 샘플의 펩티드 수준은 합성 표준과 비교되며, 상대적 수량에서 펩티드 수준은 2개 이상의 샘플 중에서 비교된다17. 상대적 수량은 다음 방법을 사용하여 수행 할 수 있습니다 : 1) "레이블 무료"18; 2) 생체 내 대사 라벨링 또는 3) 화학 라벨링. 마지막 두 펩티드19,20에 통합된 안정적인 동위원소 형태의 사용을 기반으로 한다. 라벨프리 분석에서 펩타이드 수준은 LC-MS18 동안 신호 강도(스펙트럼 수)를 고려하여 추정된다. 그러나, 동위원소 라벨링은 펩티드의 보다 정확한 상대적 수준을 얻을 수 있다.
많은 펩티도믹 연구는 트리메틸람모늄 부티레이트(TMAB)를 화학 라벨링으로 라벨링하는 시약을 사용했으며, 최근에는 포름알데히드와 시아노보하이드라이드 나트륨 시약의 유정 및 비유화 된 형태를 가진 아민 (RMA)의 환원 메틸화를 사용했습니다111,21,22. 그러나, TMAB 라벨은 상업적으로 사용할 수 없으며, 합성 과정은 매우 힘들다. 한편, RMA에서 시약은 시판되고, 다른 라벨에 비해 저렴하며, 절차는 수행하기가 간단하며, 표지된 펩타이드는 안정23,24이다.
RMA의 사용은 펩티드가 포름알데히드와 반응할 수 있도록 함으로써 쉬프 기지를 형성하는 것을 포함하고, 그 다음에 시아노보로하이드라이드를 통해 환원 반응에 선행됩니다. 이 반응은 N 단자 및 리신 사이드 체인및 단백석 N 단자 프롤라인에 무료 아미노 그룹의 디메틸화를 일으킵니다. 프롤린 잔류물이 N 단자에서 자주 드물며, N-terminus에 무료 아민이 있는 거의 모든 펩타이드는 두 개의 메틸 군23,24,25로 표시된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa cut-off filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1000291000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>analytical column (EASY-Column)</td>
			<td>EASY-Column</td>
			<td>(SC200)</td>
			<td>&#160;10 cm, ID75 &#181;m, 3 &#181;m, C18-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-13C, d2, solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>596388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-d2 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>Q216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid - HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind-Protein retention tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030108116-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LTQ Velos</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>NN-ST67HSRU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n Easy-nLC II nanoHPLC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEAKS Studio</td>
			<td>Bioinformatics Solutions Inc.</td>
			<td>VERSION 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>3002</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>precolumn (EASY-Column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>(SC001)</td>
			<td>2 cm, ID100 &#181;m, 5 &#181;m, C18-A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z326K</td>
			<td>for conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Vision</td>
			<td>VS15000CFNII</td>
			<td>for microtubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed-phase cleanup columns&#160;&#160; (Oasis HLB 1 cc Cartridge)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>Oasis HLB 1 cc Cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td>NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q55-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard peptide</td>
			<td>Proteimax</td>
			<td></td>
			<td>amino acid sequence: LTLRTKL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium buffer - TEAB 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid - TFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra purified water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Direct-Q 3UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge</td>
			<td>GeneVac</td>
			<td>MiVac DNA concentrator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Cientec</td>
			<td>266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and relative quantitation using reductive methylation of amines for peptidomics studies

펩티도믹스는 생물학적 샘플에서 펩타이드의 정성적 및 정량적 분석으로 정의될 수 있다. 주요 응용 분야에는 질병 또는 환경 스트레스의 펩티드 바이오마커 를 식별하고, 신경 펩티드, 호르몬 및 생리 활성 세포 내 펩티드를 식별하고, 단백질 가수분해제에서 항균 및 영양 펩티드를 발견하고, 프로테올리틱 프로세스를 이해하는 연구에 사용될 수 있습니다. 최근 시료 제제, 분리 방법, 질량 분석 기술 및 단백질 시퀀싱과 관련된 계산 도구의 사전은 확인된 펩티드 수 및 펩티돔의 증가에 기여하였다. 펩티도믹 연구는 세포에서 자연적으로 발생하는 펩티드를 자주 분석합니다. 여기서, 열불활성화에 기초한 샘플 준비 프로토콜이 기재되어 프로테아제 활성을 제거하고 온화한 조건으로 추출하므로 펩티드 결합 분열이 없다. 또한, 아민의 환원 메틸화에 의한 안정적인 동위원소 라벨링을 이용한 펩타이드의 상대적 양도 도시된다. 이 라벨링 방법은 시약이 시판되고, 다른 사람에 비해 저렴하고, 화학적으로 안정적이며, 단일 LC-MS 실행에서 최대 5개의 시료를 분석할 수 있기 때문에 몇 가지 장점이 있다.

질량 분광계에서 수행된 실행에서 얻은 결과는 질량 분광계 소프트웨어에서 열 수 있는 원시 데이터 파일에 저장됩니다. MS 스펙트럼에서, 2-5 라벨에 이르기까지 사용되는 라벨링 방식에 따라 표지된 펩티드를 나타내는 피크 그룹을 관찰할 수 있다. 예를 들어 그림 2에서 크로마토그래피 시간에서 검출된 피크 쌍은 동일한 실행에서 두 개의 동위원소 레이블만 사용된 실험에...

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Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

이 문서에서는 열 불활성화를 기반으로 한 시료 준비 방법을 설명하여 내인성 펩티드를 보존하여 분해 후 모독을 피하고, 동위원소 라벨링과 LC-MS를 사용하여 상대적 수량을 유지합니다.

펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

여기서, 우리는 천연 세포 내 펩티드를 보존하고, 세포및 조직에서 분해를 피하고, 동위원소 라벨링을 사용하여 펩타이드의 상대적 양에 이어 프로테아제의 빠른 열 비활성화에 기초한 교육 방법을 설명합니다. 이 라벨링 방법은 많은 장점이 있습니다. 시약은 시판되고 저렴하며 화학적으로 안정되며 단일 혈청에서 최대 5개의 샘플을 분석할 수 있습니다.15%FBS 와 1%페니실린 연쇄상 구균신을 포함하는 DMEM에 있는 15센티미터 접시에 있는 인간 신경 모세포종 세포를 육성하는 것으로 시작합니다. 5%의 이산화탄소 하에서 섭씨 37도에서 세포를 유지합니다. PBS로 세포를 두 번 씻은 다음 PBS 10 밀리리터를 추가하고 세포를 긁어 내고 15 밀리리터 튜브로 수집합니다.원심분리기는 세포를 800배 G로 5분간 제거하고 상부체를 제거합니다. 80°C에서 매우 정제된 탈이온수 1밀리리터로 펠릿을 다시 한 번 회수한 다음 튜브의 내용물을 2밀리리터 마이크로퍼지 튜브로 옮기습니다. 제브라피시의 열 불활성화 후, 2 밀리리터 미세 분리 튜브에서 전체 뇌를 수집하고 분석 할 때까지 영하 80도에서 동결.80°C에서 초정화 된 산화 수의 1 밀리리터에서 조직 샘플을 다시 중단하고 1 초의 30 펄스를 사용하여 프로브로 초음파 처리하십시오. 세포 용해 또는 균질 조직을 섭씨 80도에서 20 분 동안 배양 한 다음 얼음에서 10 ~ 30 분 동안 식힙니다. 샘플 볼륨 의 각 1 밀리리터에 대해 하나의 어금니 염산 스톡 솔루션 10 마이크로 리터를 추가합니다.20초 동안 소용돌이를 섞고 얼음에 15분 간 배양합니다. 세포 용액 또는 균주 조직을 12, 000 배 G에서 15 분 동안 섭씨 4도에서 원심분리합니다. 낮은 결합 단백질 미세 원심 분리기 튜브에서 상체를 수집하고 영하 80도에서 저장합니다.물과 원심분리기로 3분 동안 2, 300회 G로 초여과 장치를 청소한 다음 초여분 장치에서 물을 폐기합니다. 상체피 미리 세척된 10킬로달톤 컷오프 필터로 피펫을 넣고 섭씨 4도에서 냉장 원심분리기에서 회전합니다. 샘플의 pH를 확인합니다.100%의 아세토나이트 1밀리리터로 컬럼을 양립한 다음, 0.1%의 트리플루오로아세트산으로 5%아세토나이트 1밀리리터로 세척합니다. 컬럼에 샘플의 전체 부피를 적재하고 0.1%의 트리플루오로아세산으로 5%아세토나이트 1밀리리터로 컬럼을 세척합니다. 0.15%의 트리플루오로아세트산을 단백질 저결합 미세센트심분리기 튜브로 1.8 밀리리터의 1.8 밀리리터로 열로부터 펩티드를 엘테.30°C의 진공 원심분리기에서 샘플을 완전히 건조하고 디스플레이의 농도 시간을 모니터링합니다. 샘플을 영하 80도에 보관하십시오. 표준 펩타이드 농도 및 샘플의 100~200마이크로리터에서 펩티드 샘플을 백색 96웰 플레이트에 재차 리페드 시료를 재중단한다.0.2 개의 어금니 산염 버퍼의 25 마이크로 리터와 12.5 마이크로 리터의 플루오스카핀을 추가하십시오. 궤도 회전기에서 1분 동안 부드럽게 균질화합니다. 다음으로, 반응을 중지하기 위해 물 110 마이크로 리터를 추가합니다.분광로계의 설정을 조정한 다음 판을 읽습니다. 펩타이드의 최대 25 마이크로그램을 가진 각 펩티드 샘플에 1개의 어금니 트리메틸람모늄 브로마이드의 1/10제 부피를 추가합니다. pH가 5에서 8 사이인지 확인하여 필요한 경우 염산 또는 수산화 나트륨으로 조정하십시오.비증, 유정 포름알데히드 또는 탄소-13 의 미성수 포름알데히드의 4개의 마이크로리터를 추가합니다. 소용돌이를 통해 5초 동안 섞으세요. 펩타이드 시료에 시아노보로하이드라이드 나트륨 또는 중질나트륨 시아노보로하이드라이드 4마이크로리터를 첨가한다.그런 다음 소용돌이를 통해 샘플을 5초 동안 섞습니다. 펩티드 샘플을 실온에서 2시간 동안 연기 후드에 배양하여 30분마다 소용돌이를 가합니다. 비유정, 유족, 또는 탄소-13 유정 포름알데히드 나트륨 시아노보로하이드라이드 또는 유정된 나트륨 시아노보로하이드라이드의 첨가를 반복하여 각 첨가 후 소용돌이를 가한다.실온에서 밤새 연기 후드의 샘플을 배양합니다. 중탄산암보네이트 16마이크로리터를 넣고 소용돌이에 섞으세요. 샘플을 얼음 위에 놓습니다.5%의 포름산과 소용돌이의 8마이크로리터를 추가하여 5초 간 추가합니다. 펩티드 샘플을 결합하고, pH를 2-4 사이로 조정한 다음, 이전에 설명한 바와 같이 아세토닐및 삼플루오로아세트산을 사용하여 반전된 위상 정화 컬럼에 결합된 샘플을 탈염한다. 샘플을 섭씨 30도에서 진공 원심분리기에서 완전히 건조한 다음 영하 20도에 보관하십시오.표지된 펩타이드는 질량 스펙트럼을 사용하여 관찰된다. 적색 화살표는 각각 두 개의 서로 다른 샘플 S1과 S2 사이의 비교를 위해 두 개의 동위 원소 형태인 L1 및 L5로 표지된 상이한 펩타이드의 피크 쌍의 존재를 나타낸다. 3개의 상이한 샘플, S1, S2 및 S3에 존재하는 펩타이드의 질량 스펙트럼은 각각 L1, L3 및 L5 태그로 표지된다.쿼드러플렉스 라벨링이 수행되었습니다. 제어 샘플 S1 및 S3은 각각 L1 및 L3로 표지되었고 두 개의 실험 샘플, L2 및 S4로 표지된 S2 및 S4와 비교하여 상당한 차이를 L4.No 관찰하였다. 동위원소 라벨링은 주어진 프로테제 또는 펩티다아제에 대한 시험관 내 의 제품에 기판을 표시하는 데 사용되었다.신경리신 효소의 존재에서 변하지 않는 펩티드가 여기에 나타난다. 효소의 존재에서 사라지거나 감소하는 펩티드는 기질이며, 증가하는 펩타이드는 제품으로 간주됩니다. 이 그림은 세 가지 형태의 태그로 레이블이 부착된 데이터베이스 검색 엔진에 의해 수행되는 펩티드 서열을 식별하는 예입니다.정의되기 전에, 단단한 산성화로 인한 펩티드 결합을 깨는 것을 피하기 위해 샘플이 완전히 시원하다는 것을 확인하십시오. 또한, 초여제 장치의 세척이 필수적입니다. 질량 분광법은 펩티다아제 기판을 식별하여 상이한 실험 조건과 분석 연구를 위해 펩티드를 정량화하는 훌륭한 방법입니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

연구

생화학

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

대규모 다중 오믹스 게놈 전체 연관 연구 (Mo-GWAS) : 샘플 준비 및 정상화에 대한 지침

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM용 고온 시료 그리드 준비

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...