Name: sample preparation and relative quantitation using reductive methylation of amines for peptidomics studies
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies at JoVE.com

Разработка и использование методов, описанных здесь, были поддержаны грантом Бразильского национального исследовательского совета 420811/2018-4 (LMC); Гранты Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) и 21/01286-1 (MEME). Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке статьи.

Следующая процедура экстракции пептидов и восстановительного метилирования была адаптирована из ранее опубликованных процедур24,25,26,27. Этот протокол следовал руководящим принципам Национального совета по контролю...

<ol>
	<li>Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+era+of+'omics+unlimited.">The era of 'omics unlimited.</a> Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).</li><li>Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+peptides+and+peptidomics.">Plant peptides and peptidomics.</a> Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).</li><li>Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peptidomics+concept.">The peptidomics concept.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).</li><li>Dallas, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+peptidomics:+applications,+purification,+identification,+quantification,+and+functional+analysis.">Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis.</a> Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).</li><li>Chard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+radioimmunoassay+and+related+techniques+(3rd+Ed).">An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed).</a> FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).</li><li>Svensson, M., Sk&#246;ld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomics-based+discovery+of+novel+neuropeptides.">Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides.</a> Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).</li><li>Baggerman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomics.">Peptidomics.</a> Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).</li><li>Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+irradiation+increases+recovery+of+neuropeptides+from+brain+tissues.">Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues.</a> Peptides. 11, 1191-1197 (1990).</li><li>Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+neuropeptidomics+of+microwave-irradiated+mouse+brain+and+pituitary.">Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+yeast+peptidome+and+comparison+with+the+human+peptidome.">Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome.</a> PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).</li><li>Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Intracellular+Peptides+from+Zebrafish+(Danio+rerio)+Brain.">Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain.</a> Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).</li><li>Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mouse+brain+peptides+using+mass+spectrometry-based+peptidomics:+implications+for+novel+functions+ranging+from+non-classical+neuropeptides+to+microproteins.">Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins.</a> Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).</li><li>Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+analysis+of+human+cell+lines.">Peptidomic analysis of human cell lines.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).</li><li>De Araujo, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+peptides+in+cell+biology+and+pharmacology.">Intracellular peptides in cell biology and pharmacology.</a> Biomolecules. 9, 150 (2019).</li><li>Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+from+natural+or+rationally+designed+sources+can+be+used+in+overweight,+obesity,+and+type+2+diabetes+therapies.">Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies.</a> Molecules. 25 (5), 1093 (2020).</li><li>Sakaya, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+profiling+of+cerebrospinal+fluid+from+patients+with+intracranial+saccular+aneurysms.">Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms.</a> Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).</li><li>Fricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics:+General+considerations.">Quantitative peptidomics: General considerations.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).</li><li>Southey, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+quantitative+peptidomics+approaches+to+characterize+diurnal+variation+of+peptides+in+the+rat+suprachiasmatic+nucleus.">Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).</li><li>Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+using+SILAC:+Principles,+applications,+and+developments.">Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments.</a> Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).</li><li>Boonen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics+with+isotopic+and+isobaric+tags.">Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).</li><li>Gewehr, M. C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+thimet+oligopeptidase+in+the+regulation+of+energy+metabolism+and+diet-induced+obesity.">The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity.</a> Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).</li><li>Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+profile+of+zebrafish+brain+in+a+6-OHDA-induced+Parkinson+model.">Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model.</a> Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics+using+reductive+methylation+of+amines.">Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).</li><li>Tashima, A. K., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+peptidomics+with+five-plex+reductive+methylation+labels.">Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).</li><li>Che, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+neuropeptide+extraction+from+the+mouse+hypothalamus.">Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus.</a> Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).</li><li>Lyons, P. J., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomic+approaches+to+study+proteolytic+activity.">Peptidomic approaches to study proteolytic activity.</a> Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).</li><li>Udenfriend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescamine:+a+reagent+for+assay+of+amino+acids,+peptides,+proteins,+and+primary+amines+in+the+picomole+range.">Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range.</a> Science. 178 (4063), 871-872 (1972).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS:+powerful+software+for+peptide+de+novo+sequencing+by+tandem+mass+spectrometry.">PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAKS+DB:+de+novo+sequencing+assisted+database+search+for+sensitive+and+accurate+peptide+identification.">PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).</li><li>Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+brain+neuropeptidomics:+tissue+collection,+protease+inhibition,+neuropeptide+extraction,+and+mass+spectrometric+analysis.">Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).</li><li>Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+mass+spectrometry-based+peptidomic+approaches.">Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).</li><li>Ross, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).</li></ol>

В большинстве исследований пептидомики одним из критических этапов, без сомнения, является пробоподготовка, которую следует тщательно выполнять, чтобы избежать присутствия пептидных фрагментов, генерируемых протеазами через несколько минут после вскрытия. Первоначальные исследова?...

«Омические» науки характеризуются глубоким анализом набора молекул, таких как ДНК, РНК, белки, пептиды, метаболиты и т.д. Эти крупномасштабные наборы данных (геномика, транскриптомика, протеомика, пептидомика, метаболомика и т. д.) произвели революцию в биологии и привели к продвинутому пониманию биологических процессов1. Термин пептидомика начал вводиться в начале 20 века, и некоторые авторы называли его ветвью протеомики2. Однако пептидомика имеет отличительные особенности, где основной интерес заключается в исследовании содержания естественно генерируемых пептидов в ходе клеточных процессов, а также характеристике биологической активности этих молекул3,4.
Первоначально исследования биологически активных пептидов были ограничены нейропептидами и гормональными пептидами через деградацию Эдмана и радиоиммуноанализ. Однако эти методики не позволяют провести глобальный анализ, в зависимости от выделения каждого пептида в высоких концентрациях, времени генерации антител, кроме возможности перекрестной реактивности5.
Анализ пептидомики стал возможен только после нескольких достижений в области жидкостной хроматографии, связанной с масс-спектрометрией (LC-MS) и проектами генома, которые предоставили комплексные пулы данных для исследований протеомики / пептидомики6,7. Кроме того, необходимо было установить специфический протокол экстракции пептидов для пептидов, потому что первые исследования, которые анализировали нейропептиды в глобальном масштабе в образцах мозга, показали, что на обнаружение влияет массивная деградация белков, которая происходит в основном в этой ткани через 1 мин после вскрытия. Присутствие этих пептидных фрагментов маскировало сигнал нейропептида и не представляло собой пептидом in vivo. Эта проблема решалась в основном применением быстрой нагревательной инактивации протеаз с помощью микроволнового облучения, что резко уменьшило присутствие этих фрагментов артефактов и позволило не только идентифицировать фрагменты нейропептидов, но и выявило наличие набора пептидов из цитозольных, митохондриальных и ядерных белков, отличающихся от деградома6,8,9.
Эти методологические процедуры позволили расширить пептидом за пределы известных нейропептидов, где сотни внутриклеточных пептидов, генерируемых главным образом действием протеасом, были идентифицированы в дрожжах10, рыбках данио11, тканях грызунов12 и клетках человека13. Было широко показано, что десятки этих внутриклеточных пептидов обладают как биологической, так и фармакологической активностью14,15. Кроме того, эти пептиды могут быть использованы в качестве биомаркеров заболевания и, возможно, имеют клиническое значение, как показано в спинномозговой жидкости у пациентов с внутричерепными мешковидными аневризмами16.
В настоящее время, помимо идентификации пептидных последовательностей, можно с помощью масс-спектрометрии получить данные абсолютного и относительного количественного определения. В абсолютном количественном определении уровни пептидов в биологическом образце сравниваются с синтетическими стандартами, в то время как в относительном количественном определении уровни пептидов сравниваются между двумя или более образцами17. Относительное количественное определение может быть выполнено с использованием следующих подходов: 1) «без меток»18; 2) метаболическая маркировка in vivo или 3) химическая маркировка. Последние два основаны на использовании стабильных изотопных форм, включенных в пептиды19,20. В анализе без меток уровни пептидов оцениваются с учетом силы сигнала (спектральных показателей) во время LC-MS18. Однако изотопная маркировка может получить более точные относительные уровни пептидов.
Во многих пептидомических исследованиях в качестве химической маркировки использовался триметиламмоний бутират (TMAB), а в последнее время было использовано восстановительное метилирование аминов (RMA) с дейтерированными и невейтерированными формами формальдегида и реагентов цианоборогидрида натрия11,21,22. Однако этикетки TMAB коммерчески недоступны, а процесс синтеза очень трудоемкий. С другой стороны, в RMA реагенты коммерчески доступны, недороги по сравнению с другими этикетками, процедура проста в выполнении, а меченые пептиды стабильны23,24.
Использование RMA включает в себя формирование основания Шиффа, позволяя пептидам реагировать с формальдегидом с последующей реакцией восстановления через цианоборогидрид. Эта реакция вызывает диметилирование свободных аминогрупп на N-концевых и лизиновых боковых цепях и монометилатах N-концевых пролинов. Поскольку остатки пролина часто редки на N-конце, практически все пептиды со свободными аминами на N-конце помечены двумя метильными группами23,24,25.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kDa cut-off filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1000291000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>analytical column (EASY-Column)</td>
			<td>EASY-Column</td>
			<td>(SC200)</td>
			<td>&#160;10 cm, ID75 &#181;m, 3 &#181;m, C18-A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-13C, d2, solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>596388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-d2 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>Q216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid - HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind-Protein retention tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030108116-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velos</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LTQ Velos</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>NN-ST67HSRU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n Easy-nLC II nanoHPLC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEAKS Studio</td>
			<td>Bioinformatics Solutions Inc.</td>
			<td>VERSION 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>3002</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>precolumn (EASY-Column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>(SC001)</td>
			<td>2 cm, ID100 &#181;m, 5 &#181;m, C18-A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z326K</td>
			<td>for conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Vision</td>
			<td>VS15000CFNII</td>
			<td>for microtubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed-phase cleanup columns&#160;&#160; (Oasis HLB 1 cc Cartridge)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>Oasis HLB 1 cc Cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborodeuteride - NaBD3CN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride - NaBH3CN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td>NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q55-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard peptide</td>
			<td>Proteimax</td>
			<td></td>
			<td>amino acid sequence: LTLRTKL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium buffer - TEAB 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid - TFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra purified water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Direct-Q 3UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge</td>
			<td>GeneVac</td>
			<td>MiVac DNA concentrator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Cientec</td>
			<td>266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30965</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and relative quantitation using reductive methylation of amines for peptidomics studies

Пептидомику можно определить как качественный и количественный анализ пептидов в биологическом образце. Его основные применения включают идентификацию пептидных биомаркеров заболевания или экологического стресса, идентификацию нейропептидов, гормонов и биологически активных внутриклеточных пептидов, обнаружение антимикробных и нутрицевтических пептидов из гидролизатов белка и могут быть использованы в исследованиях для понимания протеолитических процессов. Недавний прогресс в подготовке образцов, методах разделения, методах масс-спектрометрии и вычислительных инструментах, связанных с секвенированием белка, способствовал увеличению числа идентифицированных пептидов и характеризуемых пептидов. Пептидомические исследования часто анализируют пептиды, которые естественным образом генерируются в клетках. Здесь описан протокол пробоподготовки, основанный на термоинактивации, который исключает активность протеазы и экстракцию в мягких условиях, поэтому нет расщепления пептидных связей. Кроме того, показано относительное количественное определение пептидов с использованием метки стабильных изотопов путем восстановительного метилирования аминов. Этот метод маркировки имеет некоторые преимущества, поскольку реагенты коммерчески доступны, недороги по сравнению с другими, химически стабильны и позволяют анализировать до пяти образцов за один прогон LC-MS.

Результаты, полученные в результате запусков, проведенных на масс-спектрометре, хранятся в необработанных файлах данных, которые могут быть открыты в программном обеспечении масс-спектрометра. В спектрах MS можно наблюдать пиковые группы, представляющие меченые пептиды по используемо...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies at JoVE.com

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

В этой статье описывается метод пробоподготовки, основанный на тепловой инактивации для сохранения эндогенных пептидов, избегающих деградации посмертно, с последующим относительным количественным определением с использованием изотопной маркировки плюс LC-MS.

Пробоподготовка и относительное количественное определение с использованием восстановительного метилирования аминов для исследований пептидомики

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Здесь мы описываем учебный метод, основанный на быстрой тепловой инактивации протеазы для сохранения естественных внутриклеточных пептидов, предотвращения деградации в клетках и тканях с последующим относительным количественной оценкой пептидов с использованием изотопной маркировки. Этот метод маркировки имеет так много преимуществ. Реагенты коммерчески доступны, недороги, химически стабильны и позволяют анализировать до пяти образцов в одной сыворотке.Начните с культивирования клеток нейробластомы человека в 15-сантиметровой чашке в DMEM, содержащей 15% FBS и 1% пенициллина стрептомицина. Поддерживайте клетки на уровне 37 градусов по Цельсию под 5% углекислого газа. Дважды промыть клетки PBS, затем добавить 10 миллилитров PBS, соскоблить клетки и собрать их в 15-миллилитровую трубку.Центрифугируйте клетки в 800 раз G в течение пяти минут и удалите супернатант. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре ультраочищенной деионизированной воды при 80 градусах Цельсия, затем перенесите содержимое трубки в двухмиллилитровую микрофьюжную трубку. После тепловой инактивации рыбок данио соберите весь мозг в двухмиллилитровую микрофьюжную трубку и заморозьте его при минус 80 градусах Цельсия до анализа.Повторно суспендируйте образец ткани в одном миллилитре ультраочищенной деионизированной воды при 80 градусах Цельсия и обработайте ультразвуком с помощью зонда, используя 30 импульсов в одну секунду. Инкубируйте клеточный лизат или гомогенатную ткань при температуре 80 градусов Цельсия в течение 20 минут, затем охладите ее на льду в течение 10-30 минут. Добавьте 10 микролитров одного раствора молярной соляной кислоты на каждый миллилитр объема образца.Перемешайте путем вихря в течение 20 секунд и высиживайте на льду в течение 15 минут. Центрифугируйте клеточный лизат или гомогенатную ткань в 12 000 раз G в четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Соберите супернатант в низкосвязывающие белковые микроцентрифужные трубки и храните его при минус 80 градусах Цельсия.Очистите ультрафильтрационные устройства водой и центрифугой при 2 300 G в течение трех минут, затем выбросьте воду из ультрафильтрационного устройства. Пипетка супернатанта в предварительно промытый отсечный фильтр на 10 килодалтонов и вращение в охлажденной центрифуге при четырех градусах Цельсия. Проверьте pH образца.Уравновешивают колонку одним миллилитром 100%-ацетонитрила, затем промыть ее одним миллилитром 5%-ацетонитрила с 0,1% трифторуксусной кислотой. Загрузите весь объем образца в колонну и промыть колонну одним миллилитом 5%ацетонитрила с 0,1% трифторуксусной кислотой. Элюировать пептиды из колонки с 1,8 миллилитрами 1%ацетонитрила с 0,15% трифторуксусной кислоты в белковые низкосвязывающие микроцентрифужные трубки.Полностью высушите образец в вакуумной центрифуге при температуре 30 градусов Цельсия и контролируйте время концентрации на дисплее. Храните образец при минус 80 градусах Цельсия. Повторное суспендирование пептидных образцов в 100-200 микролитрах ультраочищенной воды и пипетки 2,5 микролитра стандартных концентраций пептидов и образцов на белую 96-луночную пластину.Добавьте 25 микролитров 0,2 молярного фосфатного буфера и 12,5 микролитра флуорескамина. Мягко гомогенизируйте в течение одной минуты на орбитальном ротаторе. Затем добавьте 110 микролитров воды, чтобы остановить реакцию.Отрегулируйте настройки на спектрофлуфторметре, затем считайте пластину. Добавьте 1/10-й объем одного молярного триметиламмония бромида к каждому образцу пептида с содержанием пептида до 25 микрограммов. Убедитесь, что рН составляет от пяти до восьми, при необходимости регулируя с помощью соляной кислоты или гидроксида натрия.Добавьте четыре микролитра недетерированного, дейтерированного формальдегида или дейтерированного формальдегида углерода-13. Перемешивайте в течение пяти секунд путем вихря. Добавьте четыре микролитра цианоборогидрида натрия или дейтерированного цианоборогидрида натрия в образец пептида.Затем перемешайте образец в течение пяти секунд путем вихря. Инкубируйте образец пептида в вытяжке в течение двух часов при комнатной температуре, вихря каждые 30 минут. Повторяют добавление недейтерированного, дейтерированного или дейтерированного формальдегида углерода-13 и цианоборогидрида натрия или дейтерированного цианоборогидрида натрия, вихревого после каждого добавления.Инкубируйте образцы в вытяжном шкафу на ночь при комнатной температуре. Добавьте 16 микролитров бикарбоната аммония и перемешайте путем вихря. Поместите образец на лед.Добавьте восемь микролитров 5% муравьиной кислоты и вихрь еще на пять секунд. Объедините образцы пептидов, отрегулируйте рН между двумя и четырьмя, затем обессоливайте объединенные образцы на колоннах очистки обратной фазы с использованием ацетонитрила и трифторуксусной кислоты, как описано ранее. Полностью высушите образец в вакуумной центрифуге при 30 градусах Цельсия, затем храните его при минус 20 градусах Цельсия.Меченые пептиды наблюдаются с помощью масс-спектров. Красные стрелки указывают на наличие пиковых пар различных пептидов, меченных двумя изотопными формами, L1 и L5, для сравнения между двумя различными образцами S1 и S2 соответственно. Масс-спектр пептида, присутствующего в трех различных образцах, S1, S2 и S3, помеченных метками L1, L3 и L5 соответственно, показан здесь.Выполнена квадруплексная маркировка. Контрольные образцы S1 и S3 маркировали L1 и L3 соответственно и сравнивали с двумя экспериментальными образцами, S2 и S4 с маркировкой L2 и L4.No наблюдалась существенная разница. Изотопная маркировка использовалась для показа субстратов в продуктах in vitro для данной протеазы или пептидазы.Здесь показан пептид, который не изменяется в присутствии фермента нейролизина. Пептиды, которые исчезают или уменьшаются в присутствии фермента, являются субстратами, в то время как те, которые увеличиваются, считаются продуктами. Рисунок является примером идентификации пептидной последовательности, выполняемой поисковой системой базы данных, помеченной тремя различными формами тегов.Прежде чем он будет определен, убедитесь, что образец полностью прохладный, чтобы избежать разрыва пептидных связей, вызванных твердым подкислением. Кроме того, необходима очистка ультрафильтрационных устройств. масс-спектрометрия является отличным методом количественной оценки пептидов между различными экспериментальными условиями и для аналитических исследований путем выявления пептидазных субстратов.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Универсальный выборочный держатель для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии с минимальным рассеянием фона

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Подготовка образца плазмы для масс-спектрометрии с использованием автоматизированной рабочей станции

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Пример ы подготовки к протеомики объекта представления и последующего анализа данных

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Заводская пробоподготовка для измерения содержания нуклеозидов/нуклеотидов с помощью ВЭЖХ-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Крупномасштабные мультиомные исследования геномных ассоциаций (Mo-GWAS): руководство по подготовке и нормализации образцов

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...