Name: an explant system for time-lapse imaging studies of olfactory circuit assembly in drosophila
Uploaded: 2021-10-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila at JoVE.com

我们感谢N. Özel和R. Hiesinger对外植体文化的建议;M. Wagner为双光子显微镜提供技术帮助;D.J. Luginbuhl用于产生转基因苍蝇;D. 弗里德曼对斐济软件分析提出建议;Y. Ge协助飞行工作;C. McLaughlin和K.K.L. Wong对手稿的评论。L.L.是霍华德休斯医学研究所的研究员。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款1K99DC01883001（到T.L.）和R01-DC005982（到L.L.）的支持。

1. 试剂的制备
注意：除非另有说明，否则本协议中的所有步骤均在室温（20-25°C）下进行。
<ol><li>为了准备培养皿用于在延时成像期间固定外植体，在60mm x 15mm培养皿的底面上放置0.5cm厚的Sylgard（使用前以10：1的比例彻底混合两种液体组分），并使其在室温下固化48小时（图2A，在下面的文本中称为Sylgard板）。</li>
	<li>要准备用于固定该板?...

<ol>
	<li>Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+molecules+of+neuronal+wiring:+a+primer.">Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).</li><li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+smell+and+taste+in+Drosophila.">Molecular architecture of smell and taste in Drosophila.</a> Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).</li><li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system.">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li><li>Bentley, D., Caudy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pioneer+axons+lose+directed+growth+after+selective+killing+of+guidepost+cells.">Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells.</a> Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).</li><li>Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axon+divergence+in+the+optic+chiasm:+dynamics+of+growth+cone+behavior+at+the+midline.">Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline.</a> Journal of Neuroscience. 14 (11), 7024-7039 (1994).</li><li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axons+with+and+without+their+somata,+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos:+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo.">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li><li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, 10721 (2015).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bases+of+olfactory+circuit+assembly+revealed+by+systematic+time-lapse+imaging.">Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging.</a> Cell. 184, 5107-5121 (2021).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998 (2014).</li><li>Liu, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+the+cell+in+its+native+state:+Imaging+subcellular+dynamics+in+multicellular+organisms.">Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms.</a> Science. 360 (6386), (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+adaptive+optical+recovery+of+optimal+resolution+over+large+volumes.">Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes.</a> Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).</li><li>Kohl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+tissue+staining+with+chemical+tags.">Ultrafast tissue staining with chemical tags.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).</li><li>Sutcliffe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-Generation+Drosophila+Chemical+Tags:+Sensitivity,+Versatility,+and+Speed.">Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed.</a> Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).</li><li>Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Janelia+Fluor+HaloTag+and+SNAP-Tag+Ligands+and+Their+Use+in+Cellular+Imaging+Experiments.">Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments.</a> Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).</li></ol>

果蝇触角-脑外植体保持嗅觉回路的正常靶向。我们确实注意到，与体内相比，离体发育慢2倍。值得注意的是，外植体系统不保留上颌触诊，上颌触诊具有六种类型的ORN。为确保体外恢复正常发育，在外植体解剖期间需要避免触角神经的拉伸。在离体培养过程中，细菌生长通常会导致嗅路发育停滞。因此，在成像之前对培养皿和针进行彻底灭菌并保持成像室的清?...

神经元精确地相互连接，形成对大脑正常功能至关重要的回路。100多年来，神经科学家一直试图以极高的精度了解神经突起如何向中间和最终目标延伸。因此，他们已经确定了编码神经元过程1的引导线索的重要基因。 果蝇 嗅觉系统为研究这一过程提供了一个极好的模型，因为嗅觉受体神经元（ORN，初级感觉神经元）投射到50个具有典型大小，形状和相对位置的可识别肾小球，其中它们与来自50种类型的二阶投影神经元（PNs）的树突形成突触连接，每个树突将树突发送到50个肾小球2 中的一个（图1A).因此，在苍蝇嗅觉系统中以突触（肾小球）分辨率鉴定突变表型相对容易。这导致了调节嗅觉回路组装的重要基因的发现3。
苍蝇嗅觉回路的组装依赖于时间和空间协调的发展过程3.ORN和PN获得不同的细胞命运，这为其布线特异性设置了程序。接下来，PN树突预涂了触角叶（图1B）。然后，ORN的轴突环绕同侧触角叶并穿过大脑的中线到达对侧触角叶。随后，ORN轴突侵入ipsi和对侧触角叶，并在特定肾小球中与其伴侣PN的树突形成突触。该嗅觉电路组装的粗略模型是基于在开发过程中从中间时间点表征固定样品而提出的。时间分辨率差，无法从固定组织发育过程中遵循相同的神经元过程，这限制了对电路组装过程的机制理解。
在体内实时成像ORN和PN过程在技术上具有挑战性，因为布线过程发生在蛹阶段的前半部分，当触角叶被蛹壳内不透明的脂肪体包围时。因此，不可能从完整的蛹直接成像发育中的嗅觉回路。离体培养的解剖组织可以规避组织混浊度，并已成功用于研究神经发育4，5，6。使用类似的离体外植体培养策略来研究蛹脑中的神经元布线的挑战在于它是否概括了培养条件下精确的神经元靶向。根据先前报道的苍蝇眼脑复合物7的离体培养条件，最近开发了一种包含整个蛹脑，触角和连接触角神经完整的外植体，其保留了嗅觉回路的精确靶向，并且可以以每20分钟的频率进行基于双光子显微镜的实时成像长达24小时8.在这里，描述了外植体培养和成像的详细方案。外植体系统为研究嗅觉回路和中枢大脑中潜在其他回路的组装提供了一种强大的方法。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20-hydroxyecdysone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H5142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Ti:Sapphire laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Coherent MRU X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Prairie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen cylinder</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>OX M-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0162601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscopy</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water immerse objective (20X)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-9800-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an explant system for time-lapse imaging studies of olfactory circuit assembly in drosophila

~神经元精确地相互连接，形成对大脑正常功能至关重要的回路。 果蝇 嗅觉系统为研究这一过程提供了一个极好的模型，因为来自触角和上颌触缘的50种类型的嗅觉受体神经元（ORN）将其轴突投射到触角叶中的50个可识别的肾小球，并与来自50种类型的二阶投射神经元（PNs）的树突形成突触连接。以前的研究主要集中在识别使用固定组织调节嗅觉回路中精确靶向的重要分子。在这里，描述了一种触角 - 脑外植体系统，该系统概括了培养物中嗅觉回路组装的关键发育里程碑。通过解剖外部角质层并清洁覆盖发育中的蛹脑的不透明脂肪体，可以使用双光子显微镜收集来自活脑的单个神经元的高质量图像。这允许对来自活组织的单个ORN轴突靶向进行延时成像。这种方法将有助于揭示先前确定的重要基因的重要细胞生物学背景和功能，并确定支撑电路组装动态过程的机制。

ORN轴突在18小时至36小时APF之间到达触角叶。然后，它们在触角叶上导航，穿过中线，并支配肾小球。 视频1 是一个具有代表性的视频，显示了几个可单独识别的轴突的整个过程，以每20分钟的频率拍摄24小时。在使用TurboReg注册之前，随着大脑的发育，轴突表现出一些横向漂移（视频的前半部分）。配准后，漂移被校正（视频的后半部分）。
为了从同一外植体中?...

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An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

该协议描述了用于研究嗅路组装的触角脑外植体系统的解剖程序，培养条件和现场成像。

一种用于果蝇嗅觉回路组装延时成像研究的外植体系统

~Neurons are precisely interconnected to form circuits essential for the proper function of the brain. The Drosophila olfactory system provides an ...

该协议提出了一种从发育中的大脑在单个轴突水平上实时成像，飞行嗅觉电路组装的方法。解剖以清洁覆盖发育中的大脑的组织，我们可以从内部大脑收集高质量的图像。这种方法为电路开发的细胞生物学基础提供了有价值的见解。它可以很容易地修改，以研究其他电路的发展。一个人在显微切割中进行稳定的手部控制需要一些时间。更多的练习会有所帮助。首先，通过在培养皿的底面上放置0.5厘米厚的Sylgard并使其在室温下固化48小时，准备培养皿以在延时成像期间移动外植体。要准备微型针，以便使用镊子固定该板上的外植体，请将多个微型针固定在胶带上，使锋利的末端在一侧对齐，并用剪刀切割两毫米的尖端。然后使用镊子，将切割的微针插入预制的Sylgard板的Sylgard层中。使用刷子收集白色蛹，在一小时内形成蛹，并将它们转移到新的小瓶中。将蛹在37摄氏度回火的水浴中孵育40分钟，以诱导随机类型的稀疏ORN克隆。热休克后，将小瓶置于25摄氏度下30小时，使蛹在蛹形成后30小时老化。然后按照文本手稿中的描述准备用于外植的培养基，并在四摄氏度下储存。在成像当天，将胎牛血清，人胰岛素储备溶液和20羟蜈酮储备溶液溶解在乙醇中，加入含有45毫升施耐德果蝇培养基的50毫升小瓶中。充分混合并将15毫升的全培养基转移到新的50毫升锥形管中，并将剩余的全培养基在4摄氏度下储存一周。然后用石蜡膜覆盖含有全介质的管开口，并通过无菌的五毫升移液器尖端以每秒一个气泡的速度泵送液体表面下的氧气气泡，使介质氧化20至30分钟。接下来，用70%乙醇对解剖井表面和先前制备的Sylgard板进行灭菌，并在使用前让它们干燥。使用刷子将30小时的APF蛹转移到薄纸上，使蛹的外表面干燥五分钟。在载玻片上涂上双面胶带后，小心地将干燥的蛹贴在胶带的粘性表面上，背侧朝上。用刷子轻轻按压蛹，将腹侧正确连接到胶带上，而不会损坏蛹。从侧面在棕色蛹壳和蛹之间插入一个尖锐的镊子尖端，并小心地将棕色蛹壳通过一条线到蛹的后端。一旦打开棕色蛹壳，使用镊子轻轻握住蛹并将其转移到含有一毫升含氧全介质的解剖孔中。将蛹浸入介质中，将其沉入井底。要从蛹中解剖天线脑外植体，用镊子轻轻握住蛹，并用一对微剪刀，从蛹的后侧形成一个小孔，释放蛹内部的高压。从孔开始，穿过腹侧中线到颈部，然后切开颈部的周长，将头部与蛹的身体分离，并将身体放在不同的井中。接下来，切开覆盖大脑背侧的透明角质层，将脂肪体暴露在大脑顶部，确保保持视网膜和天线附着的角质层，同样，从大脑的腹侧切割角质层。使用P10移液器将培养基移向头部背侧和腹侧的开放区域，以轻轻冲洗掉覆盖大脑和天线的脂肪体。为了研究双侧ORN轴突或ORN轴突与PN树突靶向的相互作用，通过在角质层和大脑之间小心地放置微剪刀的刀片并切断感兴趣的触角神经，在阶段切断触角神经。为了将解剖的外植体转移到Sylgard板上，在Sylgard表面上放置约200微升的含氧全介质液滴。通过200微升移液器吸头将来自解剖躯干的脂肪体移液几次，用于涂覆内表面，以防止外植体在从解剖孔转移到Sylgard板上的介质液滴的过程中粘附在移液器尖端上。使用镊子将外植体固定在两个光学波瓣的Sylgard层上，然后小心地将Sylgard板放置在成像站上，用胶带固定板，并使用P1000移液器将10毫升含氧全培养基添加到Sylgard板中。ORN轴突在18小时至36小时APF之间到达触角叶，然后导航触角叶，穿过中线并创新肾小球。在注册之前，轴突随着大脑的发育而表现出一些横向漂移，并且在注册后，漂移被纠正。通过神经矿标志物和钙粘蛋白的免疫染色揭示了提取的ORN轴突的肾小球特性。通过与内叶图比较，可以确定每个肾小球的身份。在离体培养过程中，细菌生长通常会导致嗅觉回路的静止发育。因此，在成像前对培养皿和销进行彻底消毒并保持成像室的清洁和隔离非常重要。为了实现更高的空间时间分辨率，该外植体系统可以使用更先进的显微镜，自适应光学晶格光显微镜进行成像。虽然这里以工厂电路开发为例，但该系统可以扩展到研究中枢大脑中的其他电路和发育过程。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

评定神经连接的形成在共培养体系的光遗传学方法

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

科研

发育生物学

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

捕获组织修复的斑马鱼幼虫与时间推移明视立体显微镜

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

分析<em&gt;在体内</em&gt;细胞迁移使用细胞移植和时间推移成像在斑马鱼胚胎

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

配备了光学切片与成像定时使用解剖显微镜斑马鱼肾脏发展分析

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

水下滤纸三明治长期<em&gt;防爆大毛</em&gt;早期鸡胚时间推移成像

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

一个<em&gt;离体</em&gt;方法培养大鼠肠系膜微血管网络的时间推移成像

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

多光子时间推移成像实时可视化发展： 迁移神经嵴细胞在斑马鱼胚胎中的可视化

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

主动脉-性腺-肾外植体培养体系在发育性造血中的应用

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

粘附细胞培养的时间推移荧光显微镜对蛋白质降解率的单细胞定量研究

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

果蝇分子和免疫组化分析制备周围嗅组织的研制

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...