Name: dissection and immunostaining of larval salivary glands from anopheles gambiae mosquitoes
Uploaded: 2021-09-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Johns Hopkins Malaria Research Institute for tilgang til og oppdrett av An. gambiae larver.

1. Utarbeidelse av løsninger og verktøy
<ol><li>Utarbeidelse av disseksjonsløsning<ol>
<li>For å forberede disseksjonsløsningen, tilsett 2,5 ml 100% etanol til 7,5 ml destillert H2O i et 15 plastrør. Snu røret 3 ganger for å blande. MERK: Denne løsningen kan oppbevares ved romtemperatur i flere uker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tilberedning av 10x fosfatbufret saltvannsbestand (PBS)<ol>
<li>For å klargjøre 10x PBS-lager, tilsett 17,8 g Na2HPO4• 2H2...

<ol>
	<li>World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660">https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660</a> (2020)</li><li>Feachem, R. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+eradication+within+a+generation:+ambitious,+achievable,+and+necessary.">Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary.</a> Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553 (2020).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Rostami, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+gene+drive+technology+to+control+transmission+of+vector-borne+parasitic+infections.">CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections.</a> Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).</li><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coverage+and+system+efficiencies+of+insecticide-treated+nets+in+Africa+from+2000+to+2017.">Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017.</a> Elife. 4, 09672 (2015).</li><li>Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+mosquito+salivation+in+blood+feeding+of+Aedes+aegypti.">Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti.</a> Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).</li><li>Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mosquito+saliva+in+blood+vessel+location.">Role of mosquito saliva in blood vessel location.</a> Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).</li><li>Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+malaria+infection+in+transgenic+Anopheline+mosquitoes+lacking+salivary+gland+cells.">Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells.</a> PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).</li><li>Rishikesh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+development+of+the+salivary+glands+and+their+chromosomes+in+the+larvae+of+Anopheles+stephensi+sensu+stricto.">Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto.</a> Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).</li><li>Jensen, D. V., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+salivary+glands+in+Anopheles+albimanus+Wiedemann+(Diptera,+Culicidae).">The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae).</a> Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).</li><li>Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+cellular+morphologies+during+lumen+maturation+in+Anopheles+gambiae+larval+salivary+glands.">Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands.</a> Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).</li><li>MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/Portals/2/">https://www.beiresources.org/Portals/2/</a> (2015)</li><li>Wells, M. B., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+cellular+architecture+in+the+Asian+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 617 (2015).</li><li>Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+maturation+and+duct+formation+in+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).</li><li>Wells, M. B., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+salivary+gland+architecture+shapes+plasmodium+sporozoite+availability+for+transmission.">Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission.</a> mBio. 10 (4), 01238 (2019).</li><li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The physiology of mosquitoes. , (1963).</li><li>Imms, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+larval+and+pupal+stages+of+Anopheles+maculipennis,+meigen.">On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen.</a> Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).</li><li>Favia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+of+the+genus+Asaia+stably+associate+with+Anopheles+stephensi,+an+Asian+malarial+mosquito+vector.">Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).</li><li>Neira Oviedo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+transcriptome+of+Anopheles+gambiae+(Diptera:+Culicidae)+larvae:+A+microarray-based+analysis.">The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).</li><li>Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonic+anhydrases+and+anion+transport+in+mosquito+midgut+pH+regulation.">Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation.</a> Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).</li><li>Linser, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slc4-like+anion+transporters+of+the+larval+mosquito+alimentary+canal.">Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal.</a> Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).</li></ol>

Protokollen beskrevet heri ble tilpasset fra en Drosophila SG disseksjonsprotokoll og en voksen mygg disseksjonsprotokoll14,15,16. Imidlertid trengte de fleste markører ikke inn i kjellermembranen (data ikke vist) ved bruk av voksen disseksjon og SG-fargingsmetoder. Tilpasninger av voksenprotokollen inkluderte dissekering av kjertlene i en 25% EtOH-løsning, vasking av kjertlene med en kombinasjon av MeOH og issyre, og å ha en...

Malaria er en stor folkehelsetrussel som forårsaker nesten 230 millioner infeksjoner og anslagsvis 409 000 dødsfall i 20191. De fleste dødsfall er i Afrika sør for Sahara og er forårsaket av parasitten Plasmodium falciparum, hvis insektvektor er Anopheles gambiae, emnet for denne videodemonstrasjonen. Selv om tallene indikerer et betydelig fall i årlig dødsrate siden århundreskiftet (> 300.000 færre årlige dødsfall), er den lovende nedgangen i sykdomsraten observert fra 2000 til 2015 avsmalnende, noe som tyder på behovet for nye tilnærminger til å begrense sykdomsoverføring2. Blant lovende tilleggsstrategier for å kontrollere og muligens eliminere malaria er rettet mot myggvektorkapasitet ved hjelp av CRISPR / Cas9-basert genredigering og gen-drive3,4,5. Faktisk er det målrettingen av myggvektoren (gjennom utvidet bruk av langvarige insektmiddelbehandlede sengenett) som har hatt størst innvirkning på å redusere sykdomsoverføring6.
Kvinnelige mygg kjøper Plasmodium gametocytter fra et infisert menneske under et blodmåltid. Etter befruktning, modning, midgut epiteltraversering, befolkningsutvidelse og hemocoelnavigasjon i sine obligatoriske myggverter, invaderer hundrevis til titusenvis av Plasmodium-sporozoitter myggsmulene og fyller sekretoriske hulrom i de bestanddelene sekretoriske celler. Når de er inne i sekretoriske hulrom, har parasittene direkte tilgang til spyttkanalen og er dermed klar for overføring til en ny virveldyrvert ved neste blodmel. Fordi bærekraftsmål er avgjørende for overføring av malariafremkallende sporozoitter til sine menneskelige verter, og laboratoriestudier tyder på at bærekraftsmålene ikke er avgjørende for blodfôring, myggoverlevelse eller fecundity7,8,9, representerer de et ideelt mål for overføringsblokkerende tiltak. Voksen mygg SGs dannes som en utarbeidelse av "duct bud" rester i larval SGs som vedvarer utover tidlig pupal SG histolyse10, noe som gjør larval SG et ideelt mål for intervensjoner for å begrense overføring av sykdom i voksenstadiet.
Karakterisering av larvestadiet av SG-utvikling kan bidra til å utvikle ikke bare en bedre forståelse av morfologi og funksjonelle tilpasninger, men kan også bidra til å vurdere nye intervensjoner som retter seg mot dette organet gjennom genredigering av viktige SG-regulatorer. Fordi alle tidligere studier av larval spyttkjertelarkitektur predate immunostaining og moderne bildeteknikker10,11, har vi utviklet en protokoll for isolering og farging av spyttkjertler med en rekke antistoffer og cellemarkører12. Denne videoen demonstrerer denne tilnærmingen til utvinning, fiksering og farging av larval SGs fra Anopheles gambiae L4 larver for konfikal avbildning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Na2HPO4 &#8226; 2H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush with soft bristles</td>
			<td>Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set</td>
			<td>B08LH63D89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips (22 x 50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (DNA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EX0276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman P200 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jewelers forceps, Dumont No. 5</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>58221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1414209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Amazon (Sally Hansen)</td>
			<td>B08148YH9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red (lipid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N1142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels/wipes</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-7128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate (to make putty plate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Tips E200ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Transfer Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S304671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab</td>
			<td>Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone resin and curing agent for putty plate</td>
			<td>Dow Chemicals - Ximeter Silicone</td>
			<td>PMX-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides, frosted on one end for labelling</td>
			<td>VWR&#160; 20 X 50 mm</td>
			<td>48393-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>W834</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunostaining of larval salivary glands from anopheles gambiae mosquitoes

Mygg spyttkjertler (SGs) er et nødvendig gateway organ for overføring av insektbårne patogener. Sykdomsfremkallende midler, inkludert virus og Plasmodium-parasittene som forårsaker malaria, akkumuleres i sekretoriske hulrom av SG-celler. Her er de klar for overføring til vertebratvertene sine under et påfølgende blodmåltid. Ettersom voksne kjertler dannes som en utarbeidelse av larval SG-kanalknopprester som vedvarer utover tidlig pupal SG-histolyse, er larval SG et ideelt mål for intervensjoner som begrenser sykdomsoverføring. Forståelse av larval SG-utvikling kan bidra til å utvikle en bedre forståelse av morfologi og funksjonelle tilpasninger og hjelpe til med å vurdere nye intervensjoner som retter seg mot dette organet. Denne videoprotokollen demonstrerer en effektiv teknikk for å isolere, fikse og farge larval SGs fra Anopheles gambiae mygg. Kjertler dissekert fra larver i en 25% etanoloppløsning er festet i en metanol-issyreblanding, etterfulgt av en kald acetonvask. Etter noen skyllinger i fosfatbufret saltvann (PBS) kan SGs farges med et bredt utvalg av markørfarger og/eller antisera mot SG-uttrykte proteiner. Denne metoden for larval SG-isolasjon kan også brukes til å samle vev for in situ hybridiseringsanalyse, andre transkripsjonsapplikasjoner og proteomiske studier.

Spyttkjertler er relativt enkle å dissekere fra alle stadium 4 larver. Mannlige og kvinnelige larver kan skille seg ut på slutten av L4 larvalstadiet med en rød stripe langs kvinners dorsale thorax, men ikke menn (Figur 2). Vi observerer også at antennemorfologi er mye mer forseggjort hos menn enn hos kvinnelige L4 larver (Figur 2), som ligner forskjellene som er observert i denne strukturen i voksne mygg. Sammen med den betydelige samlede veksten i L4-stadi...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes at JoVE.com

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Den voksne mygg spyttkjertelen (SG) er nødvendig for overføring av alle myggbårne patogener til sine menneskelige verter, inkludert virus og parasitter. Denne videoen demonstrerer effektiv isolasjon av bærekraftsmålene fra larvalstadiet (L4) Anopheles gambiae mygg og forberedelse av L4-bærekraftsmålene for videre analyse.

Disseksjon og immunstaining av Larval spyttkjertler fra Anopheles gambiae Mygg

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...

Spyttkjertlene av insekter, er nødvendige for å overføre mange menneskelige sykdommer. Så en bedre forståelse, av lønnskjertelbiologi bør hjelpe oss, legge til eksisterende strategier for sykdomsforebygging. Denne teknikken vil tillate oss, å raskt spørre om mutasjoner i kandidatregulatorene, påvirke morfologien, mygg larval spyttkjertlene, og potensielt påvirke overføringen, av malarial parasitter.De første gangene du jobber med mygg larver, er de utfordrende å forstå når de beveger seg raskt. Jo mer du trener, jo bedre blir du. Komme i gang med prosedyren, vil være Marisol Luchetti, en bachelor forskningsassistent for laboratoriet mitt.For å starte eksperimentet, plasser en potteplate på scenen av et dissekerende mikroskop, og overfør 10 mygg L4 larver på potteplaten. Legg deretter en dråpe av disseksjonsløsningen, på potteplaten skilt fra larver. Bruk tang til å plassere en L4 larve, inn i disseksjonsløsningsfallet på 25% etanol.Ved å holde en nummer fem tang i hver hånd, ta tak i larver med tang like under hodet, med den dominerende hånden, og grip larvens hode med den ikke-dominerende hånden, trekk deretter forsiktig hodet med minimal konstant kraft, for å løsne fra resten av kroppen, mens kjertlene forblir festet til hodet. Etter å ha kastet kroppsdelen av larvekroppen, samle hodet eller spyttkjertlene, i en milliliter PBS, i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerrør, og vent på at spyttkjertlene synker til bunnen av bufferen. På neste dag, tøm løsningen for å fikse vevet, med en milliliter kaldt 100% aceton i 90 sekunder.Etter å ha fjernet acetonen, skyll forsiktig vevet tre ganger, med en milliliter PBS. For immunstaining, legg til et primært antistoff som Rab 11, ved riktig fortynning, i 200 mikroliter av det totale volumet av PBS. Virvle rørinnholdet forsiktig med en pipettespiss.Inkuber de primære antistoffene over natten ved fire grader, etterfulgt av vask tre ganger i en milliliter PBS. Tilsett deretter det sekundære antistoffet, Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit, ved riktig fortynning, i 200 mikroliter av totalt volum. Etter å ha blandet innholdet med en pipettespiss, inkuber vevet med fargestoffer, som Nilen rød og Hoechst i 200 mikroliter PBS, ved romtemperatur i 60 minutter, etterfulgt av vask tre ganger med PBS.Forbered et mikroskopsklie ved å legge til 200 mikroliter 100% glyserol med pipette, og overfør opptil 20 fargede hoder, med vedlagte kjertler og indre strukturer, per mikroskopsklie ved hjelp av en myk børste. Spred hodeprøvene ut, for å fordele dem jevnt langs glasssklie. Visning under et dissekerende mikroskop, skille larvehodet fra kjertlene, ved hjelp av to par tang, ved å forsiktig trekke de to vevene i motsatte retninger.Når alle prøvene er ferdige, legg forsiktig en 1,5 millimeter tykk dekselslipp, på toppen av lysbildet, unngå dannelsen av luftbobler, og forsegle deretter lysbildet med klar neglelakk. Spyttkjertlene er relativt enkle å dissekere, fra stadium fire larver. Mannlige og kvinnelige larver kan skille seg ut, på slutten av L4 larvalstadiet med en rød stripe, langs kvinners dorsale thorax.Antennemorfologien er også mer forseggjort, hos menn enn hos kvinnelige L4 larver som det kan ses, med de hvite pilene som peker ut, de kvinnelige antennene på venstre bilde og de mannlige antennene til høyre. Spyttkjertlene isolert fra tidlige L4-stadium larver, farget med Hoechst avslører de proksimale og distale lobes, skilt av en smal innsnevring. Den dannende lumen ble undersøkt, i immuno farget distal spyttkjertel, av en midten til slutten av L4 larven.De apikale domenene til sekretoriske celler, rundt den dannende lumen, hadde intens nilrød farging, noe som tyder på mikrovilli som strukturer. Rab 11-fargingen ble observert nær, til den apikale overflaten. Det er bare ett skritt med tiden, og det er 90 sekunders inkubasjon, av vevet i kaldt aceton.Denne protokollen ble bare nylig utviklet, men vi forventer at den vil være nyttig, for alle som jobber med mygg spyttkjertelen. Vi forventer fullt ut å bruke det ofte.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Disseksjon og Immunostaining av Imaginal Discs fra<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNAi Trigger Levering inn<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; puppe

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

Isolering av Myoepithelial celler fra voksen murine Lacrimal og submandibular kjertler

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...