Name: dissection and immunostaining of larval salivary glands from anopheles gambiae mosquitoes
Uploaded: 2021-09-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes at JoVE.com

Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü'ne An. gambiae larvalarına erişip yetiştirdiği için teşekkür ederiz.

1. Çözümlerin ve araçların hazırlanması
<ol><li>Diseksiyon çözeltisinin hazırlanması<ol>
<li>Diseksiyon çözeltisi hazırlamak için, 15 plastik bir tüpte 7,5 mL damıtılmış H2O'ya% 100 etanol 2,5 mL ekleyin. Karıştırmak için tüpü 3 kez ters çevirin. NOT: Bu çözelti birkaç hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10x fosfat tamponlu salin (PBS) stoğunun hazırlanması<ol>
<li>10x PBS stoğu hazırlamak için 17,8 g Na2HP...

<ol>
	<li>World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660">https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660</a> (2020)</li><li>Feachem, R. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+eradication+within+a+generation:+ambitious,+achievable,+and+necessary.">Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary.</a> Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553 (2020).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Rostami, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+gene+drive+technology+to+control+transmission+of+vector-borne+parasitic+infections.">CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections.</a> Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).</li><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coverage+and+system+efficiencies+of+insecticide-treated+nets+in+Africa+from+2000+to+2017.">Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017.</a> Elife. 4, 09672 (2015).</li><li>Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+mosquito+salivation+in+blood+feeding+of+Aedes+aegypti.">Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti.</a> Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).</li><li>Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mosquito+saliva+in+blood+vessel+location.">Role of mosquito saliva in blood vessel location.</a> Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).</li><li>Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+malaria+infection+in+transgenic+Anopheline+mosquitoes+lacking+salivary+gland+cells.">Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells.</a> PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).</li><li>Rishikesh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+development+of+the+salivary+glands+and+their+chromosomes+in+the+larvae+of+Anopheles+stephensi+sensu+stricto.">Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto.</a> Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).</li><li>Jensen, D. V., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+salivary+glands+in+Anopheles+albimanus+Wiedemann+(Diptera,+Culicidae).">The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae).</a> Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).</li><li>Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+cellular+morphologies+during+lumen+maturation+in+Anopheles+gambiae+larval+salivary+glands.">Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands.</a> Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).</li><li>MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/Portals/2/">https://www.beiresources.org/Portals/2/</a> (2015)</li><li>Wells, M. B., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+cellular+architecture+in+the+Asian+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 617 (2015).</li><li>Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+maturation+and+duct+formation+in+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).</li><li>Wells, M. B., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+salivary+gland+architecture+shapes+plasmodium+sporozoite+availability+for+transmission.">Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission.</a> mBio. 10 (4), 01238 (2019).</li><li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The physiology of mosquitoes. , (1963).</li><li>Imms, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+larval+and+pupal+stages+of+Anopheles+maculipennis,+meigen.">On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen.</a> Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).</li><li>Favia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+of+the+genus+Asaia+stably+associate+with+Anopheles+stephensi,+an+Asian+malarial+mosquito+vector.">Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).</li><li>Neira Oviedo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+transcriptome+of+Anopheles+gambiae+(Diptera:+Culicidae)+larvae:+A+microarray-based+analysis.">The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).</li><li>Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonic+anhydrases+and+anion+transport+in+mosquito+midgut+pH+regulation.">Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation.</a> Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).</li><li>Linser, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slc4-like+anion+transporters+of+the+larval+mosquito+alimentary+canal.">Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal.</a> Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).</li></ol>

Burada açıklanan protokol bir Drosophila SG diseksiyon protokolünden ve yetişkin sivrisinek diseksiyon protokolü14 , 15,16'dan uyarlanmıştır. Bununla birlikte, çoğu belirteç yetişkin diseksiyonu ve SG boyama yöntemlerini kullanırken bodrum zarını (gösterilmeyen veriler) nüfuz etmedi. Yetişkin protokolünün uyarlamaları arasında bezlerin% 25 EtOH çözeltisinde parçalanması, bezlerin MeOH ve buzul asetik a...

Sıtma, 2019'da yaklaşık 230 milyon enfeksiyona ve tahmini 409.000 ölüme neden olan büyük bir halk sağlığıtehdididir 1. Ölümlerin çoğunluğu Sahra altı Afrika'dadır ve parazit Plasmodium falciparumböcek vektörü Anopheles gambiae, bu video gösterisinin konusudur. Rakamlar yüzyılın başlarından bu yana yıllık ölüm oranında önemli bir düşüşe işaret etse de (>300.000 daha az yıllık ölüm), 2000'den 2015'e kadar gözlenen hastalık oranlarındaki umut verici düşüşler sivriliyor ve bu da hastalık bulaşmasını sınırlamak için yeni yaklaşımlara ihtiyaç olduğunu gösteriyor2. Sıtmayı kontrol etmek ve muhtemelen ortadan kaldırmak için umut verici ek stratejiler arasında CRISPR / Cas9 tabanlı gen düzenleme ve gentahriki 3,4,5kullanarak sivrisinek vektör kapasitesini hedeflemektir. Gerçekten de, hastalık bulaşmasını azaltmada en büyük etkiye sahip olan sivrisinek vektörün (uzun ömürlü insektisitle tedavi edilen yatak ağlarının genişletilmiş kullanımı yoluyla) hedeflenilmesidir6.
Dişi sivrisinekler, bir kan unu sırasında enfekte bir insandan Plasmodium gametositleri alır. Döllenme, olgunlaşma, midgut epitel geçişi, nüfus genişlemesi ve zorunlu sivrisinek konaklarında hemokoel navigasyonun ardından, yüz ila on binlerce Plasmodium sporozoit sivrisinek SG'lerini istila eder ve kurucu salgı hücrelerinin salgı boşluklarını doldurur. Salgı boşluklarının içine girdikten sonra, parazitler tükürük kanalına doğrudan erişebilir ve böylece bir sonraki kan yemeğinde yeni bir omurgalı konakçuya iletilmeye hazırdır. Çünkü SG'ler sıtmaya neden olan sporozoitlerin insan konakçılarına iletilmesi için kritik öneme sahiptir ve laboratuvar çalışmaları SG'lerin kan besleme, sivrisinek hayatta kalma veya doğurganlık 7 ,8,9için gerekli olmadığını göstermektedir, bulaşmayı engelleyen önlemler için ideal bir hedefi temsil ederler. Yetişkin sivrisinek SG'leri, erken pupal SG histolysis10'unötesinde devam eden larva SG'lerinde "kanal tomurcuk" kalıntılarının detaylandırılması olarak oluşur Larva SG'yi yetişkin evresi hastalık bulaşmasını sınırlamak için müdahaleler için ideal bir hedef haline getirir.
SG gelişiminin larva aşamasını karakterize etmek, sadece morfolojisini ve fonksiyonel adaptasyonlarını daha iyi anlamakla kalmaz, aynı zamanda anahtar SG düzenleyicilerinin gen düzenlemesi yoluyla bu organı hedefleyen yeni müdahalelerin değerlendirilmesine de yardımcı olabilir. Larva tükürük bezi mimarisinin önceki tüm çalışmaları immünostaining ve modern görüntüleme tekniklerindenönce 10,11, tükürük bezlerini çeşitli antikorlar ve hücre belirteçleri ile izole etmek ve boyamak için bir protokol geliştirdik12. Bu video, konfokal görüntüleme için Anopheles gambiae L4 larvalarından larva SG'lerinin çıkarılması, sabitlenmesi ve lekelenmesine yönelik bu yaklaşımı göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;KH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Na2HPO4 &#8226; 2H2O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush with soft bristles</td>
			<td>Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set</td>
			<td>B08LH63D89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips (22 x 50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (DNA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EX0276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman P200 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jewelers forceps, Dumont No. 5</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>58221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1414209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Amazon (Sally Hansen)</td>
			<td>B08148YH9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red (lipid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N1142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels/wipes</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-7128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate (to make putty plate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Tips E200ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Transfer Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S304671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab</td>
			<td>Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone resin and curing agent for putty plate</td>
			<td>Dow Chemicals - Ximeter Silicone</td>
			<td>PMX-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides, frosted on one end for labelling</td>
			<td>VWR&#160; 20 X 50 mm</td>
			<td>48393-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>W834</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunostaining of larval salivary glands from anopheles gambiae mosquitoes

Sivrisinek tükürük bezleri (SG'ler), böcek kaynaklı patojenlerin iletimi için gerekli bir ağ geçidi organıdır. Virüsler ve sıtmaya neden olan Plazmodium parazitleri de dahil olmak üzere hastalık neden olan ajanlar, SG hücrelerinin salgı boşluklarında birikir. Burada, sonraki bir kan unu sırasında omurgalı konaklarına iletilmek üzere hazırlanırlar. Yetişkin bezleri, erken pupal SG histolizinin ötesinde devam eden larva SG kanal tomurcuk kalıntılarının bir detaylandırılması olarak oluştuğundan, larva SG, hastalık bulaşmasını sınırlayan müdahaleler için ideal bir hedeftir. Larva SG gelişimini anlamak, morfolojisinin ve fonksiyonel adaptasyonlarının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir ve bu organı hedefleyen yeni müdahalelerin değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Bu video protokolü, Anopheles gambiae sivrisineklerinden larva SG'lerini izole etmek, sabitlemek ve lekelemek için etkili bir teknik göstermektedir. % 25 etanol çözeltisinde larvalardan parçalanan bezler, metanol-buzul asetik asit karışımına sabitlenir ve ardından soğuk aseton yıkama. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde birkaç durulamadan sonra, SG'ler SG eksprese proteinlerine karşı çok çeşitli işaret boyaları ve / veya antisera ile boyanabilir. Larva SG izolasyonu için bu yöntem in situ hibridizasyon analizi, diğer transkriptomik uygulamalar ve proteomik çalışmalar için doku toplamak için de kullanılabilir.

Tükürük bezlerinin tüm aşama 4 larvalardan parçalanmaları nispeten kolaydır. Erkek ve dişi larvalar geç L4 larva aşamasında dişilerin sırt toraksı boyunca kırmızı bir şeritle ayırt edilebilir, ancak erkeklerin değil (Şekil 2). Ayrıca, anten morfolojisinin erkekte dişi L4 larvalarına göre çok daha ayrıntılı olduğunu gözlemliyoruz (Şekil 2), yetişkin sivrisineklerde bu yapıda gözlenen farklılıklara benzer. L4 aşamasındaki ö...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes at JoVE.com

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Yetişkin sivrisinek tükürük bezi (SG), virüsler ve parazitler de dahil olmak üzere sivrisinek kaynaklı tüm patojenlerin insan konakçılarına iletilmesi için gereklidir. Bu video, SG'lerin larva (L4) evresi Anopheles gambiae sivrisineklerinden verimli bir şekilde izole edilmesini ve daha fazla analiz için L4 SG'lerin hazırlanmasını göstermektedir.

Anopheles gambiae Sivrisineklerinden Larva Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu ve İmmünasyon

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...

Böceklerin tükürük bezleri, birçok insan hastalığını iletmek için gereklidir. Bu yüzden maaş bezi biyolojisinin daha iyi anlaşılması, hastalık önleme için mevcut stratejilere katkıda bulunmalıdır. Bu teknik, aday düzenleyicilerdeki mutasyonların sivrisinek larva tükürük bezlerinin morfolojisini etkileyip etkilemediğini ve sıtma parazitlerinin bulaşmasını potansiyel olarak etkileyip etkilemediğini hızlı bir şekilde sormamıza izin verecektir.Sivrisinek larvaları ile ilk birkaç kez çalıştığınızda, hızlı hareket ettikçe kavramaları zordur. Ne kadar çok pratik yaptırırsan, o kadar iyi olursun. Prosedüre başlarken, laboratuvarımın lisans araştırma asistanı Marisol Luchetti olacak.Deneye başlamak için, bir diseksiyon mikroskobu aşamasına bir lazımlık plakası yerleştirin ve 10 sivrisinek L4 larvasını lazımlık plakasına aktarın. Daha sonra larvalardan ayrı lazımlık plakasına diseksiyon çözeltisinden bir damla yerleştirin. Bir L4 larvasını% 25 etanol diseksiyon çözeltisi damlasına yerleştirmek için forseps kullanın.Her elde beş numaralı bir asa tutarak, larvaları başın hemen altında, baskın el ile kavrayın ve larva başını baskın olmayan el ile kavrayın, ardından bezler başa bağlı kalırken, vücudun geri kalanından kopmak için başı minimum sabit kuvvetle hafifçe çekin. Larva karkasının vücut kısmını attıktan sonra, baş veya tükürük bezlerini bir mililitre PBS'de, 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde toplayın ve tükürük bezlerinin tamponun dibine batmasını bekleyin. Ertesi gün, dokuları sabitlemek için çözeltiyi 90 saniye boyunca bir mililitre soğuk% 100 aseton ile boşaltın.Asetonu çıkardıktan sonra, dokuları bir mililitre PBS ile üç kez hafifçe durulayın. İmmün yetinme için, PBS'nin toplam hacminin 200 mikrolitresinde, uygun seyreltmede Rab 11 gibi birincil bir antikor ekleyin. Boru içeriğini bir pipet ucuyla hafifçe döndürün.Primer antikorları bir gecede dört derecede kuluçkaya yatırın, ardından bir mililitre PBS'de üç kez yıkayın. Daha sonra ikincil antikor olan Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit'i uygun seyreltmede toplam hacmin 200 mikrolitresinde ekleyin. İçeriği bir pipet ucuyla karıştırdıktan sonra, dokuları Nil kırmızısı ve Hoechst gibi boyalarla 60 dakika oda sıcaklığında 200 mikrolitre PBS'ye inküboz edin ve ardından PBS ile üç kez yıkayın.Bir pipet ile 200 mikrolitre% 100 gliserol ekleyerek ve yumuşak bir fırça kullanarak mikroskop slaytı başına ekli bezler ve iç yapılarla 20'ye kadar lekeli kafa aktararak bir mikroskop slaytı hazırlayın. Kafa örneklerini cam slayt boyunca eşit olarak dağıtmak için dışarı yayın. Bir diseksiyon mikroskobu altında görüntüleme, larva başını bezlerden ayırın, iki çift kümes gücü kullanarak, iki dokuyu dikkatlice zıt yönlere çekerek.Tüm numuneler yapıldığında, 1,5 milimetre kalınlığında bir kapak kaymasını yavaşça kaydırağın üzerine yerleştirin, hava kabarcıklarının oluşumunu önleyin ve ardından kaydırağı açık oje ile kapatın. Tükürük bezlerinin dördüncü evre larvalardan parçalanmaları nispeten kolaydır. Erkek ve dişi larvalar, geç L4 larva aşamasında, dişilerin sırt toraksı boyunca kırmızı bir şeritle ayırt edilebilir.Anten morfolojisi de, erkeklerde, görülebileceği gibi dişi L4 larvalarından daha ayrıntılıdır, beyaz oklar işaret edilir, sol görüntüdeki dişi antenler ve sağdaki erkek antenleri. Erken L4 evre larvalarından izole edilen, Hoechst ile lekelenmiş tükürük bezleri, dar bir daralma ile ayrılmış proksimal ve distal lobları ortaya çıkarmaktadır. Oluşturan lümen, orta ila geç L4 larvalarının immün lekeli distal tükürük bezinde incelendi.Lümeni çevreleyen salgı hücrelerinin apikal etki alanları, mikrovilli gibi yapıları düşündüren yoğun Nil kırmızısı lekelemesine sahipti. Rab 11 lekesi apikal yüzeye yakın bir şekilde gözlendi. Zamanla ilgili tek bir adım var, o da soğuk asetondaki dokuların 90 saniyelik inkübasyonu.Bu protokol daha yeni geliştirildi, ancak sivrisinek tükürük bezi üzerinde çalışan herkese yardımcı olacağını umuyoruz. Sık sık kullanmayı bekliyoruz.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biyoloji

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Ae midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyon. aegypti Sivrisinekler

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

Bina daha iyi Sivrisinek: Sıtma ve Dang Ateşi Direnç A. gambiae ve A. aegypti Sivrisinekler etkinleştirilmesi Genler belirlenmesi

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Diseksiyon ve boyanması Drosophila Larvaların Yumurtalıkların

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Larvaların Kalp Diseksiyon, Çocuk ve Yetişkin Zebra balığı, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

Yetişkin Murine lacrimal ve submandibular bezlerden Myoepitelyal hücrelerin izolasyonu

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...