ओस्टियोब्लास्ट विनिर्देश, भेदभाव और हड्डी के गठन के लिए अमीनो एसिड अपटेक और चयापचय आवश्यक हैं। यह प्रोटोकॉल अमीनो एसिड अपटेक का मूल्यांकन करने के लिए एक तेज़ और संवेदनशील विधि प्रदान करता है। हमारा प्रोटोकॉल अमीनो एसिड अपटेक को मापने के लिए रेडियोलेबल अमीनो एसिड का उपयोग करता है।
यह एक सस्ता, संवेदनशील और एक तेज़ तरीका है जिसे आसानी से विभिन्न स्थितियों के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को आसानी से विभिन्न ऊतकों के साथ-साथ प्राथमिक या रूपांतरित कोशिकाओं में ग्लूकोज और फैटी एसिड जैसे अन्य रेडियोलेबल पोषक तत्वों के उत्थान का मूल्यांकन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। अल्फा एमईएम माध्यम में 12 अच्छी तरह से ऊतक संवर्धन प्लेट के प्रत्येक कुएं में पांच बार 10 से चौथी एसटी 2 कोशिकाओं को एमिनो एसिड अपटेक परख प्लेट शुरू करने के लिए एफबीएस, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक।
सामान्यीकरण के लिए प्रति स्थिति सेल संख्या को निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं के अतिरिक्त कुओं को प्लेट करें। इसके बाद, एक ह्यूमिडिफायर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ दो से तीन दिनों के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद माध्यम को एस्पिरेट करें और पीएच 7.4 पर पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
फिर कोशिकाओं को एक मिलीलीटर क्रेब्स-रिंगर के एचईपीईएस या केआरएच के साथ धोने से पहले पीबीएस को एस्पिरेट करें। ताजा तैयार केआरएच के 0.5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें जिसमें पांच मिनट के लिए प्रति मिलीलीटर एल 34 ट्रिटाइड ग्लूटामाइन वर्किंग मीडिया में चार माइक्रोक्यूरी होते हैं। इनक्यूबेशन बाद, तरल अपशिष्ट कंटेनर में वितरित करने के लिए रेडियोधर्मी माध्यम एकत्र करें।
फिर प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए बर्फ ठंडे केआरएच के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं। इसके बाद, प्रत्येक कुएं में 1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट का एक मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण को 10 बार लिसे और होमोजिनाइज करने के लिए ट्राइट्यूरेट करें। फिर सेल लाइसेट को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए 10,000 जी की न्यूनतम गति से सेंट्रीफ्यूजिंग करके लाइसेट को स्पष्ट करें।
सुपरनैटेंट को एक सिंटिलेशन शीशी में स्थानांतरित करें जिसमें आठ मिलीलीटर सिंटिलेशन समाधान होता है, और सिंटिलेशन काउंटर का उपयोग करके प्रति मिनट रेडियो गतिविधि और गिनती पढ़ें। कोशिकाओं की शेष गैर-रेडियोधर्मी प्लेटों से, लाइस्ड रेडियोधर्मी संस्कृतियों में कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज, रीससस्पेंड और गिनती करें। हेमसाइटोमीटर का उपयोग करके, प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए प्रति गैर-रेडियोधर्मी अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
अमीनो एसिड अपटेक निर्धारित करने के लिए, हड्डी शाफ्ट का वजन करने से पहले हड्डी से मज्जा को बाहर निकालें। हड्डी को डीसेल्यूलराइज करने के लिए, पीबीएस में एक ह्यूमरस को 100 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए उबालें। सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए केआरएच के एक मिलीलीटर में जीवित और उबले हुए ह्यूमरी दोनों को बराबर करें।
इसके बाद, प्रयोगात्मक और उबले हुए नियंत्रण हड्डियों को ताजा तैयार केआरएच में अलग-अलग इनक्यूबेट करें जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट तक चार माइक्रोकरी प्रति मिलीलीटर एल 234 ट्राइसिएट आर्जिनिन हो। रेडियोधर्मी माध्यम को हटाने के बाद, एक मिलीलीटर बर्फ ठंडे केआरएच के साथ ह्यूमरस को तीन बार धोकर प्रतिक्रिया समाप्त करें। प्रत्येक हड्डी को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 500 माइक्रोलीटर आरआईपीए बफर हो।
फिर कैंची से 100 बार काटकर ह्यूमरस और आरआईपीए बफर को समरूप करें, इसके बाद 35% आयाम पर सोनिकेशन और 10 सेकंड के लिए एक सेकंड पल्स। कमरे के तापमान पर 10,000 गुना जी पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा लाइसेट को स्पष्ट किया। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सुपरनैटेंट के 200 माइक्रोलीटर को सिंटिलेशन शीशियों में स्थानांतरित करें जिसमें आठ मिलीलीटर सिंटिलेशन समाधान होता है।
सिंटिलेशन काउंटर का उपयोग करके रेडियो गतिविधि पढ़ें। इन विट्रो एल 34 ट्रिटिएटेड ग्लूटामाइन अपटेक और कॉन्फ्लुएंट एसटी 2 कोशिकाओं के काइनेटिक गुणों का मूल्यांकन सोडियम मिथाइल एमिनो आइसोब्यूट्रिक एसिड या लिथियम की उपस्थिति या अनुपस्थिति में किया गया था। सोडियम को हटाने से ग्लूटामाइन अपटेक में 90% की कमी आई।
लिथियम की उपस्थिति ने सोडियम मुक्त स्थिति की तुलना में ग्लूटामाइन अपटेक में 2% की वृद्धि की। जबकि मिथाइल एमिनो आइसोब्यूट्रिक एसिड ग्लूटामाइन अपटेक को प्रभावित नहीं करता है। सिस्टम ए, एन, एल या एएससी और गामा प्लस एल के आकलन प्रतिशत योगदान ने संकेत दिया कि अधिकांश ग्लूटामाइन अपटेक सिस्टम एएससी और गामा प्लस एल द्वारा मध्यस्थ है।
और सिस्टम ए ने 0% योगदान और उत्थान दिखाया। उबले हुए और जीवित नवजात ह्यूमरी में एक्स-विवो एल 34 ट्राइटिटेड आर्जिनिन अपटेक का विश्लेषण दो घंटे के समय में किया गया था। आर्जिनिन अपटेक पूरे प्रयोग और लाइव ह्यूमरी में रैखिक रूप से वृद्धि हुई।
उबले हुए ह्यूमरी ने प्रयोग में आर्जिनिन अपटेक की गतिशील वृद्धि का प्रदर्शन नहीं किया। प्रतिनिधि विश्लेषण सामान्यीकृत और सही आर्जिनिन अपटेक को दर्शाता है। एक सक्रिय नियंत्रण के रूप में विपरीत हड्डी को उबालना महत्वपूर्ण है।
यह कदम आवश्यक है क्योंकि हड्डी मैट्रिक्स रेडियोधर्मी अमीनो एसिड को अवशोषित कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप गलत परिणाम हो सकते हैं। प्रोटोकॉल ने हमें इन विट्रो और विवो दोनों में अमीनो एसिड अपटेक कैनेटीक्स की पुष्टि करने की अनुमति दी है।