En enkel tilnærming ble tatt for å overvåke endringer i proteostase ved å vurdere polyglutaminaggregering og gi et rammeverk som kan brukes til applikasjoner med høy gjennomstrømning. Å score en fenotype som antall aggregater av jeg kan bli subjektiv. Automatisering av aggregattelling gjør at vi kan eliminere slike skjevheter, øke gjennomstrømningen og reproduserbarheten.
Denne metoden bidrar til å identifisere bakterielle gener som bidrar til forstyrrelse av vertsproteostase. Å forstå individuelle bakterielle gener bidrag vil hjelpe oss å forstå dens implikasjon i patogenesen av sykdommer som Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons. Begynn med å fjerne platene som inneholder ormer fra fryseren og la dem tine ved romtemperatur.
Tørk deretter bort overflødig kondens og fjern lokket før avbildning. Bruk mikroskopinnstillingene med eksponeringstid 500 millisekunder, forstørrelse på 40 X med 0,63 X kameraadapter og GFP-intensitet satt til 100 % under bildeopptak. Juster nå de overførte lyskontrollene til ormene vises sterkt opplyst i forhold til den mørke bakgrunnen, og unngå overeksponering.
Endre posisjonene til ormer i brønnen for å forhindre overdreven klumping ved å bruke en 10 mikroliter pipettespiss for å forsiktig skyve ormer inn i ønsket posisjon. Sett kanalen til GFP-filter for å etablere et fokalplan for begge bildene. Ta et lyst feltbilde.
Ta et tilsvarende fluorescensbilde uten å forstyrre platen eller endre mikroskopets fokus. Nå for å vurdere bildene, last først ned CellProfiler. Åpne programvaren, og dra og slipp bildene av interesse i bildeboksen.
Klikk på bildene i fillisten for å åpne dem. Velg forstørrelsesglasset for å markere et interesseområde og pilikonet for å måle lengden på både ormer og aggregater. Hold markøren over ønsket objekt for å bestemme intensitetsverdien, som kan ses på den nederste delen av skjermen.
For å bruke CellProfiler-bildeanalyserørledningen, navngi bildeparene riktig som beskrevet i tekstmanuskriptet etter å ha lastet ned CellProfiler fra det offisielle nettstedet. Last ned pipelinen og last den opp til CellProfiler ved å velge fil, import og pipeline fra fil. Velg den uviklete worms-modulen for å åpne innstillingene for å laste inn et treningssett som brukes til å identifisere ormer i modulen for uviklete ormer.
Identifiser deretter filnavnet for treningssettet. Velg opplastingsfilikonet og last opp tilleggsfilen også. Last opp bilder ved å velge bildemodulen øverst til venstre.
Og dra og slipp deretter bilder med riktig navn. Før du analyserer bildene, velger du ønsket utdatamappe som skal brukes til å lagre resultatene ved å klikke på utdatainnstillingsknappen nederst til venstre i programmet. Velg deretter mappeikonet til høyre for standardutgangen for å velge ønsket utgangssted.
Velg analyser bilder-ikonet for å starte bildeanalyse. Hvis analysen tar for lang tid å fullføre og sitter fast og behandler et enkelt bilde, må du avbryte kjøringen og identifisere det ubehandlede bildet ved å sortere gjennom utdatamappen og merke hvilket bildenavn som ikke blir funnet. Etter fullstendig analyse vil programvaren organisere resultatene i et Excel-regneark som inneholder individuelle ormer i kolonne N, og det respektive antall aggregater i kolonne K.Last ned metadataarrangøren for å enkelt organisere data fra utdata-CSV-filen fra CellProfiler.
For Windows OS, finn den nedlastede filen og pakk den ut til ønsket sted. Finn og åpne den utpakkede mappen med navnet gui_Windowsos_64x. Og start applikasjonen ved å klikke på GUI-applikasjonsikonet.
En melding kan åpne og be om tillatelse til å kjøre. Velg mer info og klikk deretter på kjør uansett. Metadataarrangøren er nå klar til å dra og slippe CellProfiler-utdata-CSV-filer.
For Mac OS finner du den nedlastede filen og pakker ut programfilen for filmetadata organizer. Åpne den utpakkede mappen som finnes i nedlastinger. Høyreklikk på GUI-applikasjonen og velg åpne.
Det vises en melding som ber om tillatelse til å åpne på grunn av mangel på en offisiell lisens. Velg Åpne. Når metadataarrangørapplikasjonen din er åpen i det respektive operativsystemet, klikker du på last opp filene dine her, eller dra og slipp de ønskede CellProfiler CSV-filene.
Klikk på organiser-knappen, som vil bringe brukeren til en ny skjerm med en nedlastingsfilknapp. Klikk på knappen og velg ønsket sted for å lagre utdatafilen. Utdatafilen vises som det opprinnelige filnavnet med _organized utvidelse lagt til filnavnet.
I nærvær av FUDR hadde ormer som ble matet forskjellige bakterier en mer konsistent kroppsstørrelse som tillot mer jevn og nøyaktig ormdeteksjon, og dermed løste problemet med overbefolkning. Frysing av ormene forbedret polyQ-aggregatdeteksjon ved å eliminere bakgrunnsfluorescensen, samt nøyaktigheten av automatisert telling som kan sammenlignes med manuell telling. Invertert lysfeltbelysning ble brukt til å oppdage hele C.elegans- og GFP-kanalen for å avbilde polyQ YFP-aggregater.
Ormdeteksjon, untangling og aggregatkvantifisering for hver orm ble gjort ved å bruke en optimalisert CellProfiler-bildebehandlingspipeline, som gjør det mulig å oppnå antall aggregater per individuell orm. Forskjellen mellom effekten av automatisert aggregert kvantifisering og ved bruk av CellProfiler-pipelinen var minimal, noe som indikerer at den automatiserte metoden kan brukes på storskala skjermer. Av 90 bakteriestammer som ble testet, viste kolonisering av C.elegans tarm med en kandidat en signifikant reduksjon i antall aggregater.
Bekreftelseseksperimentene ved manuell telling viste at ingen av mutantene, inkludert den som signifikant reduserte antall aggregater, påvirket polyQ-aggregering. Forskere som bestemmer seg for å bruke dette rammeverket, bør forstå at trinnene som er skissert ikke er absolutte. Modifikasjon og en grunnleggende forståelse av hvordan man manipulerer CellProfiler er avgjørende for å lykkes.
Ytterligere biokjemiske tilnærminger som vestlig blotting kan brukes til å bekrefte polyQ-aggregering.