Lipid nanopartikel storlek påverkar biodistribution, anti-tumör effekt och gen ljuddämning prestanda. Därför är LNP-storlekskontrollmetoden en effektiv teknik för att producera nanoläkemedel, inklusive RNA-leveranssystem. Denna ursprungliga mikrofluidiska enhet, som heter iLiNP-enheten, kunde styra LNP-storleken från 20 till 100 nanometer med 10 nanometers intervall.
iLiNP-enheten kan producera inte bara siRNA-laddade LNPs, men alla också mRNA-laddade LNPS och ribonucleoprotein laddade LNPs. Till att börja med, ta lipidetanollösningarna och producera siRNA-laddade LNPs genom att blanda DOTAP, DSPC, kolesterol och DMG-PEG2k-lösningar med ett molarförhållande på 50 till 10 till 38,5 till 1,5. Justera den totala lipidkoncentrationen till åtta millimolar.
Ta sedan vattenlösningarna på 154 millimolar saltlösning och 25 millimolaracetatbuffert vid pH 4 och filtrera dem genom 0,2 mikrometer membranfilter eller sprutfilter. Förbered siRNA-buffertlösningen genom att lösa upp 70 mikrogram siGL4 till en milliliter 25 millimolaracetatbuffert. Fyll en milliliter glassprutor med lipid- respektive vattenlösningar.
Anslut glassprutorna till peak capillaris med hjälp av sprutkontakter, ställ sedan in flödeshastigheten för lipid- och vattenlösningarna och introducera lipid- och vattenlösningarna separat i iLiNP-enheten med hjälp av sprutpumpar. Samla LNP-suspensionerna i ett mikrorör från uttaget på iLiNP-enheten. Dialys LNP suspension med hjälp av ett dialysmembran på 12 till 14 kiloDalton molekylvikt cutoffs vid fyra grader är Celsius över natten mot saltlösning eller DPBS för POPC LNPs respektive siRNA laddade LNPs.
Samla de dialyserade LNP-suspensionerna i mikrorör och rör sedan 20 till 30 mikroliter av LNP-suspensionen till en mikrokvartscell. Mät slutligen LNP-storleken, LNP-storleksfördelningen och polydispersitetsindexet genom dynamisk ljusspridning. POPC LNP-storleksfördelning som produceras vid olika flödesförhållanden, till exempel det totala flödeshastigheten och flödesgraden visas här.
Exakta LNP-storlekar från 20 till 100 nanometer kan styras med denna iLiNP-enhet. Små LNPs bildas vid höga totala flödesförhållanden. Dessutom är LNP-storlekarna som bildas vid FRR 5 mindre än de i FRR 3, oavsett det totala flödet.
Storleksfördelningen för siRNA-laddade LNPs visas här. siRNAs är inkapslade i LNPs genom elektrostatisk interaktion mellan den katjoniska lipidEN DOTAP och de negativt laddade siRNAs. ILiNP-enheten producerade 90 nanometer siRNA-laddade katjoniska LNPs med en smal fördelning.
SiRNA inkapsling effektivitet var 95%på grund av den elektrostatiska interaktionen mellan den katjoniska lipiden och de negativt laddade siRNAs. Cytotoxicitet och genen tystande verksamhet av 19 nanometer siRNA laddade LNPs utvärderades. siRNA laddade LNPs visade cytotoxicitet vid en dos av 10 till 100 nanomolar siRNA.
Uttrycksnivån för luciferas minskade beroende på siRNA koncentration. SiRNA laddade LNPs undertryckte 80%luciferas uttryck vid en dos av 100 nanomolar siRNA. Optimeringar av flödesförhållandena är de viktigaste stegen i protokollet för att erhålla önskade LNPs.
Den mikrofluidiska LNP-produktionsmetoden, inklusive iLiNP-enheten, kräver inget komplicerat förfarande och förväntas användas som standardproduktionsmetod för LNP.
