Name: high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af finansiering fra Finlands Akademi (CBJ), Magnus Ehrnroot Foundation (CBJ) og et ph.d.-stipendium fra Integrated Life Sciences Graduate School (RA).

Alle dyreforsøg udføres i overensstemmelse med National Animal Experiment Review Board og Regional State Administrative Agency for Southern Finland. C57BL/6JOlaHsd-hanmus (4-6 måneder gamle) blev anvendt i dette studie. Samtykke til anvendelse af humane cellelinjer blev indhentet fra den institutionelle etiske komité ved Universitetet i Helsinki.
1. Respirometri i høj opløsning: Kammerbaseret åndedrætsværn (cHRR)
BEMÆRK: Eksperimenterne i de...

Traditionelt er mitokondrie bioenergetik blevet undersøgt med Clark-type iltelektroder. Manglende opløsning og gennemstrømning berettigede imidlertid til teknologisk udvikling. Til dato er O2k (kaldet cHRR) og Seahorse XF96 Flux Analyzer (kaldet mHRR) blevet bredt vedtaget inden for cellulær bioenergetik. Her præsenterer vi en forståelig samling af protokoller til analyse af cellulær energimetabolisme via vurdering af mitokondrie respiration ved hjælp af enten cHRR eller mHRR, diskuterer de vigtigste fordele ved ...

Mitokondrier opfylder nøgleforsyningen af energi og er en opdelt organel, der bidrager til essentielle cellulære bioenergetiske og metaboliske processer såsom anabolisme af nukleotider, lipider og aminosyrer, jern-svovlklyngebiogenese og er impliceret i signalering såsom kontrolleret celledød 1,2,3 . Mitokondriebioenergetik gennem oxidativ phosphorylering bidrager til næsten alle cellulære processer i cellen, og følgelig er mitokondrie dysfunktioner af primær eller sekundær oprindelse forbundet med et bredt spektrum af sygdomstilstande 4,5. Mitokondrie dysfunktion indebærer ikke kun ændringer i struktur eller mitokondrietæthed, men også i kvaliteten og reguleringen af åndedrætssystemet6. Dette kvalitative element omfatter substratkontrol, koblingsegenskaber, posttranslationelle modifikationer, cristae-dynamik og respiratoriske superkomplekser 7,8. Derfor er nøjagtig analyse af mitokondriebioenergetik til eksperimentelle og diagnostiske tilgange til vurdering af cellens energimetabolisme vigtig i sundhed og sygdom.
Mitokondrie oxidativ phosphorylering (OXPHOS) er en sekvens af reaktioner i åndedrætssystemet eller elektronoverførselssystemet (ETS) til dannelse af cellulær energi gennem adenosintrifosfat (ATP)9. Det multienzymatiske trin til at udnytte energi fra elektronstrøm gennem komplekser I og II til kompleks IV genererer en elektrokemisk protongradient over den indre mitokondriemembran, der efterfølgende anvendes til phosphorylering af adenosindiphosphat (ADP) til ATP via kompleks V (F1FO ATP-syntase) (figur 1A).
For det første genereres to-elektronbærere under tricarboxylcyklussen (TCA), glykolyse og pyruvatoxidation: nicotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) og dihydroflavin-adenin-dinukleotid (FADH2). NADH oxideres ved kompleks I (NADH-dehydrogenase), hvor to elektroner overføres til coenzym Q (quinon reduceres til quinol), mens protoner pumpes ind i det intermembrane rum (IMS). For det andet oxiderer kompleks II (Succinatdehydrogenase)FADH2 og føder elektronerne til coenzym Q uden at pumpe protoner. For det tredje overføres elektroner fra coenzym Q ved kompleks III (cytokrom c oxidoreduktase) til cytokrom c, mens protoner pumpes ind i IMS. For det fjerde overfører cytokrom c elektronerne til kompleks IV (Cytochrome c oxidase), det sidste kompleks til pumpning af protoner, og hvor ilt fungerer som en elektronacceptor til at assimilere protoner og i sidste ende danne vand. Det er dette ilt, som mitokondrier forbruger, som kan måles ved en oxygraf. Endelig bruges protonerne genereret fra kompleks I, kompleks III og kompleks IV til at rotere kompleks V og derved generere ATP9.
Det er vigtigt, at elektronoverførsel ikke kun sker lineært, ellers betegnet som elektrontransportkæden. I stedet kan elektroner overføres til coenzym Q-puljen gennem flere respiratoriske veje og lette konvergent elektronstrøm. NADH-substrater og succinat kan for eksempel komme ind via henholdsvis kompleks I og kompleks II. Elektroner fra fedtsyreoxidation kan doneres via det elektronoverførende flavoproteinkompleks. En omfattende analyse af OXPHOS kræver en holistisk tilgang med passende brændselssubstrater (figur 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig1v2.jpg"> Figur 1: Mitokondriel oxidativ phosphorylering og specifikke substrat- og inhibitorprotokoller. (A) Mitokondrion og skema af elektronoverførselssystemet (CI-CIV) og mitokondrie F1F0 ATP-syntase (CV). Alle strukturer er fra PDB. Tallene viser kun substrater og hæmmere beskrevet i denne undersøgelse). (B) Prøvespor af iltflux i intakte HEK293-celler ved hjælp af standardprotokol i en mHRR-enhed. (C) Prøvespor af iltflux i intakte HEK293-celler ved hjælp af standardprotokol i en cHRR-enhed. (D) Prøvespor af iltflux i permeabiliserede humane fibroblaster fra en sund donor med respektive SUIT-protokol. Forkortelser: 1 = Rutinemæssig respiration af intakte celler; 2 = Stat 2; 3 = stat 3(I) 4 = Stat 3(I) med cytC; 5 = stat 3 (I+II) 6 = Lækage (OM); 7 = ETS-kapacitet 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenon, AM = Antimycin, ATP = Adenosintrifosfat, Az = Azzid, OM = Oligomycin, FCCP = Carbonylcyanid p-trifluor-methoxyphenyl-hydrazon; Asc = Ascorbat, TMPD = N,N,N′,N′-tetramethyl-p-phenylendiamin, Succ = Succinat, M = Malat, P = Pyruvat, ADP = Adenosindiphosphat, NAD = Nicotinamid-adenin-dinukleotid, IMS = Intermembranrum, FAD = Flavin adenin-dinukleotid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Analyse af mitokondrie OXPHOS-kapacitet ved hjælp af HRR er blevet en instrumentel biokemisk metode med diagnostisk værdi ikke kun for primære mitokondriefejl10,11, men strækker sig til alle andre biologiske områder såsom kræft og aldring12. HRR tillader bestemmelse af cellulær respiration ved analyse af mitokondrie OXPHOS-kapacitet, som direkte afspejler individuel eller kombineret mitokondrie respiratorisk kompleksmangel og indirekte er forbundet med cellulær dysfunktion og ændret energimetabolisme9. Metodisk udføres respirationsmålinger ved hjælp af celler, væv eller isolerede mitokondrier 11,13,14, hvor frosset materiale kun er delvist egnet 15,16. Frosset væv har vist sig at have en intakt ETS med opretholdt superkompleks stabilitet15. I modsætning til traditionelle TCA-mellemprodukter tilføres de respektive substrater således direkte til ETS. Koblingen mellem ETS- og ATP-syntesen går imidlertid tabt, da membranintegriteten kompromitteres gennem fryseskader (iskrystaldannelse).
Respirationsforsøg finder normalt sted ved en fysiologisk temperatur på 37 °C for endotermer i enten ikke-permeabiliserede eller permeabiliserede celler eller væv. Mens førstnævnte overvejer den cytosoliske metaboliske kontekst, giver sidstnævnte det energiske bidrag fra individuelle OXPHOS-komplekser og ATPase gennem tilsætning af specifikke substrater (og hæmmere). Sekvensen og variationen af substrater og inhibitorer har ført til udviklingen af en bred vifte af SUIT-protokoller17 og assays18 for at løse forskellige videnskabelige spørgsmål om OXPHOS-funktion (gennemgået under12). Den grundlæggende protokol for cellulær respiration vurderer fire forskellige tilstande: i) rutinemæssig respiration - respirationen i et respektive respirationsmedie uden tilsætning af substrater eller hæmmere, der indtager, men endogene substrater. Denne tilstand kan afsløre generelle OXPHOS eller sekundærinducerede respirationsdefekter forårsaget af for eksempel ændrede metabolitprofiler. Dernæst afslører tilsætningen af ATPase inhibitor oligomycin permeabiliteten af den indre mitokondriemembran til protoner, defineret som ii) lækage respiration. Efterfølgende titrering af en protonofor, såsom uncoupler carbonylcyanid p-trifluor-methoxyphenyl-hydrazon (FCCP), gør det muligt at bestemme den tilstand, hvor ETS-kapaciteten er maksimal i en åben transmembran protonkredsløbstilstand, defineret som iii) ukoblet respiration. Det er vigtigt, at en ukoblet tilstand også kan forekomme ved eksperimentelle indgreb gennem overdreven mekanisk skade på mitokondriemembranerne. Omvendt refererer den ikke-koblede tilstand til respiratorisk afkobling af en iboende mekanisme, der er fysiologisk kontrolleret. Endelig bestemmer fuldstændig hæmning af ETS ved tilsætning af den komplekse III-hæmmer antimycin og kompleks I-hæmmer rotenon resterende iltforbrug (ROX) fra ikke-mitokondrie iltforbrugende processer (figur 1A-C).
Mitokondrie bioenergetik består af fem forskellige respirationstilstande19,20. Tilstand 1 respiration er uden yderligere substrater eller ADP, bortset fra hvad der er endogent tilgængeligt. Efter tilsætning af ADP, men stadig ingen substrater, opnås tilstand 2 respiration. Når substrater tilsættes, hvilket tillader elektronoverførsel og ATP-syntese, nås tilstand 3 respiration. I denne tilstand kan OXPHOS-kapacitet defineres ved mættende koncentrationer af ADP, uorganisk phosphat, oxygen, NADH- og succinatbundne substrater. Tilstand 4 respiration eller LEAK respiration kan defineres som en tilstand uden ADP eller kemisk hæmmede ATP syntaser, mens de har tilstrækkelige substrater. Endelig, når al ilt er udtømt (anoxisk) i en lukket kammerindstilling, observeres tilstand 5 respiration.
Der findes flere metoder til at vurdere cellulære energitilstande14 med to enheder, der dominerer den aktuelle realtidsvurdering af OXPHOS gennem analyse af iltforbrug, målt som funktionen af faldet i ilt over tid i et lukket kammersystem med forskellig anvendelighed afhængig af den eksperimentelle model og forskningsspørgsmål: Oroboros 2k højopløsningsrespirometer og Seahorse XF ekstracellulær fluxanalysator. Begge enheder registrerer iltforbrugshastighederne som et fald i picomomer (pmol) af ilt (O2) pr. Sekund som en absolut værdi i kammeret eller mikropladebrønden. Det specifikke iltforbrug pr. masse opnås ved at normalisere det respektive iltforbrug i en specifik bufferopskrift pr. antal celler (millioner), vævsvægt (mg) eller proteinmængde.
O2k (Oroboros Instruments) er et lukket to-kammersystem udstyret med en polarografisk iltføler (forkortet som kammerbaseret højopløsningsrespirometer: cHRR). Hvert forsøgskammer indeholder 2 ml væske, som holdes homogent af magnetiske omrørere. Den polarografiske iltføler anvender en amperometrisk tilgang til måling af iltet: den indeholder en guldkatode, en sølv / sølvchloridanode og imellem en KCI-opløsning, der skaber en elektrokemisk celle, hvorpå en spænding (0,8 V) påføres. Oxygen fra assaymediet diffunderer gennem en 25 μm fluoreret ethylenpropylenmembran (O 2-permeabel) og gennemgår reduktion ved katoden, der producerer hydrogenperoxid. Ved anoden oxideres sølv af hydrogenperoxid, der genererer en elektrisk strøm. Denne elektriske strøm (ampere) er lineært relateret til det delvise ilttryk. Partialtrykket af ilt og iltopløselighedsfaktoren for assaymediet anvendes til at beregne iltkoncentrationen. Da iltpartialtrykket er afhængigt af forsøgstemperatur, og polarografiske målinger er temperaturfølsomme, kræver temperaturudsving præcis (±0,002 °C) regulering af en Peltier-varmeblok. Temperaturen kan styres inden for et område på 4 °C og 47 °C.
Seahorse XF ekstracellulær fluxanalysator (Agilent) er et pladebaseret system med 24- eller 96-brønds mikropladeformat, hvor tre fluorescenselektroder måler iltforbruget over tid i hver brønd (forkortet mikropladebaseret højopløsningsrespirometer: mHRR). Der er maksimalt fire porte i analysepatronen til rådighed til automatisk injektion under analysen. Et assay indeholder flere cyklusser, hver med tre faser: 1) blanding, 2) venter og 3) måling. I målefasen sænkes sensorsonder ned i mikropladen, hvilket skaber et midlertidigt lukket kammer indeholdende 7-10 μL volumen for at måle udsendt lys. Dette lys udsendes af polymerindlejrede fluorophorer på spidsen af sensorsonderne, som sanserO2 baseret på phosphorescensslukning. Fluorescenssignalets intensitet er proportional medO2 og påvirkes af temperaturen på sensoren og analysemediet. Derfor kræver nøjagtig iltestimering en relativ tilgang med en baggrundsbrønd uden nogen prøve. Gendannelse af iltkoncentration sker i blandingsfasen, når sensoren bevæger sig op og ned for at blande volumenet over det midlertidige kammer. Hver cyklus beregner en iltforbrugshastighed. Temperaturen kan styres inden for et område på 16 °C og 42 °C.
HRR er guldstandarden til vurdering af cellulær bioenergetik i primære og mitokondrier-associerede sygdomme og generel cellulær metabolisme. I denne undersøgelse gives grundlæggende protokoller for HRR til vurdering af OXPHOS-funktion i celler og væv.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig2v2.jpg"> Figur 2: Arbejdsgang for celle- og vævspræparater til cHRR og celleforberedelse til mHRR-respirometri. (A) Oversigt over leverede protokoller. (B) Pattedyrceller (trin 1.2): HEK293 pellet svarende til 3 x 106 celler (venstre panel). Ikke-fibrøst væv (trin 1.3): Fremstilling af murin cerebellum lysat i 2 ml teflon keramiker (midterste panel). Saponin-induceret skeletmuskelpermeabilisering (trin 1.4) højre panel) til cHRR-åndedrætsværn. (C) Standard mikropladesåningslayout (trin 2.4) og sammenløbskontrol til analyse af eukaryote celler (HEK293) til mHRR-respirometri. (D, E) Skema for injektionsportbelastning til mHRR-åndedrætsværn (trin 2.4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>07-358029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2 medical gas mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Potter for tissue grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PHR1279-1G</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty accid free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 4830</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 7752</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5628</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 0632</td>
			<td>Chemical, dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (High glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium&#160;(No Glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E 4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax&#160;(100x)&#160;(200 nM&#160;L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267151B</td>
			<td>Instrument for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>56750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 1000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 2383</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 7936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate&#160;(100 mM)&#160;(100x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA&#160;(Non-essential amino acids) 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal FBS&#160;(10x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Titration Set</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes for chemical injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O 4876</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 4509</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 2256</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA-Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td>High-throughput respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>72-57-1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two thin-edged forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine stock (500x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers

Højopløsningsrespirometri (HRR) muliggør overvågning af oxidativ phosphorylering i realtid til analyse af individuelle cellulære energitilstande og vurdering af respiratoriske komplekser ved hjælp af diversificerede substrat-uncoupler-inhibitor titrering (SUIT) protokoller. Her demonstreres brugen af to højopløsningsrespirometriapparater, og en grundlæggende samling af protokoller, der gælder for analyse af dyrkede celler, skelet- og hjertemuskelfibre og blødt væv som hjerne og lever, præsenteres. Protokoller for dyrkede celler og væv leveres til et kammerbaseret åndedrætsværn og dyrkede celler til et mikropladebaseret åndedrætsværn, der begge omfatter standard respirationsprotokoller. Til sammenligningsformål anvendes CRISPR-konstruerede HEK293-celler, der mangler mitokondrietransformation, der forårsager flere luftvejsmangel, med begge enheder til at demonstrere cellulære defekter i respiration. Begge åndedrætsværn giver mulighed for omfattende måling af cellulær respiration med deres respektive tekniske fordele og egnethed afhængigt af forskningsspørgsmålet og modellen under undersøgelse.

Her leverer vi protokoller til bestemmelse af mitokondriebioenergetik i eukaryote celler, ikke-fibrøst væv (f.eks. Cerebellum) og fibrøst væv (f.eks. Skeletmuskulatur). For eukaryote celler blev HEK293 med CRISPR-konstrueret knockout af to forskellige proteiner forbundet med mitokondrietransposition, der resulterede i multiple (CRISPRKO1) og svær/komplet OXPHOS-mangel (CRISPRKO2), målt med enten cHRR (figur 3A-C) eller mHRR (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers at JoVE.com

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

Vurdering af oxidativ phosphorylering ved hjælp af respirometre med høj opløsning er blevet en integreret del af den funktionelle analyse af mitokondrier og cellulær energimetabolisme. Her præsenterer vi protokoller til analyse af cellulær energimetabolisme ved hjælp af kammer- og mikropladebaserede respirometre med høj opløsning og diskuterer de vigtigste fordele ved hver enhed.

Respirometri i høj opløsning til vurdering af bioenergetik i celler og væv ved hjælp af kammer- og pladebaserede åndedrætsværn

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and ...

Mitokondrier tilvejebringer cellulær energi gennem oxidativ phosphorylering, der bidrager til næsten alle processer i cellen. Følgelig er mitokondrie dysfunktioner forbundet med et bredt spektrum af sygdomme. Den største fordel ved denne teknik er realtidsmåling af mitokondriebioenergetik ved iltforbrug og dermed en nøjagtig vurdering af den samlede cellulære energimetabolisme.Respirometri med høj opløsning muliggør direkte vurdering af, hvad der i det oxidative phosphoryleringssystem svigter, hvilket potentielt giver diagnostiske spor i primære mitokondriesygdomme og sekundære mitokondrie dysfunktioner forbundet med mange lidelser. Demonstration af proceduren vil være Ryan Awadhpersad, ph.d.-studerende i mit laboratorium. Til at begynde med skal du udføre iltkalibreringen ved at køre åndedrætskometrene i 2,1 ml mitokondrie respirationsmedium ved 37 grader Celsius i mere end 45 minutter og fortsætte, hvis baseline variation er inden for fire picomoler pr. Sekund.Kultur HEK293 celler i højglukose DMEM suppleret med 10% varmeaktiveret FBS, GlutaMAX, ikke-essentielle aminosyrer, natriumpyruvat og uridin i en inkubator ved 37 grader Celsius ved 5% kuldioxid. På dagen for eksperimentet skal du indsamle og tælle cellerne og resuspend 2,5 millioner celler i 2,5 ml respirationsmedium. For at vurdere rutinemæssig respiration tilsættes 2,3 ml varm respiration medium celle suspension til kammeret.Kør kamrene ved 37 grader Celsius og en omrøringshastighed på 700 o / min. Vent i mindst tre minutter for at lade mediet afgasse, og luk derefter kamrene ved at dreje proppen i en roterende bevægelse. Derefter aspireres overskydende væske oven på proppen.Efter 10 minutter skal du få et stabilt iltfluxsignal for at registrere rutine eller tilstand I åndedræt. For at udføre OXPHOS-analyse i intakte celler tilsættes to mikroliter 0,01-millimolær oligomycin til en endelig koncentration på 10-nanomolar. Titr FCCP fra to-millimolar lager ved at tilføje 0,6 mikroliter ved 0,2 mikroliter trin, indtil der ikke observeres nogen stigning i respiration, og respirationen maksimalt er afkoblet.Derefter tilsættes en mikroliter af en millimolar rotenon til en endelig koncentration på 0,5 mikromolar. Derefter tilsættes to mikroliter på en milligram pr. Milliliter antimycinbestand for en endelig koncentration på et mikrogram pr. Milliliter. Reoxygenerer kammeret til det samme iltniveau, ca. 150 mikromolar, ved at løfte stemplet.Derefter tilsættes fem mikroliter 0,8-molar ascorbat til en endelig koncentration af to-millimolar. Derefter tilsættes straks fem mikroliter 0,2-molar TMPD for en slutkoncentration på 0,5 millimolar og evaluerer kompleks IV-aktivitet. Når den maksimale iltflux er nået med TMPD, tilsættes fem mikroliter eller fire-molært azid for en endelig koncentration på 10 millimolar.Fortsæt derefter kørslen i mindst fem minutter for at analysere autooxidation af TMPD til kompleks IV-beregning af basisniveau. Efter kørslen opsamles en milliliter prøvesuspension fra hvert kammer og centrifugeres ved 1.000 G for permeabiliserede celler eller ved 20.000 G for vævslysat. Kassér derefter supernatanten og frys pelleten ved minus 80 grader Celsius til yderligere nedstrømsanalyse.Først frø cellerne i henhold til vækstraterne for individuelle cellelinjer. Fortyndet oligomycin, FCCP, rotenon og antimycin i tre mikroliter assaysubstrat til en slutkoncentration på henholdsvis 1,5 mikromolar, 1,125 mikromolar og en mikromolar. Udfyld dem derefter i separate porte.Overhold injektionsportene for at sikre en jævn indlæsning af prøverne. Tænd for det mikropladebaserede system og computeren, og ækvilibrer dem ved 37 grader Celsius i mindst tre timer. På dagen for det mikropladebaserede assay skal du kontrollere sammenløbet af cellekulturpladen, cellernes morfologi og sikre, at baggrundsbrøndene er tomme.Fjern derefter alt undtagen 20 mikroliter af kulturmediet fra hver brønd. Vask derefter hver brønd med 90 mikroliter analysemedium og tilsæt 100 mikroliter assaymedium for at lave et endeligt volumen på op til 120 mikroliter. Derefter inkuberes pladen ved 37 grader Celsius i en inkubator uden kuldioxid i 60 minutter.Når du har hentet pladen fra inkubatoren, skal du fjerne låget og placere mikropladen i spalten. Klik på Fortsæt for at starte kørslen. Når kørslen er afsluttet, skal du tage pladen ud og fjerne de resterende analysemedier uden at forstyrre cellerne.Frys derefter hele pladen ved minus 80 grader Celsius. Efter at have udført digitoninpermeabiliserings- og respirationseksperimenterne blev der registreret spor af rå iltforbrug af vildtype HEK293-celler og HEK293-celler med en CRISPR-medieret gen knockout, hvilket resulterede i flere OXPHOS-mangler. Overlejrede celleindgangsnormaliserede iltforbrugsspor blev opnået.CRISPR knockout 1 viser nedsat respiration og CRISPR knockout 2 viser ingen respiration sammenlignet med vildtype, når den normaliseres til cellenummer. Proteinmængder blev kvantificeret, og respirationsværdier blev normaliseret til proteinmængde for at bestemme absolutte værdier af respiratoriske tilstande og respektive fluxkontrolforhold. Ekstracellulære forsuringshastigheder viste sig at stige for OXPHOS-mangel i CRISPR knockout 2, hvilket tyder på kompensation for mitokondrie oxidativ phosphoryleringsmangel i HEK293-celler gennem øget glykolyse.Derudover blev respirationsværdierne bestemt i nærvær af oligomycin, FCCP og rotenon, og de opnåede værdier blev normaliseret til proteinmængden. Proteinnormaliserede iltforbrugsspor af vildtype HEK293-celler og HEK293-celler med CRISPR-medieret mitokondrietranslationsmangel, der forårsager multipel OXPHOS-mangel, blev undersøgt. Vådvægt vævsnormaliserede iltforbrugsspor af mus cerebellum og mouse soleus muskel blev opnået.Soleusmusklerne viser tre gange højere OXPHOS og respirationskapacitet end lillehjernen. Med kammerbaseret åndedrætsværn er det vigtigt at arbejde hurtigt, da mitokondriefunktionen vil falde i det øjeblik, du indsamler dine prøver, og med pladebaseret åndedrætsværn er det afgørende at opnå en optimal såtæthed for at minimere variabiliteten. Til yderligere analyse er proteinkvantificering eller immuno-blotting mulig.Dette kunne afgøre, om en ændring i mitokondrie respiratorisk funktion skyldtes overflod af OXPHOS-komplekser eller mitokondriemængde. Allerede for et århundrede siden viste kræftceller sig at udføre anaerob glykolyse ud over mitokondrie OXPHOS. Dette understreger behovet for at analysere mitokondrie bioenergetik.Her demonstrerede vi to åndedrætsværn, der betragtes som nutidens guldstandard.

Research

JoVE Journal

Biology

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Brug High Resolution Computed Tomography at visualisere de tredimensionelle struktur og funktion af dyrs vaskulatur

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Hurtig og effektiv zebrafisk Genotypebestemmelse Brug PCR med høj opløsning Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Måling af stofskifte i<em&gt; Drosophila</em&gt; Hjælp respirometri

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing af<em&gt; BRCA2</em&gt; At identificere nye BRCA2-regulerede biologiske funktioner i dyrkede humane celler

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Kvantificering af krystallinsk cellulose Ophobning i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots til Monitor Tissue-specifikke Cell Wall Ændringer

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Høj opløsning respirometri at vurdere mitokondrie funktion i permeabiliseret og intakte celler

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering af Intakt Mitokondrier fra Skeletal Muscle ved differentialcentrifugering for høj opløsning respirometri Målinger

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Høj opløsning respirometri at måle mitokondrie funktion af intakt Beta celler i overværelse af naturlige forbindelser

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...