Name: high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door financiering van de Academy of Finland (C.B.J),de Magnus Ehrnroot Foundation (C.B.J.) en een doctoraatsbeurs van de Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

Alle dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de National Animal Experiment Review Board en het Regional State Administrative Agency for Southern Finland. Mannelijke C57BL/6JOlaHsd muizen (4-6 maanden oud) werden gebruikt in deze studie. Toestemming voor het gebruik van menselijke cellijnen werd verkregen van de institutionele ethische commissie van de Universiteit van Helsinki.
1. Hoge resolutie respirometrie: Kamer-gebaseerde respirometer (cHRR)
<p class="jove_...

Traditioneel is mitochondriale bio-energetica bestudeerd met Clark-type zuurstofelektroden. Een gebrek aan resolutie en doorvoer rechtvaardigde echter technologische vooruitgang. Tot op heden zijn de O2k (aangeduid als cHRR) en Seahorse XF96 Flux Analyzer (aangeduid als mHRR) op grote schaal toegepast op het gebied van cellulaire bio-energetica. Hier presenteren we een begrijpelijke verzameling protocollen voor de analyse van cellulair energiemetabolisme via beoordeling van mitochondriale ademhaling met behulp van cHRR o...

Mitochondriën vervullen de belangrijkste energievoorziening en zijn een gecompartimenteerd organel dat bijdraagt aan essentiële cellulaire bio-energetische en metabole processen zoals anabolisme van nucleotiden, lipiden en aminozuren, ijzer-zwavelclusterbiogenese en zijn betrokken bij signalering zoals gecontroleerde celdood 1,2,3 . Mitochondriale bio-energetica door oxidatieve fosforylering draagt bij aan bijna alle cellulaire processen in de cel, en bijgevolg worden mitochondriale disfuncties van primaire of secundaire oorsprong geassocieerd met een breed spectrum van ziekteomstandigheden 4,5. Mitochondriale disfunctie omvat niet alleen veranderingen in structuur of mitochondriale dichtheid, maar ook in de kwaliteit en regulatie van het ademhalingssysteem6. Dit kwalitatieve element omvat substraatcontrole, koppelingskarakteristieken, posttranslationele modificaties, cristaedynamica en respiratoire supercomplexen 7,8. Daarom is een nauwkeurige analyse van mitochondriale bio-energetica voor experimentele en diagnostische benaderingen om het energiemetabolisme van de cel te beoordelen belangrijk voor gezondheid en ziekte.
Mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) is een opeenvolging van reacties binnen het ademhalingssysteem of elektronenoverdrachtsysteem (ETS) voor de opwekking van cellulaire energie via adenosinetrifosfaat (ATP)9. De multi-enzymatische stap om energie uit elektronenstroom door complexen I en II naar complex IV te benutten, genereert een elektrochemische protongradiënt over het binnenste mitochondriale membraan, vervolgens gebruikt voor fosforylering van adenosinedifosfaat (ADP) naar ATP via complex V (F1FO ATP-synthase) (figuur 1A).
Ten eerste worden twee-elektronendragers gegenereerd tijdens de tricarbonzuurcyclus (TCA), glycolyse en pyruvaatoxidatie: nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) en dihydroflavine adenine dinucleotide (FADH2). NADH wordt geoxideerd bij complex I (NADH-dehydrogenase), waarbij twee elektronen worden overgebracht naar co-enzym Q (chinon wordt gereduceerd tot quinol), terwijl protonen in de intermembraanruimte (IMS) worden gepompt. Ten tweede oxideert complex II (Succinaatdehydrogenase) FADH2 en voedt de elektronen naar co-enzym Q zonder protonen te pompen. Ten derde worden bij complex III (Cytochroom c oxidoreductase) elektronen uit co-enzym Q overgebracht naar cytochroom c, terwijl protonen in het IMS worden gepompt. Ten vierde brengt cytochroom c de elektronen over naar complex IV (Cytochroom c-oxidase), het laatste complex om protonen te pompen, en waar zuurstof functioneert als een elektronenacceptor om protonen te assimileren en uiteindelijk water te vormen. Het is deze zuurstof die mitochondriën verbruiken die kan worden gemeten door een oxygraaf. Ten slotte worden de protonen gegenereerd uit complex I, complex III en complex IV gebruikt om complex V te roteren, waardoor ATP 9 wordtgegenereerd.
Belangrijk is dat elektronenoverdracht niet alleen op een lineaire manier plaatsvindt, anders aangeduid als de elektronentransportketen. In plaats daarvan kunnen elektronen via meerdere ademhalingswegen naar de co-enzym Q-pool worden overgebracht en convergente elektronenstroom vergemakkelijken. NADH-substraten en succinaat kunnen bijvoorbeeld binnenkomen via respectievelijk complex I en complex II. Elektronen uit vetzuuroxidatie kunnen worden gedoneerd via het elektronoverdrachtsflavoproteïnecomplex. Een uitgebreide analyse van OXPHOS vereist inderdaad een holistische benadering met geschikte brandstofsubstraten (figuur 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig1v2.jpg"> Figuur 1: Mitochondriale oxidatieve fosforylering en specifieke substraat- en inhibitorprotocollen. (A) Mitochondrion en schema van het elektronenoverdrachtssysteem (CI-CIV) en mitochondriaal F1F0 ATP-synthase (CV). Alle structuren zijn afkomstig van PDB. De cijfers tonen alleen substraten en remmers die in dit onderzoek worden beschreven). (B) Monsterspoor van zuurstofflux in intacte HEK293-cellen met behulp van het standaardprotocol in een mHRR-apparaat. (C) Monsterspoor van zuurstofflux in intacte HEK293-cellen met behulp van een standaardprotocol in een cHRR-apparaat. (D) Monsterspoor van zuurstofflux in gepermeabiliseerde menselijke fibroblasten van een gezonde donor met het respectieve SUIT-protocol. Afkortingen: 1 = Routinematige ademhaling van intacte cellen; 2 = toestand 2; 3 = toestand 3(I); 4 = Toestand 3(I) met cytC; 5 = toestand 3 (I+II); 6 = Lek(OM); 7 = ETS-capaciteit; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenon, AM = Antimycine, ATP = Adenosinetrifosfaat, Az = Azide, OM = Oligomycine, FCCP = Carbonylcyanide p-trifluoro-methoxyfenyl-hydrazone; Asc = Ascorbaat, TMPD = N,N,N′,N′-tetramethyl-p-fenyleendiamine, Succ = Succinaat, M = Malaat, P = Pyruvaat, ADP = Adenosinedifosfaat, NAD = Nicotinamide adenine dinucleotide, IMS = Intermembrane ruimte, FAD = Flavin adenine dinucleotide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Analyse van mitochondriale OXPHOS-capaciteit met behulp van HRR is een instrumentele biochemische methode van diagnostische waarde geworden, niet alleen voor primaire mitochondriale defecten10,11, maar ook uitbreidend naar alle andere gebieden van de biologie, zoals kanker en veroudering12. HRR maakt de bepaling van cellulaire ademhaling mogelijk door de analyse van mitochondriale OXPHOS-capaciteit, die direct individuele of gecombineerde mitochondriale respiratoire complexe deficiëntie weerspiegelt, en indirect geassocieerd is met cellulaire disfunctie en veranderd energiemetabolisme9. Methodologisch worden ademhalingsmetingen uitgevoerd met behulp van cellen, weefsel of geïsoleerde mitochondriën 11,13,14, met bevroren materiaal dat slechts gedeeltelijk geschikt is 15,16. Bevroren weefsel blijkt een intact ETS te hebben met behoud van supercomplexe stabiliteit15. In tegenstelling tot traditionele TCA-tussenproducten worden de respectieve substraten dus rechtstreeks in het ETS ingevoerd. De koppeling tussen de ETS- en ATP-synthese gaat echter verloren omdat de membraanintegriteit wordt aangetast door bevriezingsschade (ijskristalvorming).
Ademhalingsexperimenten vinden normaal gesproken plaats bij een fysiologische temperatuur van 37 °C voor endothermen in niet-permeabiliseerde of permeabiliseerde cellen of weefsel. Terwijl de eerste de cytosolische metabole context beschouwt, levert de laatste de energetische bijdrage van individuele OXPHOS-complexen en de ATPase door de toevoeging van specifieke substraten (en remmers). De sequentie en variatie van substraten en remmers hebben geleid tot de ontwikkeling van een breed scala aan SUIT-protocollen17 en assays18 om verschillende wetenschappelijke vragen over de OXPHOS-functie aan te pakken (beoordeeld onder12). Het basisprotocol van cellulaire ademhaling beoordeelt vier verschillende toestanden: i) routinematige ademhaling - de ademhaling in een respectievelijk ademhalingsmedium zonder toevoeging van substraten of remmers die maar endogene substraten consumeren. Deze toestand kan algemene OXPHOS of secundair geïnduceerde ademhalingsdefecten onthullen die bijvoorbeeld worden veroorzaakt door veranderde metabolietprofielen. Vervolgens onthult de toevoeging van de ATPase-remmer oligomycine de permeabiliteit van het binnenste mitochondriale membraan voor protonen, gedefinieerd als ii) lekademhaling. Daaropvolgende titratie van een protonofoor zoals de ontkoppelaar carbonylcyanide p-trifluor-methoxyfenyl-hydrazone (FCCP) maakt het mogelijk om de toestand te bepalen waarin de ETS-capaciteit maximaal is in een open-transmembraan protoncircuitmodus, gedefinieerd als iii) ontkoppelde ademhaling. Belangrijk is dat een ontkoppelde toestand ook kan optreden door experimentele interventies door overmatige mechanische schade aan de mitochondriale membranen. Omgekeerd verwijst de niet-gekoppelde toestand naar respiratoire ontkoppeling door een intrinsiek mechanisme dat fysiologisch wordt gecontroleerd. Ten slotte bepaalt volledige remming van het ETS door toevoeging van de complexe III-remmer antimycine en complexe I-remmer rotenon het resterende zuurstofverbruik (ROX) van niet-mitochondriale zuurstofverbruikende processen (figuur 1A-C).
Mitochondriale bio-energetica bestaat uit vijf verschillende ademhalingstoestanden19,20. Toestand 1 ademhaling is zonder extra substraten of ADP, behalve wat endogeen beschikbaar is. Na de toevoeging van ADP, maar nog steeds geen substraten, wordt toestand 2 ademhaling bereikt. Wanneer substraten worden toegevoegd, waardoor elektronenoverdracht en ATP-synthese mogelijk zijn, wordt toestand 3-ademhaling bereikt. In deze toestand kan OXPHOS-capaciteit worden gedefinieerd bij verzadigde concentraties van ADP, anorganisch fosfaat, zuurstof, NADH- en succinaatgebonden substraten. Toestand 4 ademhaling of LEAK ademhaling kan worden gedefinieerd als een toestand zonder ADP of chemisch geremde ATP-synthasen met voldoende substraten. Ten slotte, wanneer alle zuurstof is uitgeput (anoxisch) in een gesloten kamer, wordt toestand 5 ademhaling waargenomen.
Er bestaan verschillende methoden om cellulaireenergietoestanden 14 te beoordelen met twee apparaten die de huidige real-time beoordeling van OXPHOS domineren door analyse van het zuurstofverbruik, gemeten als de functie van de afname van zuurstof in de loop van de tijd in een gesloten kamersysteem met verschillende toepasbaarheid afhankelijk van het experimentele model en de onderzoeksvraag: de Oroboros 2k hoge resolutie respirometer en de Seahorse XF extracellulaire flux analyzer. Beide apparaten registreren het zuurstofverbruik als een afname van picomol (pmol) van zuurstof (O2) per seconde als een absolute waarde in de kamer of microplaatput. Het specifieke zuurstofverbruik per massa wordt verkregen door het respectieve zuurstofverbruik te normaliseren in een specifiek bufferrecept per aantal cellen (miljoenen), weefselgewicht (mg) of eiwithoeveelheid.
De O2k (Oroboros Instruments) is een gesloten tweekamersysteem uitgerust met een polarografische zuurstofsensor (afgekort als kamergebaseerde hoge resolutie respirometer: cHRR). Elke experimentele kamer bevat 2 ml vloeistof die homogeen wordt gehouden door magnetische roerders. De polarografische zuurstofsensor maakt gebruik van een amperometrische benadering om de zuurstof te meten: het bevat een gouden kathode, een zilver / zilverchloride-anode en tussendoor een KCI-oplossing die een elektrochemische cel creëert waarop een spanning (0,8 V) wordt toegepast. Zuurstof uit het testmedium diffundeert door een gefluoreerd ethyleenpropyleenmembraan van 25 μm (O 2-permeabel) en ondergaat reductie aan de kathode, waardoor waterstofperoxide wordt geproduceerd. Aan de anode wordt zilver geoxideerd door waterstofperoxide, waardoor een elektrische stroom wordt gegenereerd. Deze elektrische stroom (ampère) is lineair gerelateerd aan de partiële zuurstofdruk. De partiële druk van zuurstof en de zuurstofoplosbaarheidsfactor van het testmedium worden gebruikt om de zuurstofconcentratie te berekenen. Aangezien de partiële zuurstofdruk afhankelijk is van de experimentele temperatuur en polarografische metingen temperatuurgevoelig zijn, moeten temperatuurschommelingen nauwkeurig (±0,002 °C) worden geregeld door een Peltier-verwarmingsblok. De temperatuur kan worden geregeld binnen een bereik van 4 °C en 47 °C.
De Seahorse XF extracellulaire flux analyzer (Agilent) is een op platen gebaseerd systeem met 24- of 96-well microplaatformaat waarin drie fluorescentie-elektroden het zuurstofverbruik in de loop van de tijd in elke put meten (afgekort als microplaatgebaseerde hoge resolutie respirometer: mHRR). Er zijn maximaal vier poorten in de testcartridge beschikbaar voor geautomatiseerde injectie tijdens de test. Een test bevat meerdere cycli, elk met drie fasen: 1) mengen, 2) wachten en 3) meten. Tijdens de meetfase worden sensorsondes in de microplaat neergelaten, waardoor een tijdelijk gesloten kamer ontstaat met een volume van 7-10 μL om het uitgestraalde licht te meten. Dit licht wordt uitgezonden door polymeer-ingebedde fluoroforen op de punt van de sensorsondes, die O2 detecteren op basis van fosforescentie-doven. De intensiteit van het fluorescentiesignaal is evenredig met O2 en wordt beïnvloed door de temperatuur van de sensor en het testmedium. Daarom vereist nauwkeurige zuurstofschatting een relatieve benadering met een achtergrondput zonder monster. Het herstellen van de zuurstofconcentratie vindt plaats tijdens de mengfase wanneer de sensor op en neer beweegt om het volume boven de tijdelijke kamer te mengen. Elke cyclus berekent één zuurstofverbruik. De temperatuur kan worden geregeld binnen een bereik van 16 °C en 42 °C.
HRR is de gouden standaard om cellulaire bio-energetica te beoordelen bij primaire en mitochondriën-geassocieerde ziekten en algemeen cellulair metabolisme. In deze studie worden basisprotocollen voor HRR gegeven om de OXPHOS-functie in cellen en weefsels te beoordelen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig2v2.jpg"> Figuur 2: Workflow voor cel- en weefselpreparaten voor cHRR en celvoorbereiding voor mHRR-respirometrie. (A) Overzicht van verstrekte protocollen. (B) Zoogdiercellen (stap 1.2): HEK293-pellet gelijk aan 3 x 106 cellen (linkerpaneel). Niet-vezelig weefsel (stap 1.3): Bereiding van murine cerebellum lysaat in 2 ml teflon potter (middenpaneel). Saponine-geïnduceerde skeletspierpermeabilisatie (stap 1.4) rechterpaneel) voor cHRR-respirometrie. (C) Standaard lay-out voor het zaaien van microplaten (stap 2.4) en de samenvloeiingscontrole voor de analyse van eukaryote cellen (HEK293) voor mHRR-respirometrie. (D, E) Schema van injectiepoortbelasting voor mHRR-respirometrie (stap 2.4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>07-358029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2 medical gas mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Potter for tissue grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PHR1279-1G</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty accid free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 4830</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 7752</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5628</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 0632</td>
			<td>Chemical, dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (High glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium&#160;(No Glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E 4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax&#160;(100x)&#160;(200 nM&#160;L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267151B</td>
			<td>Instrument for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>56750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 1000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 2383</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 7936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate&#160;(100 mM)&#160;(100x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA&#160;(Non-essential amino acids) 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal FBS&#160;(10x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Titration Set</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes for chemical injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O 4876</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 4509</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 2256</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA-Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td>High-throughput respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>72-57-1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two thin-edged forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine stock (500x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers

Hoge resolutie respirometrie (HRR) maakt het mogelijk om oxidatieve fosforylering in realtime te monitoren voor analyse van individuele cellulaire energietoestanden en beoordeling van ademhalingscomplexen met behulp van gediversifieerde substrate-uncoupler-inhibitor titratie (SUIT) protocollen. Hier wordt het gebruik van twee respirometrie-apparaten met hoge resolutie gedemonstreerd en wordt een basisverzameling protocollen gepresenteerd die van toepassing zijn op de analyse van gekweekte cellen, skelet- en hartspiervezels en zachte weefsels zoals de hersenen en de lever. Protocollen voor gekweekte cellen en weefsels zijn voorzien voor een kamergebaseerde respirometer en gekweekte cellen voor een op microplaten gebaseerde respirometer, beide met standaard ademhalingsprotocollen. Voor vergelijkende doeleinden worden CRISPR-gemanipuleerde HEK293-cellen met een tekort aan mitochondriale translatie die meerdere deficiënties van het ademhalingssysteem veroorzaken, met beide apparaten gebruikt om cellulaire defecten in de ademhaling aan te tonen. Beide respirometers maken een uitgebreide meting van cellulaire ademhaling mogelijk met hun respectieve technische verdiensten en geschiktheid, afhankelijk van de onderzoeksvraag en het model dat wordt bestudeerd.

Hier bieden we protocollen om de mitochondriale bio-energetica in eukaryote cellen, niet-vezelig weefsel (bijv. Cerebellum) en vezelig weefsel (bijv. skeletspieren) te bepalen. Voor eukaryote cellen werden HEK293 met CRISPR-engineered knock-out van twee verschillende eiwitten geassocieerd met mitochondriale translatie resulterend in meervoudige (CRISPRKO1) en ernstige / volledige OXPHOS-deficiëntie (CRISPRKO2) gemeten met cHRR (figuur 3A-C</str...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers at JoVE.com

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

Het beoordelen van oxidatieve fosforylering met behulp van respirometers met hoge resolutie is een integraal onderdeel geworden van de functionele analyse van mitochondriën en cellulair energiemetabolisme. Hier presenteren we protocollen voor de analyse van cellulair energiemetabolisme met behulp van kamer- en microplaatgebaseerde respirometers met hoge resolutie en bespreken we de belangrijkste voordelen van elk apparaat.

Respirometrie met hoge resolutie om bio-energetica in cellen en weefsels te beoordelen met behulp van respirometers op basis van kamer en platen

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and ...

Mitochondriën leveren cellulaire energie door oxidatieve fosforylering die bijdraagt aan bijna alle processen in de cel. Bijgevolg worden mitochondriale disfuncties geassocieerd met een breed spectrum van ziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de realtime meting van mitochondriale bio-energetica door zuurstofverbruik, en dus een nauwkeurige beoordeling van het totale cellulaire energiemetabolisme.Respirometrie met hoge resolutie maakt een directe beoordeling mogelijk van wat in het oxidatieve fosforyleringssysteem faalt, wat mogelijk diagnostische aanwijzingen biedt bij primaire mitochondriale ziekten en secundaire mitochondriale disfuncties geassocieerd met vele aandoeningen. De procedure wordt gedemonstreerd door Ryan Awadhpersad, promovendus in mijn lab. Voer om te beginnen de zuurstofkalibratie uit door de respirometers gedurende meer dan 45 minuten in 2,1 milliliter mitochondriaal ademhalingsmedium bij 37 graden Celsius te laten lopen en ga verder als de basislijnvariatie binnen vier picomol per seconde ligt.Kweek HEK293 cellen in high-glucose DMEM aangevuld met 10% warmte-geactiveerde FBS, GlutaMAX, niet-essentiële aminozuren, natriumpyruvaat en uridine in een incubator bij 37 graden Celsius bij 5% koolstofdioxide. Verzamel en tel op de dag van het experiment de cellen en resuspendeer 2,5 miljoen cellen in 2,5 milliliter ademhalingsmedium. Om routinematige ademhaling te beoordelen, voegt u 2,3 milliliter warme ademhalingsmiddelcelsuspensie toe aan de kamer.Laat de kamers draaien op 37 graden Celsius en een roersnelheid van 700 RPM. Wacht minstens drie minuten om media te laten ontgassen en sluit vervolgens de kamers door de stop in een roterende beweging te draaien. Zuig vervolgens de overtollige vloeistof bovenop de stop.Verkrijg na 10 minuten een stabiel zuurstoffluxsignaal om routine of toestand I-ademhaling te registreren. Om OXPHOS-analyse in intacte cellen uit te voeren, voegt u twee microliter 0,01-millimolar oligomycine toe voor een uiteindelijke concentratie van 10-nanomolair. Titreer FCCP uit twee milliculaire voorraad door 0,6 microliter toe te voegen bij stappen van 0,2 microliter totdat er geen toename van de ademhaling wordt waargenomen en de ademhaling maximaal is ontkoppeld.Voeg vervolgens een microliter rotenon van één millimolair toe voor een uiteindelijke concentratie van 0,5 micromolair. Voeg vervolgens twee microliter van één milligram per milliliter antimycinebouillon toe voor een uiteindelijke concentratie van één microgram per milliliter. Reoxygeneer de kamer tot hetzelfde zuurstofniveau, ongeveer 150 micromolair, door de zuiger op te tillen.Voeg daarna vijf microliter 0,8-molair ascorbaat toe voor een uiteindelijke concentratie van twee millimolair. Voeg vervolgens onmiddellijk vijf microliter 0,2-molaire TMPD toe voor een uiteindelijke concentratie van 0,5 millimolar en evalueer complexe IV-activiteit. Als de piekzuurstofflux wordt bereikt met TMPD, voegt u vijf microliter of vier molair azide toe voor een uiteindelijke concentratie van 10 millimolar.Ga vervolgens gedurende ten minste vijf minuten door met het testen van de automatische oxidatie van TMPD voor complexe IV-basisniveauberekening. Verzamel na de run een milliliter monstersuspensie uit elke kamer en centrifugeer bij 1.000 G voor gepermeabiliseerde cellen of bij 20.000 G voor weefsellysaat. Gooi vervolgens het supernatant weg en vries de pellet in op min 80 graden Celsius voor verdere stroomafwaartse analyse.Zaai eerst de cellen volgens de groeisnelheden van individuele cellijnen. Verdun oligomycine, FCCP, rotenon en antimycine in drie microliter assaymedium tot een eindconcentratie van respectievelijk 1,5-micromolair, 1,125-micromolair en één-micromolair. Vul ze vervolgens in afzonderlijke poorten in.Observeer de injectiepoorten om een gelijkmatige belasting van de monsters te garanderen. Schakel het op microplaten gebaseerde systeem en de computer in en zet ze gedurende ten minste drie uur op 37 graden Celsius. Controleer op de dag van de op microplaten gebaseerde test de samenvloeiing van de celkweekplaat, de morfologie van cellen en zorg ervoor dat de achtergrondputten leeg zijn.Verwijder vervolgens alles behalve 20 microliter van het kweekmedium uit elke put. Was vervolgens elk goed met 90 microliter testmedium en voeg 100 microliter testmedium toe om een eindvolume van maximaal 120 microliter te maken. Incubeer vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius in een incubator zonder koolstofdioxide gedurende 60 minuten.Nadat u de plaat uit de incubator hebt opgehaald, verwijdert u het deksel en plaatst u de microplaat in de sleuf. Klik op Doorgaan om de run te starten. Nadat de run is voltooid, haalt u de plaat eruit en verwijdert u de resterende testmedia zonder de cellen te storen.Vries vervolgens de hele plaat in op min 80 graden Celsius. Na het uitvoeren van de digitoninepermeabilisatie- en ademhalingsexperimenten werden sporen van ruw zuurstofverbruik van wild-type HEK293-cellen en HEK293-cellen met een CRISPR-gemedieerde gen knock-out geregistreerd, resulterend in meerdere OXPHOS-tekortkomingen. Over de overlay van de cel input-genormaliseerde zuurstofverbruikssporen werden verkregen.CRISPR knockout 1 vertoont verminderde ademhaling en CRISPR knockout 2 vertoont geen ademhaling in vergelijking met wild-type wanneer genormaliseerd naar celnummer. Eiwithoeveelheden werden gekwantificeerd en ademhalingswaarden werden genormaliseerd tot eiwithoeveelheid om absolute waarden van ademhalingstoestanden en respectieve fluxcontroleverhoudingen te bepalen. Extracellulaire verzuringspercentages bleken toe te nemen voor OXPHOS-deficiëntie in CRISPR knock-out 2, wat suggereert compensatie van mitochondriale oxidatieve fosforyleringsdeficiëntie in HEK293-cellen door verhoogde glycolyse.Bovendien werden de ademhalingswaarden bepaald in aanwezigheid van oligomycine, FCCP en rotenon en werden de verkregen waarden genormaliseerd naar de eiwithoeveelheid. Eiwitgenormaliseerde zuurstofverbruikssporen van wild-type HEK293-cellen en HEK293-cellen met CRISPR-gemedieerde mitochondriale translatiedeficiëntie die meerdere OXPHOS-deficiëntie veroorzaakten, werden bestudeerd. Nat gewicht weefsel-genormaliseerde zuurstofverbruik sporen van muis cerebellum en muis soleus spier werden verkregen.De soleusspieren vertonen drie keer hogere OXPHOS en ademhalingscapaciteit dan het cerebellum. Met kamergebaseerde respirometrie is het belangrijk om snel te werken, omdat de mitochondriale functie afneemt op het moment dat u uw monsters verzamelt, en met op platen gebaseerde respirometrie is het cruciaal om een optimale zaaidichtheid te verkrijgen om variabiliteit te minimaliseren. Voor verdere analyse is eiwitkwantificering of immuno-blotting mogelijk.Dit zou kunnen bepalen of een verandering in de mitochondriale ademhalingsfunctie te wijten was aan de overvloed aan OXPHOS-complexen of mitochondriale hoeveelheid. Al een eeuw geleden bleken kankercellen anaerobe glycolyse uit te voeren naast mitochondriaal OXPHOS. Dit onderstreept de noodzaak om mitochondriale bio-energetica te testen.Hier demonstreerden we twee respirometers die als de huidige gouden standaard worden beschouwd.

Research

JoVE Journal

Biology

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Met behulp van hoge resolutie Computed Tomography om de driedimensionale structuur en functie van Plant vaatstelsel Visualiseer

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Snelle en efficiënte zebravis Genotyping Met behulp van PCR met een hoge resolutie Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Meting van Metabolic Rate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gebruik respirometrietest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing van<em&gt; BRCA2</em&gt; Naar Novel-BRCA2 geregeld biologische functies Identificeer in gekweekte menselijke cellen

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

High-resolution respirometrietest aan mitochondriale functie beoordelen in gepermeabiliseerde en intacte cellen

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...