Name: high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par un financement de l’Académie de Finlande (C.B.J), de la Fondation Magnus Ehrnroot (C.B.J) et d’une bourse de doctorat de l’Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

Tous les expérimentations animales sont effectués conformément au Conseil national d’examen de l’expérimentation animale et à l’Agence administrative régionale de l’État pour le sud de la Finlande. Des souris mâles C57BL/6JOlaHsd (âgées de 4 à 6 mois) ont été utilisées dans cette étude. Le consentement pour l’utilisation de lignées cellulaires humaines a été obtenu auprès du comité d’éthique institutionnelle de l’Université d’Helsinki.
1. Respiromét...

Traditionnellement, la bioénergétique mitochondriale a été étudiée avec des électrodes d’oxygène de type Clark. Un manque de résolution et de débit, cependant, justifiait le progrès technologique. À ce jour, l’O2k (appelé cHRR) et l’analyseur de flux Seahorse XF96 (appelé mHRR) ont été largement adoptés dans le domaine de la bioénergétique cellulaire. Ici, nous présentons une collection compréhensible de protocoles pour l’analyse du métabolisme énergétique cellulaire via l’évaluation de...

Les mitochondries remplissent la fourniture clé d’énergie et sont un organite compartimenté contribuant aux processus bioénergétiques et métaboliques cellulaires essentiels tels que l’anabolisme des nucléotides, des lipides et des acides aminés, la biogenèse des amas fer-soufre et sont impliquées dans la signalisation telle que la mort cellulaire contrôlée 1,2,3 . La bioénergétique mitochondriale par phosphorylation oxydative contribue à presque tous les processus cellulaires au sein de la cellule et, par conséquent, les dysfonctionnements mitochondriaux d’origine primaire ou secondaire sont associés à un large éventail de maladies 4,5. Le dysfonctionnement mitochondrial implique non seulement des altérations de la structure ou de la densité mitochondriale, mais aussi de la qualité et de la régulation du système respiratoire6. Cet élément qualitatif englobe le contrôle du substrat, les caractéristiques de couplage, les modifications post-traductionnelles, la dynamique des cristae et les supercomplexes respiratoires 7,8. Par conséquent, une analyse précise de la bioénergétique mitochondriale pour des approches expérimentales et diagnostiques visant à évaluer le métabolisme énergétique de la cellule est importante pour la santé et la maladie.
La phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS) est une séquence de réactions au sein du système respiratoire ou du système de transfert d’électrons (ETS) pour la génération d’énergie cellulaire par l’adénosine triphosphate (ATP)9. L’étape multi-enzymatique visant à exploiter l’énergie du flux d’électrons à travers les complexes I et II vers le complexe IV génère un gradient électrochimique de protons à travers la membrane mitochondriale interne, utilisé par la suite pour la phosphorylation de l’adénosine diphosphate (ADP) en ATP via le complexe V (F1FO ATP synthase) (Figure 1A).
Tout d’abord, des transporteurs à deux électrons sont générés au cours du cycle tricarboxylique (TCA), de la glycolyse et de l’oxydation du pyruvate : nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et dihydroflavine adénine dinucléotide (FADH2). Le NADH est oxydé au niveau du complexe I (NADH déshydrogénase), au cours duquel deux électrons sont transférés à la coenzyme Q (la quinone est réduite en quinol), tandis que les protons sont pompés dans l’espace intermembranaire (IMS). Deuxièmement, le complexe II (Succinate déshydrogénase) oxyde le FADH2 et alimente les électrons en coenzyme Q sans pomper de protons. Troisièmement, au complexe III (cytochrome c oxydoréductase), les électrons de la coenzyme Q sont transférés au cytochrome c tandis que les protons sont pompés dans l’IMS. Quatrièmement, le cytochrome c transfère les électrons au complexe IV (Cytochrome c oxydase), le complexe final pour pomper les protons, et où l’oxygène fonctionne comme un accepteur d’électrons pour assimiler les protons, formant finalement de l’eau. C’est cet oxygène que les mitochondries consomment qui peut être mesuré par un oxygraphe. Enfin, les protons générés à partir des complexes I, III et IV sont utilisés pour faire tourner le complexe V, générant ainsi de l’ATP9.
Il est important de noter que le transfert d’électrons ne se produit pas seulement de manière linéaire, autrement désigné comme la chaîne de transport d’électrons. Au lieu de cela, les électrons peuvent être transférés au pool de coenzyme Q par de multiples voies respiratoires et faciliter le flux d’électrons convergents. Les substrats de NADH et le succinate, par exemple, peuvent entrer par les complexes I et II, respectivement. Les électrons issus de l’oxydation des acides gras peuvent être donnés via le complexe flavoprotéique de transfert d’électrons. En effet, une analyse complète d’OXPHOS nécessite une approche holistique avec des substrats de combustible appropriés (Figure 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig1v2.jpg"> Figure 1 : Phosphorylation oxydative mitochondriale et protocoles spécifiques de substrat et d’inhibiteur. (A) Mitochondrie et schéma du système de transfert d’électrons (CI-CIV) et de la F1F0 ATP synthase mitochondriale (CV). Toutes les structures sont de PDB. Les figures ne représentent que les substrats et les inhibiteurs décrits dans cette étude). (B) Échantillon de trace de flux d’oxygène dans des cellules HEK293 intactes utilisant un protocole standard dans un dispositif mHRR. (C) Échantillon de trace de flux d’oxygène dans des cellules HEK293 intactes utilisant un protocole standard dans un dispositif cHRR. (D) Échantillon de trace de flux d’oxygène dans des fibroblastes humains perméabilisés provenant d’un donneur sain avec le protocole SUIT respectif. Abréviations : 1 = Respiration de routine des cellules intactes; 2 = État 2; 3 = État 3(I); 4 = État 3(I) avec cytC; 5 = État 3 (I+II); 6 = Fuite (OM); 7 = capacité du SEQE; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Roténone, AM = Antimycine, ATP = Adénosine triphosphate, Az = Azide, OM = Oligomycine, FCCP = Cyanure de carbonyle p-trifluoro-méthoxyphényl-hydrazone; Asc = Ascorbate, TMPD = N,N,N′,N′-tétraméthyl-p-phénylènediamine, Succ = Succinate, M = Malate, P = Pyruvate, ADP = Adénosine diphosphate, NAD = Nicotinamide adénine dinucléotide, IMS = Espace intermembranaire, FAD = Flavine adénine dinucléotide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
L’analyse de la capacité OXPHOS mitochondriale à l’aide de HRR est devenue une méthode biochimique instrumentale de valeur diagnostique non seulement pour les défauts mitochondriaux primaires10,11, mais s’étendant à tous les autres domaines de la biologie tels que le cancer et le vieillissement12. HRR permet la détermination de la respiration cellulaire par l’analyse de la capacité mitochondriale OXPHOS, qui reflète directement une déficience individuelle ou combinée du complexe respiratoire mitochondrial, et est indirectement associée à un dysfonctionnement cellulaire et à une altération du métabolisme énergétique9. Sur le plan méthodologique, les mesures de la respiration sont effectuées à l’aide de cellules, detissus ou de mitochondries isolées 11,13,14, le matériel congelé ne convenant que partiellement15,16. Il est démontré que les tissus congelés ont un ETS intact avec une stabilité supercomplexe maintenue15. Ainsi, contrairement aux intermédiaires TCA traditionnels, les substrats respectifs sont directement introduits dans l’ETS. Cependant, le couplage entre la synthèse de l’ETS et de l’ATP est perdu car l’intégrité de la membrane est compromise par les dommages causés par le gel (formation de cristaux de glace).
Les expériences de respiration ont normalement lieu à une température physiologique de 37 °C pour les endothermes dans des cellules ou des tissus non perméabilisés ou perméabilisés. Alors que le premier considère le contexte métabolique cytosolique, le second fournit la contribution énergétique des complexes OXPHOS individuels et de l’ATPase par l’ajout de substrats spécifiques (et d’inhibiteurs). La séquence et la variation des substrats et des inhibiteurs ont conduit au développement d’un large éventail de protocoles SUIT17 etde tests 18 pour répondre à diverses questions scientifiques de la fonction OXPHOS (examinés sous12). Le protocole de base de la respiration cellulaire évalue quatre états différents: i) la respiration de routine - la respiration dans un milieu respiratoire respectif sans aucun ajout de substrats ou d’inhibiteurs consommant mais endogènes. Cet état peut révéler des OXPHOS généraux ou des défauts respiratoires induits secondaires causés, par exemple, par des profils de métabolites modifiés. Ensuite, l’ajout de l’inhibiteur de l’ATPase oligomycine révèle la perméabilité de la membrane mitochondriale interne aux protons, définie comme ii) la respiration des fuites. Le titrage ultérieur d’un protonophore tel que le décupleur cyanure de carbonyle p-trifluoro-méthoxyphényl-hydrazone (FCCP) permet de déterminer l’état auquel la capacité ETS est maximale dans un mode de circuit proton transmembranaire ouvert, défini comme iii) respiration non couplée. Il est important de noter qu’un état non couplé peut également se produire par des interventions expérimentales par des dommages mécaniques excessifs aux membranes mitochondriales. Inversement, l’état non couplé fait référence au découplage respiratoire par un mécanisme intrinsèque qui est physiologiquement contrôlé. Enfin, l’inhibition complète de l’ETS par addition de l’inhibiteur du complexe III antimycine et de l’inhibiteur du complexe I roténone détermine la consommation résiduelle d’oxygène (ROX) des processus non mitochondriaux consommant de l’oxygène (Figure 1A-C).
La bioénergétique mitochondriale se compose de cinq états respiratoires distincts19,20. La respiration de l’état 1 est sans substrats supplémentaires ni ADP, à l’exception de ce qui est disponible de manière endogène. Après l’ajout d’ADP, mais toujours, pas de substrats, la respiration de l’état 2 est atteinte. Lorsque des substrats sont ajoutés, permettant le transfert d’électrons et la synthèse de l’ATP, la respiration de l’état 3 est atteinte. Dans cet état, la capacité OXPHOS peut être définie à des concentrations saturantes d’ADP, de phosphate inorganique, d’oxygène, de substrats liés au NADH et au succinate. La respiration d’état 4 ou respiration LEAK peut être définie comme un état sans ADP ou ATP synthases inhibées chimiquement tout en ayant suffisamment de substrats. Enfin, lorsque tout l’oxygène est épuisé (anoxique) dans un cadre à chambre fermée, la respiration de l’état 5 est observée.
Plusieurs méthodes existent pour évaluer les états d’énergie cellulaire14 avec deux dispositifs dominant l’évaluation actuelle en temps réel d’OXPHOS par l’analyse de la consommation d’oxygène, mesurée comme la fonction de la diminution de l’oxygène au fil du temps dans un système à chambre fermée avec une applicabilité différente en fonction du modèle expérimental et de la question de recherche: le respiromètre haute résolution Oroboros 2k et l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF. Les deux appareils enregistrent les taux de consommation d’oxygène sous forme de diminution des picomoles (pmol) d’oxygène (O2) par seconde en tant que valeur absolue dans la chambre ou le puits de microplaque. La consommation spécifique d’oxygène par masse est obtenue en normalisant la consommation d’oxygène respective dans une recette tampon spécifique par nombre de cellules (millions), poids tissulaire (mg) ou quantité de protéines.
L’O2k (Oroboros Instruments) est un système fermé à deux chambres équipé d’un capteur d’oxygène polarographique (abrégé en respiromètre haute résolution à chambre: cHRR). Chaque chambre expérimentale contient 2 mL de liquide qui est maintenu homogène par des agitateurs magnétiques. Le capteur d’oxygène polarographique utilise une approche ampérométrique pour mesurer l’oxygène: il contient une cathode d’or, une anode argent/chlorure d’argent et entre les deux une solution KCI créant une cellule électrochimique sur laquelle une tension (0,8 V) est appliquée. L’oxygène du milieu d’essai diffuse à travers une membrane d’éthylène propylène fluoré de 25 μm (perméable àL’O2) et subit une réduction à la cathode, produisant du peroxyde d’hydrogène. À l’anode, l’argent est oxydé par le peroxyde d’hydrogène, générant un courant électrique. Ce courant électrique (ampère) est linéairement lié à la pression partielle d’oxygène. La pression partielle de l’oxygène et le facteur de solubilité en oxygène du milieu d’essai sont utilisés pour calculer la concentration en oxygène. Étant donné que la pression partielle d’oxygène dépend de la température expérimentale et que les mesures polarographiques sont sensibles à la température, les fluctuations de température nécessitent une régulation précise (±0,002 °C) par un bloc chauffant Peltier. La température peut être contrôlée dans une plage de 4 °C et 47 °C.
L’analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF (Agilent) est un système à base de plaques au format microplaque à 24 ou 96 puits dans lequel trois électrodes de fluorescence mesurent la consommation d’oxygène au fil du temps dans chaque puits (abrégé en respiromètre haute résolution à base de microplaques: mHRR). Un maximum de quatre ports dans la cartouche de dosage sont disponibles pour l’injection automatisée pendant le test. Un essai contient plusieurs cycles, chacun avec trois phases: 1) mélange, 2) attente et 3) mesure. Pendant la phase de mesure, les sondes de capteur sont abaissées dans la microplaque, créant une chambre temporairement fermée contenant un volume de 7 à 10 μL pour mesurer la lumière émise. Cette lumière est émise par des fluorophores incorporés dans des polymères à l’extrémité des sondes du capteur, qui détectentO2 en fonction de la trempe par phosphorescence. L’intensité du signal de fluorescence est proportionnelle àO2 et influencée par la température du capteur et du milieu d’essai. Par conséquent, une estimation précise de l’oxygène nécessite une approche relative avec un puits de fond sans aucun échantillon. La restauration de la concentration en oxygène se produit pendant la phase de mélange lorsque le capteur se déplace de haut en bas pour mélanger le volume au-dessus de la chambre temporaire. Chaque cycle calcule un taux de consommation d’oxygène. La température peut être contrôlée dans une plage de 16 °C et 42 °C.
HRR est l’étalon-or pour évaluer la bioénergétique cellulaire dans les maladies primaires et associées aux mitochondries et le métabolisme cellulaire général. Dans cette étude, des protocoles de base pour hrr sont fournis pour évaluer la fonction OXPHOS dans les cellules et les tissus.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig2v2.jpg"> Figure 2 : Flux de travail pour les préparations cellulaires et tissulaires pour la RDH et préparation cellulaire pour la respirométrie mHRR. (A) Aperçu des protocoles fournis. (B) Cellules de mammifères (étape 1.2) : pastille HEK293 égale à 3 x 106 cellules (panneau de gauche). Tissu non fibreux (étape 1.3) : Préparation du lysat de cervelet murin dans 2 mL de potier en téflon (panneau central). Perméabilisation musculaire squelettique induite par la saponine (étape 1.4) panneau de droite) pour la respirométrie cHRR. (C) Schéma standard d’ensemencement des microplaques (étape 2.4) et contrôle de la confluence pour l’analyse des cellules eucaryotes (HEK293) pour la respirométrie mHRR. (D, E) Schéma de chargement de l’orifice d’injection pour la respirométrie mHRR (étape 2.4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>07-358029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2 medical gas mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Potter for tissue grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PHR1279-1G</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty accid free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 4830</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 7752</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5628</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 0632</td>
			<td>Chemical, dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (High glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium&#160;(No Glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E 4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax&#160;(100x)&#160;(200 nM&#160;L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267151B</td>
			<td>Instrument for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>56750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 1000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 2383</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 7936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate&#160;(100 mM)&#160;(100x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA&#160;(Non-essential amino acids) 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal FBS&#160;(10x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Titration Set</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes for chemical injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O 4876</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 4509</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 2256</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA-Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td>High-throughput respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>72-57-1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two thin-edged forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine stock (500x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers

La respirométrie à haute résolution (HRR) permet de surveiller la phosphorylation oxydative en temps réel pour l’analyse des états énergétiques cellulaires individuels et l’évaluation des complexes respiratoires à l’aide de protocoles diversifiés de titrage substrat-découpleur-inhibiteur (SUIT). Ici, l’utilisation de deux appareils de respirométrie à haute résolution est démontrée, et une collection de base de protocoles applicables à l’analyse des cellules cultivées, des fibres musculaires squelettiques et cardiaques et des tissus mous tels que le cerveau et le foie sont présentés. Des protocoles pour les cellules et tissus cultivés sont fournis pour un respiromètre à chambre et des cellules cultivées pour un respiromètre à microplaques, tous deux englobant les protocoles de respiration standard. À des fins de comparaison, des cellules HEK293 conçues par CRISPR et déficientes en traduction mitochondriale provoquant une déficience multiple du système respiratoire sont utilisées avec les deux appareils pour démontrer des défauts cellulaires dans la respiration. Les deux respiromètres permettent une mesure complète de la respiration cellulaire avec leurs mérites techniques respectifs et leur adéquation en fonction de la question de recherche et du modèle à l’étude.

Ici, nous fournissons des protocoles pour déterminer la bioénergétique mitochondriale dans les cellules eucaryotes, les tissus non fibreux (par exemple, le cervelet) et les tissus fibreux (par exemple, le muscle squelettique). Pour les cellules eucaryotes, HEK293 avec knockout conçu par CRISPR de deux protéines différentes associées à la traduction mitochondriale entraînant un déficit multiple (CRISPRKO1) et sévère/complet en OXPHOS (CRISPRKO2) a été mesuré avec cHRR (<strong class="x...

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High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

L’évaluation de la phosphorylation oxydative à l’aide de respiromètres à haute résolution est devenue une partie intégrante de l’analyse fonctionnelle des mitochondries et du métabolisme énergétique cellulaire. Ici, nous présentons des protocoles pour l’analyse du métabolisme énergétique cellulaire à l’aide de respiromètres haute résolution à chambre et à microplaques et discutons des principaux avantages de chaque appareil.

La respirométrie à haute résolution pour évaluer la bioénergétique dans les cellules et les tissus à l’aide de respiromètres à chambre et à plaques

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and ...

Les mitochondries fournissent de l’énergie cellulaire par phosphorylation oxydative contribuant à presque tous les processus au sein de la cellule. Par conséquent, les dysfonctionnements mitochondriaux sont associés à un large éventail de maladies. Le principal avantage de cette technique est la mesure en temps réel de la bioénergétique mitochondriale par la consommation d’oxygène, et donc, une évaluation précise du métabolisme énergétique cellulaire total.La respirométrie à haute résolution permet une évaluation directe de ce qui échoue dans le système de phosphorylation oxydative, fournissant potentiellement des indices diagnostiques dans les maladies mitochondriales primaires et les dysfonctionnements mitochondriaux secondaires associés à de nombreux troubles. Ryan Awadhpersad, doctorant dans mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, effectuez l’étalonnage de l’oxygène en faisant fonctionner les respiromètres dans 2,1 millilitres de milieu respiratoire mitochondrial à 37 degrés Celsius pendant plus de 45 minutes et procédez si la variation de base est de moins de quatre picomoles par seconde.Culture de cellules HEK293 dans du DMEM à haute teneur en glucose complété par 10% de FBS activé par la chaleur, GlutaMAX, acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium et uridine dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5% de dioxyde de carbone. Le jour de l’expérience, collectez et comptez les cellules et remettez en suspension 2,5 millions de cellules dans un milieu respiratoire de 2,5 millilitres. Pour évaluer la respiration de routine, ajoutez 2,3 millilitres de suspension de cellules moyennes respiratoires chaudes à la chambre.Faites fonctionner les chambres à 37 degrés Celsius et à une vitesse d’agitation de 700 tr / min. Attendez au moins trois minutes pour permettre au fluide de se dégazer, puis fermez les chambres en tordant le bouchon dans un mouvement de rotation. Ensuite, aspirez l’excès de liquide sur le dessus du bouchon.Après 10 minutes, obtenez un signal de flux d’oxygène stable pour enregistrer la respiration de routine ou d’état I. Pour effectuer l’analyse OXPHOS dans des cellules intactes, ajouter deux microlitres d’oligomycine de 0,01 millimolaire pour une concentration finale de 10 nanomolaires. Titrer le FCCP à partir d’un stock de deux millimolaires en ajoutant 0,6 microlitre à des pas de 0,2 microlitre jusqu’à ce qu’aucune augmentation de la respiration ne soit observée et que la respiration soit découplée au maximum.Ensuite, ajoutez un microlitre de roténone millimolaire pour une concentration finale de 0,5 micromolaire. Ensuite, ajoutez deux microlitres d’un milligramme par millilitre de stock d’antimycine pour une concentration finale d’un microgramme par millilitre. Réoxygénez la chambre au même niveau d’oxygène, environ 150 micromolaires, en soulevant le piston.Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’ascorbate 0,8 molaire pour une concentration finale de deux millimolaires. Ensuite, ajoutez immédiatement cinq microlitres de TMPD 0,2 molaire pour une concentration finale de 0,5 millimolaire et évaluez l’activité IV complexe. Lorsque le flux d’oxygène maximal est atteint avec le TMPD, ajoutez cinq microlitres ou de l’azoture à quatre molaires pour une concentration finale de 10 millimolaires.Ensuite, continuez l’exécution pendant au moins cinq minutes pour tester l’auto-oxydation du TMPD pour le calcul complexe du niveau de base IV. Après l’exécution, prélever un millilitre de suspension d’échantillon dans chaque chambre et centrifuger à 1 000 G pour les cellules perméabilisées ou à 20 000 G pour le lysat tissulaire. Ensuite, jetez le surnageant et congelez la pastille à moins 80 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie en aval.Tout d’abord, ensemencez les cellules en fonction des taux de croissance des lignées cellulaires individuelles. Diluer l’oligomycine, le FCCP, la roténone et l’antimycine dans trois microlitres de milieu d’essai jusqu’à une concentration finale de 1,5 micromolaire, 1,125 micromolaire et un micromolaire, respectivement. Par la suite, remplissez-les dans des ports séparés.Observez les orifices d’injection pour assurer un chargement uniforme des échantillons. Allumez le système à base de microplaques et l’ordinateur et équilibrez-les à 37 degrés Celsius pendant au moins trois heures. Le jour du test sur microplaque, vérifiez la confluence de la plaque de culture cellulaire, la morphologie des cellules et assurez-vous que les puits de fond sont vides.Ensuite, retirez tout sauf 20 microlitres du milieu de culture de chaque puits. Ensuite, lavez chaque puits avec 90 microlitres de milieu d’essai et ajoutez 100 microlitres de milieu d’essai pour obtenir un volume final allant jusqu’à 120 microlitres. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur sans dioxyde de carbone pendant 60 minutes.Après avoir récupéré la plaque de l’incubateur, retirez le couvercle et placez la microplaque dans la fente. Cliquez sur Continuer pour démarrer la course. Une fois l’exécution terminée, retirez la plaque et retirez le milieu d’essai restant sans perturber les cellules.Ensuite, congelez toute la plaque à moins 80 degrés Celsius. Après avoir effectué les expériences de perméabilisation et de respiration de la digitonine, des traces de consommation d’oxygène brut de cellules HEK293 de type sauvage et de cellules HEK293 avec un knockout génétique médié par CRISPR entraînant de multiples carences en OXPHOS ont été enregistrées. Des traces de consommation d’oxygène normalisées par superposition de cellules ont été obtenues.CRISPR knockout 1 montre une respiration altérée et CRISPR knockout 2 ne montre aucune respiration par rapport au type sauvage lorsqu’il est normalisé au nombre de cellules. Les quantités de protéines ont été quantifiées et les valeurs de respiration ont été normalisées en proportion de la quantité de protéines afin de déterminer les valeurs absolues des états respiratoires et les rapports de contrôle du flux respectifs. Les taux d’acidification extracellulaire ont augmenté pour le déficit en OXPHOS dans CRISPR knockout 2, suggérant une compensation du déficit en phosphorylation oxydative mitochondriale dans les cellules HEK293 par une glycolyse accrue.De plus, les valeurs respiratoires ont été déterminées en présence d’oligomycine, de FCCP et de roténone, et les valeurs obtenues ont été normalisées à la quantité de protéines. Des traces de consommation d’oxygène normalisées par des protéines de cellules HEK293 de type sauvage et de cellules HEK293 présentant un déficit en traduction mitochondriale médié par CRISPR provoquant un déficit multiple en OXPHOS ont été étudiées. Des traces de consommation d’oxygène normalisées par les tissus humides du cervelet de la souris et du muscle soléaire de la souris ont été obtenues.Les muscles soléaires présentent une capacité d’OXPHOS et de respiration trois fois supérieure à celle du cervelet. Avec la respirométrie en chambre, il est important de travailler rapidement, car la fonction mitochondriale diminuera au moment où vous prélèverez vos échantillons, et avec la respirométrie sur plaque, il est crucial d’acquérir une densité d’ensemencement optimale pour minimiser la variabilité. Pour une analyse plus approfondie, la quantification des protéines ou l’immuno-blotting est possible.Cela pourrait déterminer si une altération de la fonction respiratoire mitochondriale était due à l’abondance de complexes OXPHOS ou à la quantité mitochondriale. Il y a déjà un siècle, on a découvert que les cellules cancéreuses effectuaient une glycolyse anaérobie en plus de l’OXPHOS mitochondrial. Cela souligne la nécessité de tester la bioénergétique mitochondriale.Ici, nous avons présenté deux respiromètres considérés comme l’étalon-or d’aujourd’hui.

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