Name: high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהאקדמיה של פינלנד (C.B.J), קרן מגנוס ארנרוט (C.B.J), ומלגת דוקטורט של בית הספר המשולב למדעי החיים (R.A.).

כל הניסויים בבעלי חיים מבוצעים בהתאם למועצה הלאומית לבדיקת ניסויים בבעלי חיים ולסוכנות המנהלית הממלכתית האזורית של דרום פינלנד. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6JOlaHsd זכרים (בני 4-6 חודשים). הסכמה לשימוש בקווי תאים אנושיים התקבלה מוועדת האתיקה המוסדית של אוניברסיטת הלסינקי.
<strong...

באופן מסורתי, ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית נחקרה עם אלקטרודות חמצן מסוג קלארק. עם זאת, היעדר פתרון ותפוקה מוצדקים להתקדמות טכנולוגית. עד כה, O2k (המכונה cHRR) ו- Seahorse XF96 Flux Analyzer (המכונה mHRR) אומצו באופן נרחב בתחום הביו-אנרגיה התאית. כאן, אנו מציגים אוסף מובן של פרוטוקולים לניתוח חילוף החומרים של האנר...

המיטוכונדריה ממלאת את אספקת האנרגיה העיקרית ומהווה אברון ממודר התורם לתהליכים ביו-אנרגטיים ומטבוליים תאיים חיוניים כגון אנאבוליזם של נוקלאוטידים, ליפידים וחומצות אמינו, ביוגנזה של צבירי ברזל-גופרית והם מעורבים באיתות כגון מוות מבוקר של תאים 1,2,3 . ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית באמצעות זרחון חמצוני תורמת כמעט לכל התהליכים התאיים בתוך התא, וכתוצאה מכך, תפקודים מיטוכונדריאליים ממקור ראשוני או משני קשורים לספקטרום רחב של תנאי מחלה 4,5. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה לא רק כרוך בשינויים במבנה או בצפיפות המיטוכונדרית אלא גם באיכות ובוויסות של מערכת הנשימה6. אלמנט איכותי זה מקיף בקרת מצע, מאפייני צימוד, שינויים לאחר התרגום, דינמיקה של כריסטה וסופר-קומפלקסים נשימתיים 7,8. לכן, ניתוח מדויק של ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית עבור גישות ניסיוניות ואבחון להערכת חילוף החומרים האנרגטי של התא חשוב בבריאות ובמחלות.
זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) הוא רצף של תגובות בתוך מערכת הנשימה או מערכת העברת אלקטרונים (ETS) ליצירת אנרגיה תאית באמצעות אדנוזין טריפוספט (ATP)9. הצעד הרב-אנזימטי לרתום אנרגיה מזרימת אלקטרונים דרך קומפלקסים I ו-II ל-IV מורכב יוצר שיפוע פרוטונים אלקטרוכימי על פני הממברנה המיטוכונדרית הפנימית, המשמשת לאחר מכן לזרחון של אדנוזין דיפוספט (ADP) ל-ATP באמצעות V מורכב (F1 F 1FO ATP synthase) (איור 1A).
ראשית, נשאים של שני אלקטרונים נוצרים במהלך המחזור הטריקרבוקסילי (TCA), הגליקוליזה וחמצון הפירובט: ניקוטיןמיד אדנין דינוקלאוטיד (NADH) ודיהידרופלבין אדנין דינוקלאוטיד (FADH2). NADH מתחמצן בקומפלקס I (NADH dehydrogenase), שבמהלכו שני אלקטרונים מועברים לקו-אנזים Q (קינון מצטמצם לקינול), בעוד פרוטונים נשאבים לתוך החלל הבין-מימי (IMS). שנית, קומפלקס II (סוקסינט דהידרוגנאז) מחמצן את FADH2 ומזין את האלקטרונים לקו-אנזים Q מבלי לשאוב פרוטונים. שלישית, בקומפלקס III (Cytochrome c oxidoreductase), אלקטרונים מקו-אנזים Q מועברים לציטוכרום c בעוד פרוטונים נשאבים לתוך ה-IMS. רביעית, ציטוכרום c מעביר את האלקטרונים ל-IV מורכב (Cytochrome c oxidase), הקומפלקס הסופי לשאיבת פרוטונים, וכאשר חמצן מתפקד כמקבל אלקטרונים להטמעת פרוטונים, ובסופו של דבר יוצר מים. זהו חמצן זה כי המיטוכונדריה צורכת אשר ניתן למדוד על ידי אוקסיגרף. לבסוף, הפרוטונים הנוצרים מקומפלקס I, קומפלקס III ו- IV מורכב משמשים לסיבוב V מרוכב, ובכך יוצרים ATP9.
חשוב לציין, העברת אלקטרונים מתרחשת לא רק באופן ליניארי, המסומן אחרת כשרשרת הובלת האלקטרונים. במקום זאת, ניתן להעביר אלקטרונים למאגר הקו-אנזים Q דרך מספר מסלולי נשימה ולהקל על זרימת אלקטרונים מתכנסת. NADH-substrates ו succinate, למשל, יכולים להיכנס דרך קומפלקס I ו- II מורכב, בהתאמה. ניתן לתרום אלקטרונים מחמצון חומצות שומן באמצעות קומפלקס פלבופרוטאין המעביר אלקטרונים. ואכן, ניתוח מקיף של OXPHOS דורש גישה הוליסטית עם מצעי דלק מתאימים (איור 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig1v2.jpg"> איור 1: זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי ופרוטוקולים ספציפיים של מצע ומעכבים. כל המבנים הם מ- PDB. האיורים מתארים רק מצעים ומעכבים המתוארים במחקר זה). (B) עקבות דגימה של שטף חמצן בתאי HEK293 שלמים באמצעות פרוטוקול סטנדרטי במכשיר mHRR. (C) עקבות דגימה של שטף חמצן בתאי HEK293 שלמים באמצעות פרוטוקול סטנדרטי בהתקן cHRR. (D) עקבות דגימה של שטף חמצן בפיברובלסטים אנושיים מחלחלים מתורם בריא עם פרוטוקול SUIT המתאים. קיצורים: 1 = נשימה שגרתית של תאים שלמים; 2 = מדינה 2; 3 = מדינה 3(I); 4 = מדינה 3(I) עם cytC; 5 = מדינה 3 (I+II); 6 = דליפה(OM); 7 = קיבולת ETS; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = רוטנון, AM = אנטימיצין, ATP = אדנוזין טריפוספט, Az = Azide, OM = אוליגומיצין, FCCP = קרבוניל ציאניד p-טריפלואורו-מתוקסיפניל-הידרזון; Asc = Ascorbate, TMPD = N,N,N,N′,N′-tetramethyl-p-phenylenediamine, Succ = Succinate, M = מלאט, P = פירובט, ADP = אדנוזין דיפוספט, NAD = ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד, IMS = מרחב אינטרממברנה, FAD = פלווין אדנין דינוקלאוטיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
ניתוח של יכולת OXPHOS מיטוכונדריאלית באמצעות HRR הפך לשיטה ביוכימית אינסטרומנטלית בעלת ערך אבחוני לא רק עבור פגמים מיטוכונדריאליים ראשוניים10,11 אלא מתרחב לכל תחומי הביולוגיה האחרים כגון סרטן והזדקנות12. HRR מאפשר לקבוע את הנשימה התאית על ידי ניתוח של יכולת OXPHOS המיטוכונדרית, אשר משקפת ישירות מחסור מורכב נשימתי מיטוכונדריאלי בודד או משולב, ובעקיפין קשורה לתפקוד לקוי של התאים ושינוי בחילוף החומרים של האנרגיה9. מבחינה מתודולוגית, מדידות נשימה מבוצעות באמצעות תאים, רקמה או מיטוכונדריה מבודדת 11,13,14, כאשר החומר הקפוא מתאים רק באופן חלקיל-15,16. רקמה קפואה הוכחה כבעלת ETS שלם עם יציבות סופר-קומפלקס15. לפיכך, בניגוד למתווכים מסורתיים של TCA, המצעים המתאימים מוזנים ישירות לתוך ה- ETS. עם זאת, הצימוד בין הסינתזה של ETS לסינתזה של ATP הולך לאיבוד כאשר שלמות הממברנה נפגעת באמצעות נזקי הקפאה (היווצרות גבישי קרח).
ניסויי הנשימה נערכים בדרך כלל בטמפרטורה פיזיולוגית של 37 מעלות צלזיוס עבור אנדותרמים בתאים או רקמה שאינם מחלחלים או חודרים. בעוד הראשון רואה את ההקשר המטבולי הציטוזולי, האחרון מספק את התרומה האנרגטית של קומפלקסים OXPHOS בודדים ואת ה- ATPase באמצעות הוספת מצעים ספציפיים (ומעכבים). הרצף והשונות של מצעים ומעכבים הובילו לפיתוח מערך מגוון של פרוטוקולי SUIT17 ומבחנים18 כדי לענות על שאלות מדעיות שונות של תפקוד OXPHOS (שנסקרו תחת12). הפרוטוקול הבסיסי של הנשימה התאית מעריך ארבעה מצבים שונים: א) נשימה שגרתית - הנשימה במדיית הנשימה המתאימה ללא כל תוספת של מצעים או מעכבים הצורכים מצעים אך אנדוגניים. מצב זה יכול לחשוף OXPHOS כללי או פגמי נשימה הנגרמים משנית הנגרמים, למשל, על ידי פרופילי מטבוליטים שהשתנו. לאחר מכן, התוספת של מעכב ATPase אוליגומיצין חושפת את החדירות של הממברנה המיטוכונדרית הפנימית לפרוטונים, המוגדרים כ- ii) נשימת דליפה. טיטרציה עוקבת של פרוטונופור כגון קרבוניל ציאניד p-trifluoro-מתוקסיפניל-הידרזון (FCCP) מאפשרת לקבוע את המצב שבו קיבולת ETS היא מקסימלית במצב מעגל פרוטון פתוח-טרנס-ממברני, המוגדר כ- iii) נשימה לא משותפת. חשוב לציין, מצב לא מגובש יכול להתרחש גם על ידי התערבויות ניסיוניות באמצעות נזק מכני מוגזם לממברנות המיטוכונדריה. לעומת זאת, המצב הלא מצומד מתייחס לאי-שיתוף פעולה נשימתי על ידי מנגנון פנימי הנשלט מבחינה פיזיולוגית. לבסוף, עיכוב מלא של ETS על ידי הוספת אנטימיצין מעכב III מורכב ומעכב I מורכב רוטנון קובע את צריכת החמצן השיורית (ROX) מתהליכים שאינם צורכים חמצן מיטוכונדריאלי (איור 1A-C).
ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית מורכבת מחמישה מצבי נשימה נפרדים19,20. הנשימה של מצב 1 היא ללא כל מצעים נוספים או ADP, למעט מה שזמין באופן אנדוגני. לאחר הוספת ADP, אך עדיין, אין מצעים, מושגת הנשימה של המדינה 2. כאשר מוסיפים מצעים, המאפשרים העברת אלקטרונים וסינתזת ATP, מגיעים למצב 3 הנשימה. במצב זה, ניתן להגדיר את יכולת ה-OXPHOS בריכוזים רוויים של ADP, פוספט אנאורגני, חמצן, NADH ומצעים הקשורים לסוקסינט. ניתן להגדיר את הנשימה של מצב 4 או נשימה של דליפה כמצב ללא ADP או סינתזות ATP מעוכבות כימית תוך שימוש במצעים מספיקים. לבסוף, כאשר כל החמצן מתרוקן (אנוקסי) בסביבה של תא סגור, נצפתה נשימה במצב 5.
קיימות מספר שיטות להערכת מצבי אנרגיה תאית14 עם שני מכשירים השולטים בהערכה הנוכחית בזמן אמת של OXPHOS באמצעות ניתוח של צריכת חמצן, הנמדדת כפונקציה של הירידה בחמצן לאורך זמן במערכת סגורה עם ישימות שונה התלויה במודל הניסוי ובשאלת המחקר: מד הנשימה ברזולוציה גבוהה של Oroboros 2k ומנתח השטף החוץ-תאי של סוסון הים XF. שני המכשירים מתעדים את שיעורי צריכת החמצן כירידה בפיקומולים (pmol) של חמצן (O2) לשנייה כערך מוחלט בתוך החדר או באר המיקרו-פלטה. צריכת החמצן הספציפית לכל מסה מתקבלת על ידי נורמליזציה של צריכת החמצן המתאימה במתכון חיץ ספציפי למספר תאים (מיליונים), משקל רקמה (מ"ג) או כמות חלבון.
O2k (מכשירי אורובורוס) היא מערכת סגורה בעלת שני תאים המצוידת בחיישן חמצן פולרוגרפי (מקוצר כ-respirometer מבוסס תא ברזולוציה גבוהה: cHRR). כל תא ניסוי מכיל 2 מ"ל של נוזל אשר נשמר הומוגני על ידי מערבלים מגנטיים. חיישן החמצן הפולארוגרפי משתמש בגישה אמפרומטרית למדידת החמצן: הוא מכיל קתודה מוזהבת, אנודה כסף/כסף כלוריד, ובין לבין תמיסת KCI היוצרת תא אלקטרוכימי שעליו מופעל מתח (0.8 וולט). חמצן ממדיום הבדיקה מתפזר דרך קרום אתילן פרופילן פלואור של 25 מיקרומטר (O2-חדיר) ועובר הפחתה בקתודה, ומייצר מי חמצן. באנודה, כסף מחומצן על ידי מי חמצן, ומייצר זרם חשמלי. זרם חשמלי זה (אמפר) קשור באופן ליניארי ללחץ החמצן החלקי. הלחץ החלקי של החמצן ומקדם מסיסות החמצן של מדיום הבדיקה משמשים לחישוב ריכוז החמצן. מכיוון שלחץ חלקי של חמצן תלוי בטמפרטורה ניסיונית ומדידות פולארוגרפיות רגישות לטמפרטורה, תנודות בטמפרטורה זקוקות לוויסות מדויק (±0.002 מעלות צלזיוס) על ידי בלוק חימום פלטייה. ניתן לשלוט בטמפרטורה בטווח של 4 °C (4 °F) ו- 47 °C (74 °F).
מנתח השטף החוץ-תאי של סוסון הים XF (Agilent) הוא מערכת מבוססת צלחת עם פורמט מיקרו-פלטה של 24 או 96 בארות שבה שלוש אלקטרודות פלואורסצנטיות מודדות את צריכת החמצן לאורך זמן בכל באר (מקוצרת כ-respirometer מבוסס מיקרו-פלטה ברזולוציה גבוהה: mHRR). לכל היותר ארבע יציאות במחסנית הבדיקה זמינות להזרקה אוטומטית במהלך הבדיקה. בדיקה מכילה מספר מחזורים, שלכל אחד מהם שלושה שלבים: 1) ערבוב, 2) המתנה ו-3) מדידה. במהלך שלב המדידה, בדיקות החיישן מורדות לתוך המיקרו-לוחית ויוצרות תא סגור באופן זמני המכיל נפח של 7-10 מיקרול' למדידת האור הנפלט. אור זה נפלט על ידי פלואורופורים משובצי פולימר על קצה גשושיות החיישן, אשר חשים את O2 בהתבסס על מרווה זרחנית. עוצמת האות הפלואורסצנטי פרופורציונלית ל-O2 ומושפעת מטמפרטורת החיישן ומתווך הבדיקה. לכן, הערכת חמצן מדויקת דורשת גישה יחסית עם רקע היטב ללא כל דגימה. שחזור ריכוז החמצן מתרחש במהלך שלב הערבוב כאשר החיישן נע מעלה ומטה כדי לערבב את הנפח מעל התא הזמני. כל מחזור מחשב קצב צריכת חמצן אחד. ניתן לשלוט בטמפרטורה בטווח של 16 מעלות צלזיוס ו-42 מעלות צלזיוס.
HRR הוא תקן הזהב להערכת ביו-אנרגיה תאית במחלות ראשוניות הקשורות למיטוכונדריה ובחילוף חומרים תאי כללי. במחקר זה, פרוטוקולים בסיסיים עבור HRR מסופקים כדי להעריך את תפקוד OXPHOS בתאים וברקמות.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig2v2.jpg"> איור 2: זרימת עבודה להכנה של תאים ורקמות ל-cHRR, והכנת תאים לנשימה של mHRR. (A) חלוקה לרמות של פרוטוקולים שסופקו. (B) תאי יונקים (שלב 1.2): כדור HEK293 השווה ל-3 x 106 תאים (לוח שמאלי). רקמה לא סיבית (שלב 1.3): הכנת מורין המוח הקטן ליזט ב-2 מ"ל קדר טפלון (לוח אמצעי). חדירה של שרירי השלד המושרה על ידי ספונין (שלב 1.4) פאנל ימני) עבור respirometry cHRR. (C) פריסת זריעת מיקרו-פלטה סטנדרטית (שלב 2.4) ובדיקת מפגש לניתוח תאים אאוקריוטים (HEK293) עבור נשימה mHRR. (ד, ה) סכימה של טעינת יציאת הזרקה עבור respirometry mHRR (שלב 2.4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>07-358029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2 medical gas mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Potter for tissue grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PHR1279-1G</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty accid free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 4830</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 7752</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5628</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 0632</td>
			<td>Chemical, dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (High glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium&#160;(No Glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E 4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax&#160;(100x)&#160;(200 nM&#160;L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267151B</td>
			<td>Instrument for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>56750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 1000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 2383</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 7936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate&#160;(100 mM)&#160;(100x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA&#160;(Non-essential amino acids) 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal FBS&#160;(10x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Titration Set</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes for chemical injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O 4876</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 4509</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 2256</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA-Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td>High-throughput respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>72-57-1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two thin-edged forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine stock (500x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers

נשימה ברזולוציה גבוהה (HRR) מאפשרת ניטור של זרחון חמצוני בזמן אמת לניתוח מצבי אנרגיה תאיים בודדים ולהערכת קומפלקסים נשימתיים באמצעות פרוטוקולים מגוונים של טיטרציה מעכבי מצע-לא-מעכבי-קופלר (SUIT). כאן מודגם השימוש בשני מכשירי נשימה ברזולוציה גבוהה, ומוצג אוסף בסיסי של פרוטוקולים החלים על ניתוח תאים בתרבית, סיבי שרירי שלד ולב, ורקמות רכות כגון המוח והכבד. פרוטוקולים לתאים ורקמות בתרבית מסופקים עבור מד נשימה מבוסס תא ותאים בתרבית עבור מד נשימה מבוסס מיקרו-פלטה, שניהם מקיפים פרוטוקולי נשימה סטנדרטיים. למטרות השוואה, תאי HEK293 המהונדסים על ידי קריספר, החסרים בתרגום המיטוכונדריה הגורמים למחסור רב במערכת הנשימה, משמשים בשני המכשירים כדי להדגים פגמים תאיים בנשימה. שני ה-respirometers מאפשרים מדידה מקיפה של הנשימה התאית, כאשר היתרונות הטכניים וההתאמה שלהם תלויים בשאלת המחקר ובמודל הנחקר.

כאן אנו מספקים פרוטוקולים לקביעת הביו-אנרגיה המיטוכונדרית בתאים אאוקריוטים, רקמה לא סיבית (למשל, המוח הקטן) ורקמה סיבית (למשל, שרירי השלד). עבור תאים אאוקריוטים, HEK293 עם נוקאאוט מהונדס קריספר של שני חלבונים שונים הקשורים לתרגום מיטוכונדריאלי וכתוצאה מכך מרובים (CRISPRKO1) ומחסור חמור/שלם ב...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers at JoVE.com

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

הערכת זרחון חמצוני באמצעות מד נשימה ברזולוציה גבוהה הפכה לחלק בלתי נפרד מהניתוח הפונקציונלי של מיטוכונדריה ומטבוליזם של אנרגיה תאית. כאן אנו מציגים פרוטוקולים לניתוח חילוף החומרים של אנרגיה תאית באמצעות מדים מבוססי תאים ומיקרו-פלטות ברזולוציה גבוהה ודנים ביתרונות העיקריים של כל מכשיר.

Respirometry ברזולוציה גבוהה להערכת ביו-אנרגיה בתאים וברקמות באמצעות מדים מבוססי תאים ולוחות

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and ...

המיטוכונדריה מספקת אנרגיה תאית באמצעות זרחון חמצוני התורם כמעט לכל התהליכים בתוך התא. כתוצאה מכך, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור לספקטרום רחב של מחלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מדידה בזמן אמת של ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית על ידי צריכת חמצן, ובכך, הערכה מדויקת של חילוף החומרים הכולל של האנרגיה התאית.נשימה ברזולוציה גבוהה מאפשרת הערכה ישירה של מה שבמערכת הזרחון החמצוני נכשל, מה שעשוי לספק רמזים אבחנתיים במחלות מיטוכונדריאליות ראשוניות ותפקוד לקויות משניות של המיטוכונדריה הקשורות להפרעות רבות. מי שידגים את ההליך יהיה ריאן אוואדהפרסאד, דוקטורנט במעבדה שלי. כדי להתחיל, לבצע את כיול החמצן על ידי הפעלת respirometers ב 2.1 מיליליטרים של מדיום נשימה מיטוכונדריאלי ב 37 מעלות צלזיוס במשך יותר מ 45 דקות ולהמשיך אם השינוי הבסיסי הוא בתוך ארבעה picomoles לשנייה.תאי HEK293 בתרבית ב-DMEM עתיר גלוקוז בתוספת 10% FBS המופעלת על ידי חום, גלוטמקס, חומצות אמינו לא חיוניות, נתרן פירובט ואורידין באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני. ביום הניסוי, אספו וספרו את התאים והחזירו 2.5 מיליון תאים במדיום נשימה של 2.5 מיליליטרים. כדי להעריך את הנשימה השגרתית, הוסיפו 2.3 מיליליטרים של תרחיף תא בינוני לנשימה חמה לתא.הפעילו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ובמהירות ערבוב של 700 סל"ד. המתן לפחות שלוש דקות כדי לאפשר לתקשורת להתרוקן מהגז, ואז סגור את התאים על ידי סיבוב הפקק בתנועה מסתובבת. לאחר מכן, לשאוף את הנוזל העודף על גבי הפקק.לאחר 10 דקות, קבל אות שטף חמצן יציב כדי להקליט שגרה או מצב הנשימה שלי. כדי לבצע ניתוח OXPHOS בתאים שלמים, הוסיפו שני מיקרוליטרים של אוליגומיצין 0.01-מילימולר לריכוז סופי של 10-ננומולאר. Titrate FCCP ממלאי של שני מילימולרים על ידי הוספת 0.6 מיקרוליטרים בצעדים של 0.2 מיקרוליטר עד שלא נצפתה עלייה בנשימה והנשימה אינה מתואמת באופן מקסימלי.לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של רוטנון מילימולרי אחד לריכוז סופי של 0.5 מיקרומולר. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של מלאי אנטימיצין אחד למיליליטר לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר. יאוקסיגנסציה מחדש של התא לאותה רמת חמצן, כ-150 מיקרומולר, על ידי הרמת הבוכנה.לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של אסקורבט טוחנות 0.8 לריכוז סופי של שני מילימולרים. לאחר מכן, מיד להוסיף חמישה microliters של 0.2-טוחנת TMPD עבור ריכוז סופי של 0.5-millimolar ולהעריך פעילות IV מורכב. כאשר מגיעים לשיא שטף החמצן עם TMPD, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים או אזיד ארבע טוחנות לריכוז סופי של 10 מילימולאר.לאחר מכן, המשך את הריצה במשך חמש דקות לפחות כדי לבחון חמצון אוטומטי של TMPD לצורך חישוב רמת בסיס IV מורכב. לאחר הריצה, לאסוף מיליליטר אחד של תרחיף דגימה מכל תא וצנטריפוגה ב 1, 000 G עבור תאים permeabilized או ב 20, 000 G עבור ליזוז רקמה. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והקפיאו את הכדור במינוס 80 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח נוסף במורד הזרם.ראשית, זרעו את התאים על פי קצבי הגדילה של קווי תאים בודדים. אוליגומיצין מדולל, FCCP, רוטנון ואנטימיצין בשלושה מיקרוליטרים של מדיום בדיקה עד לריכוז סופי של 1.5 מיקרומולר, 1.125-מיקרומולר ומיקרומולר אחד, בהתאמה. לאחר מכן, מלא אותם ליציאות נפרדות.שימו לב ליציאות ההזרקה כדי להבטיח טעינה אחידה של הדגימות. הפעילו את המערכת והמחשב המבוססים על מיקרו-לוחות ושיזבו אותם ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לפחות. ביום הבדיקה המבוססת על מיקרו-פלטה, אמתו את המפגש של צלחת תרבית התאים, את המורפולוגיה של התאים, וודאו כי בארות הרקע ריקות.לאחר מכן, הסר הכל מלבד 20 מיקרוליטרים של מדיום התרבית מכל באר. לאחר מכן, שטפו כל באר עם 90 מיקרוליטרים של מדיום בדיקה והוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיום בדיקה כדי ליצור נפח סופי של עד 120 מיקרוליטרים. לאחר מכן, לדגום את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור ללא פחמן דו חמצני במשך 60 דקות.לאחר שליפת הצלחת מהאינקובטור, הסר את המכסה והנח את המיקרו-פלטה בחריץ. לחץ על המשך כדי להתחיל את הריצה. לאחר סיום הריצה, הוציאו את הצלחת והסירו את אמצעי הבדיקה הנותרים מבלי להפריע לתאים.לאחר מכן, הקפיאו את הצלחת כולה במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר ביצוע ניסויי החדירה והנשימה של דיגיטיונין, נרשמו עקבות צריכת חמצן גולמית של תאי HEK293 מסוג פראי ותאי HEK293 עם נוקאאוט גנים בתיווך קריספר וכתוצאה מכך תועדו ליקויים מרובים ב-OXPHOS. התקבלו עקבות צריכת חמצן מנורמלים של קלט תאי שכבת-על.נוקאאוט קריספר 1 מראה נשימה לקויה ונוקאאוט קריספר 2 לא מראה שום נשימה בהשוואה לסוג פראי כאשר הוא מנורמל למספר התא. כמויות החלבון כומתו וערכי הנשימה נורמלו לכמות החלבון על מנת לקבוע ערכים מוחלטים של מצבי נשימה ויחסי בקרת שטף בהתאמה. נמצא כי שיעורי ההחמצה החוץ-תאית עלו בגין מחסור ב-OXPHOS בנוקאאוט 2 של קריספר, מה שמרמז על פיצוי על מחסור בזרחון חמצוני מיטוכונדריאלי בתאי HEK293 באמצעות גליקוליזה מוגברת.בנוסף, ערכי הנשימה נקבעו בנוכחות אוליגומיצין, FCCP ורוטנון, והערכים שהתקבלו נורמלו לכמות החלבון. נחקרו עקבות של צריכת חמצן מנורמלת חלבונים של תאי HEK293 מסוג בר ותאי HEK293 עם מחסור בתרגום מיטוכונדריאלי בתיווך קריספר, הגורם למחסור רב ב-OXPHOS. התקבלו עקבות צריכת חמצן מנורמלים של רקמות במשקל רטוב של המוח הקטן של העכבר ושריר הסולאוס של העכבר.שרירי הסולאוס מראים פי שלושה יותר OXPHOS ויכולת נשימה מאשר המוח הקטן. עם נשימה מבוססת תא, חשוב לעבוד מהר, מכיוון שתפקוד המיטוכונדריה תפחת ברגע שאתה אוסף את הדגימות שלך, ועם נשימה מבוססת צלחת, חיוני לרכוש צפיפות זריעה אופטימלית כדי למזער את השונות. לצורך ניתוח נוסף, כימות חלבונים או כתם חיסוני אפשרי.זה יכול לקבוע אם שינוי בתפקוד הנשימה המיטוכונדריאלי נבע משפע של קומפלקסים OXPHOS או כמות המיטוכונדריה. כבר לפני מאה שנה נמצא כי תאים סרטניים מבצעים גליקוליזה אנאירובית בנוסף ל-OXPHOS המיטוכונדריאלי. זה מדגיש את הצורך לבחון ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית.כאן הדגמנו שני מדים שנחשבים לתקן הזהב של היום.

Research

JoVE Journal

Biology

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

שימוש ברזולוציה גבוהה טומוגרפיה ממוחשבת כדי להמחיש את המבנה התל ממדים ופונקציה של הצמח vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

השתקת<em&gt; BRCA2</em&gt; לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר BRCA2 רומן בתאי אדם בתרבית

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את הפונקציה מיטוכונדריאלי של תאי הבטא תקין בנוכחות תרכובות טבעיות

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...