Name: high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dell'Accademia di Finlandia (C.B.J),della Magnus Ehrnroot Foundation (C.B.J) e da una borsa di dottorato della Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

Tutta la sperimentazione animale viene eseguita in conformità con il National Animal Experiment Review Board e l'Agenzia amministrativa regionale statale per la Finlandia meridionale. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6JOlaHsd (4-6 mesi) Il consenso per l'uso di linee cellulari umane è stato ottenuto dal comitato etico istituzionale dell'Università di Helsinki.
1. Respirometria ad alta risoluzione: respirometro a camera (cHRR)
<p class="jove_content...

Tradizionalmente, la bioenergetica mitocondriale è stata studiata con elettrodi di ossigeno di tipo Clark. Una mancanza di risoluzione e throughput, tuttavia, giustificata per il progresso tecnologico. Ad oggi, l'O2k (indicato come cHRR) e il Seahorse XF96 Flux Analyzer (denominato mHRR) sono stati ampiamente adottati nel campo della bioenergetica cellulare. Qui, presentiamo una raccolta comprensibile di protocolli per l'analisi del metabolismo energetico cellulare attraverso la valutazione della respirazione mitocondri...

I mitocondri soddisfano la fornitura chiave di energia e sono un organello compartimentato che contribuisce a processi bioenergetici e metabolici cellulari essenziali come l'anabolismo di nucleotidi, lipidi e amminoacidi, biogenesi del cluster ferro-zolfo e sono implicati nella segnalazione come la morte cellulare controllata 1,2,3 . La bioenergetica mitocondriale attraverso la fosforilazione ossidativa contribuisce a quasi tutti i processi cellulari all'interno della cellula e, di conseguenza, le disfunzioni mitocondriali di origine primaria o secondaria sono associate a un ampio spettro di condizioni di malattia 4,5. La disfunzione mitocondriale comporta non solo alterazioni della struttura o della densità mitocondriale, ma anche della qualità e della regolazione dell'apparato respiratorio6. Questo elemento qualitativo comprende il controllo del substrato, le caratteristiche di accoppiamento, le modifiche post-traduzionali, la dinamica delle cristae e i supercomplessi respiratori 7,8. Pertanto, un'analisi accurata della bioenergetica mitocondriale per approcci sperimentali e diagnostici per valutare il metabolismo energetico della cellula è importante per la salute e la malattia.
La fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) è una sequenza di reazioni all'interno del sistema respiratorio o del sistema di trasferimento di elettroni (ETS) per la generazione di energia cellulare attraverso l'adenosina trifosfato (ATP)9. La fase multienzimatica per sfruttare l'energia dal flusso di elettroni attraverso i complessi I e II al complesso IV genera un gradiente protonico elettrochimico attraverso la membrana mitocondriale interna, successivamente utilizzato per la fosforilazione dell'adenosina difosfato (ADP) all'ATP tramite il complesso V (F1FO ATP sintasi) (Figura 1A).
In primo luogo, i vettori di due elettroni vengono generati durante il ciclo tricarbossilico (TCA), la glicolisi e l'ossidazione del piruvato: nicotinamide adenina dinucleotide (NADH) e diidroflavina adenina dinucleotide (FADH2). Il NADH viene ossidato nel complesso I (NADH deidrogenasi), durante il quale due elettroni vengono trasferiti al coenzima Q (il chinone viene ridotto a chinolo), mentre i protoni vengono pompati nello spazio intermembrana (IMS). In secondo luogo, il complesso II (Succinato deidrogenasi) ossida FADH2 e alimenta gli elettroni al coenzima Q senza pompare protoni. In terzo luogo, nel complesso III (citocromo c ossidoreduttasi), gli elettroni del coenzima Q vengono trasferiti al citocromo c mentre i protoni vengono pompati nell'IMS. In quarto luogo, il citocromo c trasferisce gli elettroni al complesso IV (citocromo c ossidasi), il complesso finale per pompare protoni e dove l'ossigeno funziona come un accettore di elettroni per assimilare i protoni, formando infine acqua. È questo ossigeno che i mitocondri consumano che può essere misurato da un ossigrafo. Infine, i protoni generati dal complesso I, dal complesso III e dal complesso IV vengono utilizzati per ruotare il complesso V, generando così ATP9.
È importante sottolineare che il trasferimento di elettroni avviene non solo in modo lineare, altrimenti indicato come la catena di trasporto degli elettroni. Invece, gli elettroni possono essere trasferiti al pool di coenzima Q attraverso più vie respiratorie e facilitare il flusso di elettroni convergenti. I substrati nadH e il succinato, ad esempio, possono entrare rispettivamente attraverso il complesso I e il complesso II. Gli elettroni dell'ossidazione degli acidi grassi possono essere donati tramite il complesso flavoproteico che trasferisce elettroni. In effetti, un'analisi completa di OXPHOS richiede un approccio olistico con substrati di carburante appropriati (Figura 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig1v2.jpg"> Figura 1: Fosforilazione ossidativa mitocondriale e protocolli specifici di substrato e inibitori. (A) Mitocondrio e schema del sistema di trasferimento di elettroni (CI-CIV) e F1F0 ATP sintasi mitocondriale (CV). Tutte le strutture provengono da PDB. Le figure raffigurano solo substrati e inibitori descritti in questo studio). (B) Traccia campione di flusso di ossigeno in celle HEK293 intatte utilizzando il protocollo standard in un dispositivo mHRR. (C) Traccia campione di flusso di ossigeno in celle HEK293 intatte utilizzando il protocollo standard in un dispositivo cHRR. (D) Traccia campione del flusso di ossigeno nei fibroblasti umani permeabilizzati da un donatore sano con il rispettivo protocollo SUIT. Abbreviazioni: 1 = Respirazione di routine delle cellule intatte; 2 = Stato 2; 3 = Stato 3(I); 4 = Stato 3(I) con cytC; 5 = Stato 3 (I+II); 6 = Perdita(OM); 7 = capacità ETS; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenone, AM = Antimicina, ATP = Adenosina trifosfato, Az = Azide, OM = Oligomicina, FCCP = cianuro di carbonile p-trifluoro-metossifenil-idrazzone; Asc = Ascorbato, TMPD = N,N,N′,N′-tetrametil-p-fenilendiammina, Succ = Succinato, M = Malato, P = Piruvato, ADP = Adenosina difosfato, NAD = Nicotinamide adenina dinucleotide, IMS = Spazio intermembrana, FAD = Flavin adenina dinucleotide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'analisi della capacità di OXPHOS mitocondriale utilizzando HRR è diventata un metodo biochimico strumentale di valore diagnostico non solo per i difetti mitocondriali primari10,11 ma estendendosi a tutti gli altri regni della biologia come il cancro e l'invecchiamento12. HRR consente la determinazione della respirazione cellulare mediante l'analisi della capacità mitocondriale oxphos, che riflette direttamente il deficit del complesso respiratorio mitocondriale individuale o combinato, e indirettamente è associato a disfunzione cellulare e metabolismo energetico alterato9. Metodologicamente, le misurazioni della respirazione vengono eseguite utilizzando cellule, tessuti o mitocondri isolati 11,13,14, con materiale congelato solo parzialmente adatto 15,16. Il tessuto congelato ha dimostrato di avere un ETS intatto con stabilità supercomplessa mantenuta15. Pertanto, a differenza dei tradizionali intermedi TCA, i rispettivi substrati vengono immessi direttamente nell'ETS. Tuttavia, l'accoppiamento tra la sintesi di ETS e ATP viene perso poiché l'integrità della membrana è compromessa da danni da congelamento (formazione di cristalli di ghiaccio).
Gli esperimenti di respirazione si svolgono normalmente a una temperatura fisiologica di 37 °C per gli endotermi in cellule o tessuti non permeabilizzati o permeabilizzati. Mentre il primo considera il contesto metabolico citosolico, il secondo fornisce il contributo energetico dei singoli complessi OXPHOS e dell'ATPasi attraverso l'aggiunta di specifici substrati (e inibitori). La sequenza e la variazione di substrati e inibitori hanno portato allo sviluppo di una vasta gamma di protocolli SUIT17 e saggi18 per affrontare varie questioni scientifiche sulla funzione di OXPHOS (esaminate al punto12). Il protocollo di base della respirazione cellulare valuta quattro diversi stati: i) respirazione di routine - la respirazione in un rispettivo mezzo respiratorio senza alcuna aggiunta di substrati o inibitori che consumano substrati ma endogeni. Questo stato può rivelare OXPHOS generale o difetti respiratori indotti secondariamente causati, ad esempio, da profili metabolici alterati. Successivamente, l'aggiunta dell'oligomicina inibitore dell'ATPasi rivela la permeabilità della membrana mitocondriale interna ai protoni, definita come ii) perdita respiratoria. La successiva titolazione di un protonoforo come il cianuro di carbonile uncoupler p-trifluoro-metossifenil-idrazzone (FCCP) consente di determinare lo stato in cui la capacità ETS è massima in un circuito protonico aperto-transmembrana, definito come iii) respirazione disaccoppiata. È importante sottolineare che uno stato disaccoppiato può verificarsi anche da interventi sperimentali attraverso un eccessivo danno meccanico alle membrane mitocondriali. Al contrario, lo stato non accoppiato si riferisce al disaccoppiamento respiratorio da parte di un meccanismo intrinseco fisiologicamente controllato. Infine, la completa inibizione dell'ETS mediante aggiunta dell'antimicina inibitore del complesso III e dell'inibitore del complesso I rotenone determina il consumo residuo di ossigeno (ROX) da processi non mitocondriali che consumano ossigeno (Figura 1A-C).
La bioenergetica mitocondriale è costituita da cinque distinti stati respiratori19,20. La respirazione dello stato 1 è senza substrati aggiuntivi o ADP, ad eccezione di ciò che è disponibile endogenamente. Dopo l'aggiunta di ADP, ma ancora, nessun substrato, si ottiene la respirazione dello stato 2. Quando vengono aggiunti substrati, consentendo il trasferimento di elettroni e la sintesi di ATP, viene raggiunta la respirazione dello stato 3. In questo stato, la capacità di OXPHOS può essere definita a concentrazioni saturanti di ADP, fosfato inorganico, ossigeno, NADH- e substrati legati al succinato. La respirazione allo stato 4 o la respirazione LEAK può essere definita come uno stato senza ADP o ATP sintasi chimicamente inibite pur avendo substrati sufficienti. Infine, quando tutto l'ossigeno è esaurito (anossico) in un ambiente a camera chiusa, si osserva la respirazione allo stato 5.
Esistono diversi metodi per valutare gli stati energetici cellulari14 con due dispositivi che dominano l'attuale valutazione in tempo reale di OXPHOS attraverso l'analisi del consumo di ossigeno, misurato come funzione della diminuzione dell'ossigeno nel tempo in un sistema a camera chiusa con diversa applicabilità a seconda del modello sperimentale e della domanda di ricerca: il respirometro ad alta risoluzione Oroboros 2k e l'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse XF. Entrambi i dispositivi registrano i tassi di consumo di ossigeno come una diminuzione dei picomoli (pmol) di ossigeno (O2) al secondo come valore assoluto all'interno della camera o del pozzo della micropiastra. Il consumo specifico di ossigeno per massa si ottiene normalizzando il rispettivo consumo di ossigeno in una specifica ricetta tampone per numero di cellule (milioni), peso dei tessuti (mg) o quantità di proteine.
L'O2k (Oroboros Instruments) è un sistema chiuso a due camere dotato di un sensore polarografico di ossigeno (abbreviato in respirometro ad alta risoluzione basato su camera: cHRR). Ogni camera sperimentale contiene 2 ml di liquido che viene mantenuto omogeneo da agitatori magnetici. Il sensore polarografico di ossigeno utilizza un approccio amperometrico per misurare l'ossigeno: contiene un catodo d'oro, un anodo di cloruro d'argento / argento e tra una soluzione KCI che crea una cella elettrochimica su cui viene applicata una tensione (0,8 V). L'ossigeno proveniente dal mezzo di analisi si diffonde attraverso una membrana fluorurata di etilene propilene da 25 μm (permeabile A2) e subisce una riduzione al catodo, producendo perossido di idrogeno. All'anodo, l'argento viene ossidato dal perossido di idrogeno, generando una corrente elettrica. Questa corrente elettrica (ampere) è linearmente correlata alla pressione parziale dell'ossigeno. La pressione parziale dell'ossigeno e il fattore di solubilità dell'ossigeno del mezzo di saggio vengono utilizzati per calcolare la concentrazione di ossigeno. Poiché la pressione parziale dell'ossigeno dipende dalla temperatura sperimentale e le misurazioni polarografiche sono sensibili alla temperatura, le fluttuazioni di temperatura richiedono una regolazione precisa (±0,002 °C) da parte di un blocco riscaldante Peltier. La temperatura può essere controllata in un intervallo di 4 °C e 47 °C.
L'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse XF (Agilent) è un sistema basato su piastre con formato micropiastra a 24 o 96 pozzetti in cui tre elettrodi di fluorescenza misurano il consumo di ossigeno nel tempo in ciascun pozzo (abbreviato in respirometro ad alta risoluzione basato su micropiastre: mHRR). Un massimo di quattro porte nella cartuccia del test sono disponibili per l'iniezione automatica durante il test. Un test contiene più cicli, ciascuno con tre fasi: 1) miscelazione, 2) attesa e 3) misurazione. Durante la fase di misurazione, le sonde del sensore vengono abbassate nella micropiastra creando una camera temporaneamente chiusa contenente un volume di 7-10 μL per misurare la luce emessa. Questa luce viene emessa da fluorofori incorporati in polimeri sulla punta delle sonde del sensore, che rilevano O2 in base alla tempra a fosforescenza. L'intensità del segnale di fluorescenza è proporzionale a O2 e influenzata dalla temperatura del sensore e del mezzo di saggio. Pertanto, una stima accurata dell'ossigeno richiede un approccio relativo con un pozzo di fondo senza alcun campione. Il ripristino della concentrazione di ossigeno avviene durante la fase di miscelazione quando il sensore si muove su e giù per mescolare il volume sopra la camera temporanea. Ogni ciclo calcola un tasso di consumo di ossigeno. La temperatura può essere controllata in un intervallo di 16 °C e 42 °C.
HRR è il gold standard per valutare la bioenergetica cellulare nelle malattie primarie e associate ai mitocondri e nel metabolismo cellulare generale. In questo studio, vengono forniti protocolli di base per HRR per valutare la funzione di OXPHOS nelle cellule e nei tessuti.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig2v2.jpg"> Figura 2: Flusso di lavoro per i preparati cellulari e tissutali per la cHRR e preparazione cellulare per la respirometria mHRR. (A) Schema dei protocolli forniti. (B) Cellule di mammifero (fase 1.2): hek293 pellet pari a 3 x 106 celle (pannello di sinistra). Tessuto non fibroso (fase 1.3): Preparazione del lisato di cervelletto murino in vasaio di teflon da 2 ml (pannello centrale). Permeabilizzazione del muscolo scheletrico indotta da saponina (pannello destro passo 1.4) per la respirometria cHRR. (C) Layout standard di semina delle micropiastre (fase 2.4) e controllo della confluenza per l'analisi delle cellule eucariotiche (HEK293) per la respirometria mHRR. (D, E) Schema di carico della porta di iniezione per la respirometria mHRR (fase 2.4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>07-358029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2 medical gas mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Potter for tissue grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PHR1279-1G</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty accid free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 4830</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 7752</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5628</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 0632</td>
			<td>Chemical, dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (High glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium&#160;(No Glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E 4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax&#160;(100x)&#160;(200 nM&#160;L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267151B</td>
			<td>Instrument for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>56750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 1000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 2383</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 7936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate&#160;(100 mM)&#160;(100x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA&#160;(Non-essential amino acids) 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal FBS&#160;(10x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Titration Set</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes for chemical injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O 4876</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 4509</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 2256</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA-Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td>High-throughput respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>72-57-1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two thin-edged forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine stock (500x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers

La respirometria ad alta risoluzione (HRR) consente di monitorare la fosforilazione ossidativa in tempo reale per l'analisi dei singoli stati energetici cellulari e la valutazione dei complessi respiratori utilizzando protocolli diversificati di titolazione substrato-disaccoppiatore-inibitore (SUIT). Qui viene dimostrato l'uso di due dispositivi di respirometria ad alta risoluzione e viene presentata una raccolta di base di protocolli applicabili per l'analisi di cellule in coltura, fibre muscolari scheletriche e cardiache e tessuti molli come il cervello e il fegato. I protocolli per cellule e tessuti in coltura sono forniti per un respirometro a camera e cellule coltivate per un respirometro basato su micropiastre, entrambi comprendenti protocolli di respirazione standard. A scopo comparativo, le cellule HEK293 ingegnerizzate con CRISPR carenti di traduzione mitocondriale che causano una carenza multipla del sistema respiratorio vengono utilizzate con entrambi i dispositivi per dimostrare difetti cellulari nella respirazione. Entrambi i respirometri consentono una misurazione completa della respirazione cellulare con i rispettivi meriti tecnici e l'idoneità a seconda della domanda di ricerca e del modello in studio.

Qui, forniamo protocolli per determinare la bioenergetica mitocondriale nelle cellule eucariotiche, nel tessuto non fibroso (ad esempio, cervelletto) e nel tessuto fibroso (ad esempio, muscolo scheletrico). Per le cellule eucariotiche, HEK293 con knockout ingegnerizzato CRISPR di due diverse proteine associate alla traduzione mitocondriale con conseguente deficit multiplo (CRISPRKO1) e grave/completo di OXPHOS (CRISPRKO2) è stato misurato con cHRR (Figura 3A-C<...

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High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

La valutazione della fosforilazione ossidativa mediante respirometri ad alta risoluzione è diventata parte integrante dell'analisi funzionale dei mitocondri e del metabolismo energetico cellulare. Qui, presentiamo protocolli per l'analisi del metabolismo energetico cellulare utilizzando respirometri ad alta risoluzione basati su camera e micropiastre e discutiamo i principali vantaggi di ciascun dispositivo.

Respirometria ad alta risoluzione per valutare la bioenergetica nelle cellule e nei tessuti utilizzando respirometri a camera e a piastre

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and ...

I mitocondri forniscono energia cellulare attraverso la fosforilazione ossidativa contribuendo a quasi tutti i processi all'interno della cellula. Di conseguenza, le disfunzioni mitocondriali sono associate a un ampio spettro di malattie. Il vantaggio principale di questa tecnica è la misurazione in tempo reale della bioenergetica mitocondriale mediante il consumo di ossigeno e, quindi, una valutazione accurata del metabolismo energetico cellulare totale.La respirometria ad alta risoluzione consente una valutazione diretta di ciò che nel sistema di fosforilazione ossidativa sta fallendo, fornendo potenzialmente indizi diagnostici nelle malattie mitocondriali primarie e nelle disfunzioni mitocondriali secondarie associate a molti disturbi. A dimostrare la procedura sarà Ryan Awadhpersad, dottorando nel mio laboratorio. Per iniziare, eseguire la calibrazione dell'ossigeno eseguendo i respirometri in 2,1 millilitri di mezzo respiratorio mitocondriale a 37 gradi Celsius per più di 45 minuti e procedere se la variazione basale è entro quattro picomoli al secondo.Coltiva cellule HEK293 in DMEM ad alto contenuto di glucosio integrate con FBS, GlutaMAX, aminoacidi non essenziali, piruvato di sodio e uridina al 10% attivati termicamente in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica. Il giorno dell'esperimento, raccogliere e contare le cellule e risospescere 2,5 milioni di cellule in 2,5 millilitri di mezzo respiratorio. Per valutare la respirazione di routine, aggiungere 2,3 millilitri di sospensione di cellule medie di respirazione calda alla camera.Eseguire le camere a 37 gradi Celsius e una velocità di agitazione di 700 RPM. Attendere almeno tre minuti per consentire ai fluidi di degassare, quindi chiudere le camere ruotando il tappo con un movimento rotante. Quindi, aspirare il liquido in eccesso sulla parte superiore del tappo.Dopo 10 minuti, ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile per registrare la respirazione di routine o di stato I. Per eseguire l'analisi OXPHOS in cellule intatte, aggiungere due microlitri di oligomicina 0,01 millimolare per una concentrazione finale di 10-nanomolari. Titolare FCCP da stock di due millimolari aggiungendo 0,6 microlitri a passi di 0,2 microlitri fino a quando non si osserva alcun aumento della respirazione e la respirazione è disaccoppiata al massimo.Quindi, aggiungere un microlitro di rotenone monomillolare per una concentrazione finale di 0,5 micromolari. Quindi, aggiungere due microlitri di un milligrammo per millilitro di antimicina per una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Riossigenare la camera allo stesso livello di ossigeno, circa 150 micromolari, sollevando lo stantuffo.Successivamente, aggiungere cinque microlitri di ascorbato 0,8-molare per una concentrazione finale di due millimolari. Quindi, aggiungere immediatamente cinque microlitri di TMPD 0,2 molare per una concentrazione finale di 0,5 millimolari e valutare l'attività IV complessa. Quando il picco del flusso di ossigeno viene raggiunto con TMPD, aggiungere cinque microlitri o azide quadrimolare per una concentrazione finale di 10 millimolari.Quindi, continuare la corsa per almeno cinque minuti per analizzare l'auto-ossidazione di TMPD per il calcolo del livello di base IV complesso. Dopo la corsa, raccogliere un millilitro di sospensione del campione da ciascuna camera e centrifugare a 1.000 G per le cellule permeabilizzate o a 20.000 G per il lisato tissutale. Quindi, scartare il surnatante e congelare il pellet a meno 80 gradi Celsius per ulteriori analisi a valle.In primo luogo, seminare le cellule in base ai tassi di crescita delle singole linee cellulari. Diluire oligomicina, FCCP, rotenone e antimicina in tre microlitri di mezzo di saggio a una concentrazione finale di 1,5 micromolare, 1,125 micromolare e un micromolare, rispettivamente. Successivamente, riempili in porte separate.Osservare le porte di iniezione per garantire un caricamento uniforme dei campioni. Accendere il sistema basato su micropiastra e il computer ed equilibrarli a 37 gradi Celsius per almeno tre ore. Il giorno del test basato su micropiastre, verificare la confluenza della piastra di coltura cellulare, la morfologia delle cellule e assicurarsi che i pozzetti di fondo siano vuoti.Quindi, rimuovere tutto tranne 20 microlitri del terreno di coltura da ciascun pozzo. Quindi, lavare ogni pozzetto con 90 microlitri di mezzo di saggio e aggiungere 100 microlitri di mezzo di saggio per ottenere un volume finale fino a 120 microlitri. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un'incubatrice senza anidride carbonica per 60 minuti.Dopo aver recuperato la piastra dall'incubatrice, rimuovere il coperchio e posizionare la micropiastra nella fessura. Fare clic su Continua per avviare la corsa. Al termine della corsa, estrarre la piastra e rimuovere il mezzo di analisi rimanente senza disturbare le cellule.Quindi, congelare l'intera piastra a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver eseguito gli esperimenti di permeabilizzazione e respirazione della digitonina, sono state registrate tracce di consumo di ossigeno grezzo di cellule HEK293 wild-type e cellule HEK293 con un knockout genico mediato da CRISPR con conseguente carenza multipla di OXPHOS. Sono state ottenute tracce di consumo di ossigeno normalizzate dall'input di cellule sovrapposte.CRISPR knockout 1 mostra una respirazione compromessa e CRISPR knockout 2 non mostra respirazione rispetto al wild-type quando normalizzato al numero di cellule. Le quantità proteiche sono state quantificate e i valori respiratori sono stati normalizzati alla quantità proteica al fine di determinare i valori assoluti degli stati respiratori e i rispettivi rapporti di controllo del flusso. I tassi di acidificazione extracellulare sono stati trovati per aumentare per il deficit di OXPHOS in CRISPR knockout 2, suggerendo la compensazione del deficit di fosforilazione ossidativa mitocondriale nelle cellule HEK293 attraverso l'aumento della glicolisi.Inoltre, i valori respiratori sono stati determinati in presenza di oligomicina, FCCP e rotenone e i valori ottenuti sono stati normalizzati alla quantità proteica. Sono state studiate tracce di consumo di ossigeno normalizzate da proteine di cellule HEK293 wild-type e cellule HEK293 con deficit di traduzione mitocondriale mediata da CRISPR che causano una carenza multipla di OXPHOS. Sono state ottenute tracce di consumo di ossigeno normalizzate dal tessuto umido del cervelletto di topo e del muscolo soleo del topo.I muscoli del soleo mostrano una capacità di respirazione e OXPHOS tre volte superiore rispetto al cervelletto. Con la respirometria a camera, è importante lavorare velocemente, poiché la funzione mitocondriale diminuirà nel momento in cui raccogli i tuoi campioni e con la respirometria basata su piastra, è fondamentale acquisire una densità di semina ottimale per ridurre al minimo la variabilità. Per ulteriori analisi, è possibile quantificare le proteine o immuno-blotting.Ciò potrebbe determinare se un'alterazione della funzione respiratoria mitocondriale fosse dovuta all'abbondanza di complessi OXPHOS o alla quantità mitocondriale. Già un secolo fa, le cellule tumorali sono state trovate per eseguire la glicolisi anaerobica oltre all'OXPHOS mitocondriale. Ciò sottolinea la necessità di analizzare la bioenergetica mitocondriale.Qui abbiamo dimostrato due respirometri considerati il gold standard di oggi.

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