Name: high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av midler fra Finlands akademi (C.B.J), Magnus Ehrnroot Foundation (C.B.J) og et doktorgradsstipend ved Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

All dyreforsøk utføres i samsvar med National Animal Experiment Review Board og Regional State Administrative Agency for Sør-Finland. Mannlige C57BL/6JOlaHsd-mus (4-6 måneder gamle) ble brukt i denne studien. Samtykke til bruk av menneskelige cellelinjer ble innhentet fra den institusjonelle etiske komiteen ved Universitetet i Helsinki.
1. Respirometri med høy oppløsning: Kammerbasert respirometer (cHRR)
MERK: Eksperimentene i denne delen av pro...

Tradisjonelt har mitokondriebioenergetikk blitt studert med Clark-type oksygenelektroder. Mangel på oppløsning og gjennomstrømning berettiget imidlertid for teknologisk utvikling. Til dags dato har O2k (referert til som cHRR) og Seahorse XF96 Flux Analyzer (referert til som mHRR) blitt mye vedtatt innen cellulær bioenergi. Her presenterer vi en forståelig samling av protokoller for analyse av cellulær energimetabolisme via vurdering av mitokondrie respirasjon ved hjelp av enten cHRR eller mHRR, diskutere viktige fo...

Mitokondrier oppfyller den viktigste forsyningen av energi og er en inndelt organelle som bidrar til essensielle cellulære bioenergetiske og metabolske prosesser som anabolisme av nukleotider, lipider og aminosyrer, jern-svovelklyngebiogenese og er involvert i signalering som kontrollert celledød 1,2,3 . Mitokondriebioenergetikk gjennom oksidativ fosforylering bidrar til nesten alle cellulære prosesser i cellen, og følgelig er mitokondrie dysfunksjoner av primær eller sekundær opprinnelse forbundet med et bredt spekter av sykdomstilstander 4,5. Mitokondrie dysfunksjon innebærer ikke bare endringer i struktur eller mitokondrietetthet, men også i kvaliteten og reguleringen av luftveiene6. Dette kvalitative elementet omfatter substratkontroll, koblingsegenskaper, post-translasjonelle modifikasjoner, cristae-dynamikk og respiratoriske superkompatibiliteter 7,8. Derfor er nøyaktig analyse av mitokondriebioenergetikk for eksperimentelle og diagnostiske tilnærminger for å vurdere cellens energimetabolisme viktig i helse og sykdom.
Mitokondrie oksidativ fosforylering (OXPHOS) er en sekvens av reaksjoner i luftveiene eller elektronoverføringssystemet (ETS) for generering av cellulær energi gjennom adenosin tripfosfat (ATP)9. Det multi-enzymatiske trinnet for å utnytte energi fra elektronstrøm gjennom komplekser I og II til kompleks IV genererer en elektrokjemisk protongradient over den indre mitokondriemembranen, som deretter brukes til fosforylering av adenosindifosfat (ADP) til ATP via kompleks V (F1FO ATP-syntase) (figur 1A).
For det første genereres to-elektronbærere under trikarboksylsyklusen (TCA), glykolyse og pyruvatoksidasjon: nikotinamid adenin dinukleotid (NADH) og dihydroflavin adenin dinucleotid (FADH2). NADH oksideres ved kompleks I (NADH dehydrogenase), hvor to elektroner overføres til koenzym Q (quinone reduseres til quinol), mens protoner pumpes inn i intermembrane rommet (IMS). For det andre oksiderer komplekse II (Succinat dehydrogenase) FADH2 og mater elektronene til koenzym Q uten å pumpe protoner. For det tredje, ved kompleks III (Cytochrome c oxidoreductase), overføres elektroner fra koenzym Q til cytokrom c mens protoner pumpes inn i IMS. For det fjerde overfører cytokrom c elektronene til kompleks IV (Cytochrome c oxidase), det endelige komplekset for å pumpe protoner, og hvor oksygen fungerer som en elektron akseptor for å assimilere protoner, og til slutt danne vann. Det er dette oksygenet som mitokondrier forbruker som kan måles ved en oksygraf. Til slutt brukes protonene generert fra kompleks I, kompleks III og kompleks IV til å rotere kompleks V, og dermed generere ATP9.
Det er viktig at elektronoverføring ikke bare skjer lineært, ellers betegnet som elektrontransportkjeden. I stedet kan elektroner overføres til koenzym Q-bassenget gjennom flere luftveier og lette konvergent elektronstrøm. NADH-substrater og succinate, for eksempel, kan gå inn via henholdsvis kompleks I og kompleks II. Elektroner fra fettsyreoksidasjon kan doneres via elektronen som overfører flavoproteinkomplekset. Faktisk krever en omfattende analyse av OXPHOS en helhetlig tilnærming med passende drivstoffsubstrater (figur 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig1v2.jpg"> Figur 1: Mitokondrie oksidativ fosforylering og spesifikke substrat- og inhibitorprotokoller. (A) Mitokondrion og ordningen med elektronoverføringssystemet (CI-CIV) og mitokondrie F1F0 ATP-syntase (CV). Alle strukturer er fra PDB. Tallene skildrer bare substrater og inhibitorer beskrevet i denne studien). (B) Prøvespor av oksygenfluks i intakte HEK293-celler ved hjelp av standardprotokoll i en mHRR-enhet. (C) Prøve spor av oksygenfluks i intakte HEK293-celler ved hjelp av standardprotokoll i en cHRR-enhet. (D) Prøve spor av oksygenfluks i permeabiliserte humane fibroblaster fra en sunn donor med respektive SUIT-protokoll. Forkortelser: 1 = Rutinemessig åndedrett av intakte celler; 2 = Tilstand 2; 3 = Tilstand 3 (I); 4 = Tilstand 3(I) med cytC; 5 = Tilstand 3 (I+II); 6 = Lekkasje (OM); 7 = ETS-kapasitet; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenone, AM = Antimycin, ATP = Adenosintrifosfat, Az = Azide, OM = Oligomycin, FCCP = Carbonylcyanid p-trifluoro-metoksyfenyl-hydrazon; Asc = Ascorbate, TMPD = N,N,N′,N′-tetrametyl-p-fenylenediamine, Succ = Succinate, M = Malate, P = Pyruvat, ADP = Adenosin difosfat, NAD = Nikotinamid adenineucleotide, IMS = Intermembrane plass, FAD = Flavin adenin dinucleotide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Analyse av mitokondrie OXPHOS-kapasitet ved bruk av HRR har blitt en instrumentell biokjemisk metode for diagnostisk verdi, ikke bare for primære mitokondriefeil10,11, men strekker seg til alle andre verdener av biologi som kreft ogaldring 12. HRR tillater bestemmelse av cellulær respirasjon ved analyse av mitokondrie OXPHOS kapasitet, som direkte reflekterer individuell eller kombinert mitokondrie respiratorisk kompleks mangel, og indirekte er forbundet med cellulær dysfunksjon og endret energi metabolisme9. Metodologisk utføres respirasjonsmålinger ved hjelp av celler, vev eller isolerte mitokondrier 11,13,14, med frossent materiale bare delvis egnet 15,16. Frossent vev er vist å ha en intakt ETS med opprettholdt supercomplex stabilitet15. Således, i motsetning til tradisjonelle TCA-mellomprodukter, blir respektive substrater direkte matet inn i ETS. Imidlertid går koblingen mellom ETS- og ATP-syntesen tapt da membranintegriteten kompromitteres gjennom fryseskader (iskrystalldannelse).
Respirasjonseksperimenter foregår normalt ved en fysiologisk temperatur på 37 °C for endotermer i enten ikke-permeabiliserte eller permeabiliserte celler eller vev. Mens førstnevnte vurderer den cytosoliske metabolske konteksten, gir sistnevnte det energiske bidraget fra individuelle OXPHOS-komplekser og ATPase gjennom tilsetning av spesifikke substrater (og inhibitorer). Sekvensen og variasjonen av substrater og inhibitorer har ført til utvikling av et mangfoldig utvalg av SUIT-protokoller17 og analysene18 for å ta opp ulike vitenskapelige spørsmål om OXPHOS-funksjonen (gjennomgått under12). Den grunnleggende protokollen for cellulær respirasjon vurderer fire forskjellige tilstander: i) rutinemessig åndedrett - åndedrett i et respektive åndedrettsmedier uten tillegg av substrater eller inhibitorer som bruker, men endogene substrater. Denne tilstanden kan avsløre generelle OXPHOS eller sekundærinduserte respirasjonsfeil forårsaket for eksempel av endrede metabolittprofiler. Deretter avslører tilsetningen av ATPase-hemmeren oligomycin permeabiliteten til den indre mitokondriemembranen til protoner, definert som ii) lekkasje respirasjon. Etterfølgende titrering av en protonofor som uncoupler carbonyl cyanide p-trifluoro-methoxyphenyl-hydrazone (FCCP) gjør det mulig å bestemme tilstanden der ETS-kapasiteten er maksimal i en åpen transmembrane protonkretsmodus, definert som iii) usammenhengende respirasjon. Det er viktig at en usammenhengende tilstand også kan oppstå ved eksperimentelle inngrep gjennom overdreven mekanisk skade på mitokondriemembranene. Omvendt refererer den ikke-koblede tilstanden til respiratorisk frakobling av en iboende mekanisme som er fysiologisk kontrollert. Til slutt bestemmer fullstendig hemming av ETS ved tilsetning av den komplekse III-hemmeren antimycin og kompleks I-hemmer rotenon gjenværende oksygenforbruk (ROX) fra ikke-mitokondrie oksygenkrevende prosesser (figur 1A-C).
Mitokondriebioenergetikk består av fem distinkte respirasjonstilstander19,20. Tilstand 1-åndedrett er uten ekstra substrater eller ADP, bortsett fra det som er endogenet tilgjengelig. Etter tillegg av ADP, men fortsatt ingen substrater, oppnås tilstand 2-åndedrett. Når substrater tilsettes, slik at elektronoverføring og ATP-syntese, oppnås tilstand 3-åndedrett. I denne tilstanden kan OXPHOS-kapasitet defineres ved metning av konsentrasjoner av ADP, uorganisk fosfat, oksygen, NADH- og succinate-tilknyttede substrater. Tilstand 4-åndedrett eller LEKKASJE-åndedrett kan defineres som en tilstand uten ADP eller kjemisk hemmet ATP-synthaser mens de har tilstrekkelige substrater. Til slutt, når alt oksygen er utarmet (anoksisk) i en lukket kammerinnstilling, observeres tilstand 5 respirasjon.
Det finnes flere metoder for å vurdere cellulære energitilstander14 med to enheter som dominerer den nåværende sanntidsvurderingen av OXPHOS gjennom analyse av oksygenforbruk, målt som funksjonen til reduksjonen i oksygen over tid i et lukket kammersystem med forskjellig anvendbarhet avhengig av eksperimentell modell og forskningsspørsmål: Oroboros 2k høyoppløselig respirometer og Seahorse XF ekstracellulær fluxanalysator. Begge enhetene registrerer oksygenforbruket som en reduksjon i picomoles (pmol) oksygen (O2) per sekund som en absolutt verdi i kammeret eller mikroplaten godt. Det spesifikke oksygenforbruket per masse oppnås ved å normalisere det respektive oksygenforbruket i en bestemt bufferoppskrift per antall celler (millioner), vevsvekt (mg) eller proteinmengde.
O2k (Oroboros Instruments) er et lukket tokammersystem utstyrt med en polarografisk oksygensensor (forkortet som kammerbasert høyoppløselig respirometer: cHRR). Hvert eksperimentelt kammer rommer 2 ml væske som holdes homogent av magnetiske omrørere. Den polarografiske oksygensensoren benytter en amperometrisk tilnærming for å måle oksygenet: den inneholder en gullkatod, en sølv / sølvkloridanode, og mellom en KCI-løsning som skaper en elektrokjemisk celle som en spenning (0,8 V) påføres. Oksygen fra analysemediet sprer seg gjennom en 25 μm fluorinert etylenpropylenmembran (O2-gjennomtrengelig) og gjennomgår reduksjon ved katoden, og produserer hydrogenperoksid. Ved anoden oksideres sølv av hydrogenperoksid, og genererer en elektrisk strøm. Denne elektriske strømmen (ampere) er lineært relatert til det delvise oksygentrykket. Det delvise trykket av oksygen og oksygenløselighetsfaktoren til analysemediet brukes til å beregne oksygenkonsentrasjonen. Siden oksygendelt trykk er avhengig av eksperimentell temperatur og polarografiske målinger er temperaturfølsomme, trenger temperatursvingninger presis (±0,002 °C) regulering av en Peltier varmeblokk. Temperaturen kan kontrolleres innenfor et område på 4 °C og 47 °C.
Seahorse XF ekstracellulær fluksanalysator (Agilent) er et platebasert system med 24- eller 96-brønns mikroplateformat der tre fluorescenselektroder måler oksygenforbruket over tid i hver brønn (forkortet som mikroplatebasert høyoppløselig respirometer: mHRR). Maksimalt fire porter i analysepatronen er tilgjengelige for automatisert injeksjon under analysen. En analyse inneholder flere sykluser, hver med tre faser: 1) blanding, 2) venting og 3) måling. Under målefasen senkes sensorsondene ned i mikroplaten og skaper et midlertidig lukket kammer som inneholder 7-10 μL volum for å måle avgitt lys. Dette lyset avgis av polymer-innebygde fluoroforer på spissen av sensorsondene, som sanser O2 basert på fosforescensslukking. Intensiteten til fluorescenssignalet er proporsjonal med O2 og påvirkes av temperaturen på sensoren og analysemediet. Derfor krever nøyaktig oksygenestimering en relativ tilnærming med en bakgrunn godt uten prøve. Gjenoppretting av oksygenkonsentrasjon oppstår under blandefasen når sensoren beveger seg opp og ned for å blande volumet over det midlertidige kammeret. Hver syklus beregner en oksygenforbrukshastighet. Temperaturen kan kontrolleres innenfor et område på 16 °C og 42 °C.
HRR er gullstandarden for å vurdere cellulær bioenergi i primære og mitokondrier-assosierte sykdommer og generell cellulær metabolisme. I denne studien gis grunnleggende protokoller for HRR for å vurdere OXPHOS-funksjonen i celler og vev.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig2v2.jpg"> Figur 2: Arbeidsflyt for celle- og vevspreparater for cHRR, og celleforberedelse for mHRR-respirometri. (A) Omriss av angitte protokoller. (B) Pattedyrceller (trinn 1.2): HEK293 pellet tilsvarende 3 x 106 celler (venstre panel). Ikke-fibrøst vev (trinn 1.3): Fremstilling av murine cerebellum lysate i 2 ml Teflon potter (midtpanel). Saponinindusert skjelettmuskelpermeabilisering (trinn 1.4) høyre panel) for cHRR-respirometri. (C) Standard mikroplatesåingsoppsett (trinn 2.4) og samtidighetskontroll for analyse av eukaryote celler (HEK293) for mHRR-respirometri. (D, E) Skjema for injeksjonsportbelastning for mHRR-respirometri (trinn 2.4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>07-358029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2 medical gas mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Potter for tissue grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PHR1279-1G</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty accid free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 4830</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 7752</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5628</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 0632</td>
			<td>Chemical, dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (High glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium&#160;(No Glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E 4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax&#160;(100x)&#160;(200 nM&#160;L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267151B</td>
			<td>Instrument for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>56750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 1000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 2383</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 7936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate&#160;(100 mM)&#160;(100x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA&#160;(Non-essential amino acids) 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal FBS&#160;(10x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Titration Set</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes for chemical injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O 4876</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 4509</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 2256</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA-Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td>High-throughput respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>72-57-1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two thin-edged forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine stock (500x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers

Høyoppløselig respirometri (HRR) gjør det mulig å overvåke oksidativ fosforylering i sanntid for analyse av individuelle cellulære energitilstander og vurdering av respiratoriske komplekser ved hjelp av diversifiserte substrat-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protokoller. Her demonstreres bruken av to høyoppløselige respirometrienheter, og en grunnleggende samling av protokoller som gjelder for analyse av dyrkede celler, skjelett- og hjertemuskelfibre og bløtvev som hjernen og leveren presenteres. Protokoller for dyrkede celler og vev er gitt for et kammerbasert respirometer og dyrkede celler for et mikroplatebasert respirometer, som begge omfatter standard åndedrettsprotokoller. For komparative formål brukes CRISPR-konstruerte HEK293-celler som mangler mitokondrieoversettelse, noe som forårsaker flere luftveissystemmangel med begge enhetene for å demonstrere cellulære defekter i åndedrett. Begge respirometerne muliggjør omfattende måling av cellulær respirasjon med sine respektive tekniske fordeler og egnethet avhengig av problemstillingen og modellen som studeres.

Her tilbyr vi protokoller for å bestemme mitokondriebioenergetikken i eukaryote celler, ikke-fibrøst vev (f.eks. cerebellum) og fibrøst vev (f.eks. skjelettmuskulatur). For eukaryote celler ble HEK293 med CRISPR-konstruert knockout av to forskjellige proteiner assosiert med mitokondrieoversettelse som resulterte i flere (CRISPRKO1) og alvorlig/fullstendig OXPHOS-mangel (CRISPRKO2) målt med enten cHRR (figur 3A-C) eller mHRR (<strong...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers at JoVE.com

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

Vurdering av oksidativ fosforylering ved hjelp av høyoppløselige respirometere har blitt en integrert del av den funksjonelle analysen av mitokondrier og cellulær energimetabolisme. Her presenterer vi protokoller for analyse av cellulær energimetabolisme ved hjelp av kammer- og mikroplatebaserte høyoppløselige respirometere og diskuterer de viktigste fordelene ved hver enhet.

Høyoppløselig respirometri for å vurdere bioenergi i celler og vev ved hjelp av kammer- og platebaserte respirometere

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and ...

Mitokondrier gir cellulær energi gjennom oksidativ fosforylering som bidrar til nesten alle prosesser i cellen. Følgelig er mitokondrie dysfunksjoner forbundet med et bredt spekter av sykdommer. Den største fordelen med denne teknikken er sanntidsmålingen av mitokondriebioenergetikk ved oksygenforbruk, og dermed en nøyaktig vurdering av total cellulær energimetabolisme.Høyoppløselig respirometri tillater direkte vurdering av hva i oksidativt fosforyleringssystem svikter, og potensielt gir diagnostiske ledetråder i primære mitokondriesykdommer og sekundære mitokondrie dysfunksjoner forbundet med mange lidelser. Å demonstrere prosedyren vil være Ryan Awadhpersad, ph.d.-student i laboratoriet mitt. Til å begynne med, utfør oksygenkalibreringen ved å kjøre respirometerne i 2,1 milliliter mitokondrie respirasjonsmedium ved 37 grader Celsius i mer enn 45 minutter og fortsett hvis baseline variasjon er innenfor fire picomoles per sekund.Kultur HEK293 celler i høyglukose DMEM supplert med 10% varmeaktivert FBS, GlutaMAX, ikke-essensielle aminosyrer, natriumpyuvat og uridin i en inkubator ved 37 grader Celsius ved 5% karbondioksid. På eksperimentets dag samler og teller cellene og resuspenderer 2,5 millioner celler i 2,5 milliliters respirasjonsmedium. For å vurdere rutinemessig åndedrett, tilsett 2,3 milliliter varm respirasjon middels celle suspensjon til kammeret.Kjør kamrene på 37 grader Celsius og en omrøringshastighet på 700 RPM. Vent i minst tre minutter for å la media avgasse, og lukk deretter kamrene ved å vri stopperen i en roterende bevegelse. Deretter aspirerer du overflødig væske på toppen av stopperen.Etter 10 minutter, få et stabilt oksygenflukssignal for å registrere rutine eller tilstand jeg åndedrett. For å utføre OXPHOS-analyse i intakte celler, tilsett to mikroliter 0,01 millimolar oligomycin for en endelig konsentrasjon på 10 nanomolar. Titrate FCCP fra to millimolar lager ved å legge til 0,6 mikroliter ved 0,2-mikroliter trinn til ingen økning i respirasjon observeres og respirasjon er maksimalt uncoupled.Deretter legger du til en mikroliter av en millimolar rotenon for en endelig konsentrasjon på 0,5 mikromolar. Deretter legger du til to mikroliter med ett milligram per milliliter antimycin lager for en endelig konsentrasjon på ett mikrogram per milliliter. Reoksygenat kammeret til samme oksygennivå, ca. 150 mikromolar, ved å løfte stempelet.Etterpå legger du til fem mikroliter 0,8-molar ascorbate for en endelig konsentrasjon på to millimolar. Deretter legger du umiddelbart til fem mikroliter 0,2-molar TMPD for en endelig konsentrasjon på 0,5 millimolar og evaluerer kompleks IV-aktivitet. Som toppen oksygen flux nås med TMPD, legge fem mikroliter eller fire-molar azide for en endelig konsentrasjon på 10 millimolar.Fortsett deretter kjøringen i minst fem minutter for å analyse automatisk oksidasjon av TMPD for kompleks IV-beregning på basisnivå. Etter løpet, samle en milliliter prøve suspensjon fra hvert kammer og sentrifuge ved 1000 G for permeabiliserte celler eller ved 20.000 G for vev lysat. Kast deretter supernatanten og frys pellet på minus 80 grader Celsius for videre nedstrømsanalyse.Først frø cellene i henhold til vekstraten for individuelle cellelinjer. Fortynn oligomycin, FCCP, rotenon og antimycin i tre mikroliter analysemedium til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 1,5 mikromolar, 1,125 mikromolar og en mikromolar. Fyll dem deretter i separate porter.Vær oppmerksom på injeksjonsportene for å sikre jevn lasting av prøvene. Slå på det mikroplatebaserte systemet og datamaskinen og likevekt dem ved 37 grader Celsius i minst tre timer. På dagen for den mikroplatebaserte analysen, kontroller samtidigheten av cellekulturplaten, cellemorfologien og sørg for at bakgrunnsbrønnene er tomme.Fjern deretter alt unntatt 20 mikroliter av kulturmediet fra hver brønn. Vask deretter hver brønn med 90 mikroliter analysemedium og tilsett 100 mikroliter analysemedium for å lage et sluttvolum på opptil 120 mikroliter. Deretter inkuberer du platen ved 37 grader Celsius i en inkubator uten karbondioksid i 60 minutter.Etter å ha hentet platen fra inkubatoren, fjern lokket og legg mikroplaten i sporet. Klikk fortsett for å starte kjøringen. Etter at kjøringen er ferdig, ta platen ut og fjern de resterende analysemediene uten å forstyrre cellene.Frys deretter hele platen ved minus 80 grader Celsius. Etter å ha utført digitaliserings- og respirasjonsforsøkene, ble det registrert rå oksygenforbruksspor av ville HEK293-celler og HEK293-celler med CRISPR-mediert genutslag, noe som resulterte i flere OXPHOS-mangler. Overlagte celleinngangs-normaliserte oksygenforbruksspor ble oppnådd.CRISPR knockout 1 viser nedsatt åndedrett og CRISPR knockout 2 viser ingen åndedrett sammenlignet med wild-type når normalisert til cellenummer. Proteinmengder ble kvantifisert og respirasjonsverdier ble normalisert til proteinmengde for å bestemme absolutte verdier av respiratoriske tilstander og respektive flukskontrollforhold. Ekstracellulære forsuringsrater ble funnet å øke for OXPHOS-mangel i CRISPR knockout 2, noe som tyder på kompensasjon av mitokondrie oksidativ fosforyleringsmangel i HEK293-celler gjennom økt glykolyse.I tillegg ble respirasjonsverdiene bestemt i nærvær av oligomycin, FCCP og rotenon, og de oppnådde verdiene ble normalisert til proteinmengden. Protein-normalisert oksygenforbruk spor av villtype HEK293 celler og HEK293 celler med CRISPR-mediert mitokondrie oversettelse mangel forårsaker flere OXPHOS mangel ble studert. Våtvekt vev-normalisert oksygenforbruk spor av mus cerebellum og mus soleus muskel ble oppnådd.Soleusmuskulaturen viser tre ganger høyere OXPHOS og åndedrettskapasitet enn cerebellum. Med kammerbasert respirometri er det viktig å jobbe raskt, da mitokondriefunksjonen vil avta i det øyeblikket du samler prøvene dine, og med platebasert respirometri er det avgjørende å skaffe seg en optimal såingstetthet for å minimere variasjon. For videre analyse er protein kvantifisering eller immuno-blotting mulig.Dette kan avgjøre om en endring i mitokondrie respiratorisk funksjon skyldtes overflod av OXPHOS-komplekser eller mitokondriemengde. Allerede for et århundre siden ble kreftceller funnet å utføre anaerob glykolyse i tillegg til mitokondrie OXPHOS. Dette understreker behovet for å analyse mitokondrie bioenergi.Her demonstrerte vi to respirometere som vurderte dagens gullstandard.

Research

JoVE Journal

Biology

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Ved hjelp av høyoppløselig CT for å visualisere tredimensjonale struktur og funksjon Plant vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rask og effektiv Sebrafisk Genotyping Bruke PCR med høy oppløsning Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Måling av Metabolic Rate i<em&gt; Drosophila</em&gt; Hjelp respirometri

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Stanse av<em&gt; BRCA2</em&gt; For å identifisere Novel BRCA2-regulert biologiske funksjoner i dyrkede humane celler

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Kvantifisering av krystallinsk cellulose akkumulering i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots å overvåke Tissue-spesifikke Cell Wall Modifikasjoner

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Høy oppløsning respirometri å vurdere mitokondrienes funksjon i permeabilized og intakte celler

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering av Intakt Mitokondrier fra Skeletal Muscle av differensialsentrifugering for høy oppløsning respirometri Målinger

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Høy oppløsning Respirometry å måle mitokondrie funksjon av intakt Beta-cellene i nærvær av naturlige forbindelser

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...