Name: high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por financiamento da Academia da Finlândia (C.B.J), da Fundação Magnus Ehrnroot (C.B.J), e de uma bolsa de doutorado da Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

Toda a experimentação animal é realizada de acordo com o National Animal Experiment Review Board e a Agência Regional De Administração Estadual para o Sul da Finlândia. Foram utilizados neste estudo camundongos C57BL/6JOlaHsd masculinos (4-6 meses de idade). O consentimento para o uso de linhas celulares humanas foi obtido do comitê de ética institucional da Universidade de Helsinque.
1. Respirometria de alta resolução: respirômetro baseado em câmara (cHRR)
<p c...

Tradicionalmente, bioenergetics mitocondriais tem sido estudado com eletrodos de oxigênio do tipo Clark. A falta de resolução e throughput, no entanto, justificava o avanço tecnológico. Até o momento, o O2k (conhecido como cHRR) e o Seahorse XF96 Flux Analyzer (conhecido como mHRR) foram amplamente adotados no campo dos bioenergésicos celulares. Aqui, apresentamos uma coleção compreensível de protocolos para análise do metabolismo de energia celular através da avaliação da respiração mitocondrial usando c...

Mitocôndrias cumprem a oferta-chave de energia e são uma organela compartimentalizada contribuindo para processos bioenergetics celulares essenciais e metabólicos, como anabolismo de nucleotídeos, lipídios e aminoácidos, biogênese do aglomerado de enxofre de ferro e estão implicados em sinalização como morte celular controlada 1,2,3 . A bioenergeticia mitocondrial através da fosforilação oxidativa contribui para quase todos os processos celulares dentro da célula e, consequentemente, disfunções mitocondriais de origem primária ou secundária estão associadas a um amplo espectro de condições da doença 4,5. A disfunção mitocondrial envolve não apenas alterações na estrutura ou densidade mitocondrial, mas também na qualidade e regulação do sistema respiratório6. Este elemento qualitativo abrange controle de substrato, características de acoplamento, modificações pós-translacionais, dinâmica cristae e supercomplexos respiratórios 7,8. Portanto, a análise precisa da bioenergetics mitocondrial para abordagens experimentais e diagnósticas para avaliar o metabolismo energético da célula é importante na saúde e na doença.
Fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) é uma sequência de reações dentro do sistema respiratório ou sistema de transferência de elétrons (ETS) para a geração de energia celular através de triptosfato de adenosina (ATP)9. O passo multienzimático para aproveitar a energia do fluxo de elétrons através dos complexos I e II ao complexo IV gera um gradiente eletroquímico de prótons através da membrana mitocondrial interna, posteriormente utilizado para fosforilação de difosfato de adenosina (ADP) para ATP via complexo V (F1FO ATP synthase) (Figura 1A).
Primeiro, os portadores de dois elétrons são gerados durante o ciclo tricarboxílico (TCA), glicolise e oxidação piruvato: dinucleotídeo de adenina de nicotinamida (NADH) e dinucleotídeo de adenina dihidroflavina (FADH2). O NADH é oxidado no complexo I (NADH desidrogenase), durante o qual dois elétrons são transferidos para a coenzima Q (quinona é reduzida a quinol), enquanto prótons são bombeados para o espaço intermembrano (IMS). Em segundo lugar, o complexo II (Succinato desidrogenase) oxida FADH2 e alimenta os elétrons para coenzima Q sem bombear prótons. Em terceiro lugar, no complexo III (Cytochrome c oxidoreductase), elétrons da coenzima Q são transferidos para citocromo c enquanto prótons são bombeados para o IMS. Em quarto lugar, o citocromo c transfere os elétrons para o complexo IV (Cytochrome c oxidase), o complexo final para bombear prótons, e onde o oxigênio funciona como um aceitador de elétrons para assimilar prótons, formando água. É esse oxigênio que as mitocôndrias consomem que pode ser medido por um oxígrafo. Finalmente, os prótons gerados a partir do complexo I, complexo III e complexo IV são usados para rodar o complexo V, gerando ASSIM ATP9.
É importante ressaltar que a transferência de elétrons ocorre não apenas de forma linear, de outra forma denotada como a cadeia de transporte de elétrons. Em vez disso, os elétrons podem ser transferidos para a piscina coenzima Q através de múltiplas vias respiratórias e facilitar o fluxo de elétrons convergentes. Os substratos e succinatos do NADH, por exemplo, podem entrar por meio do complexo I e do complexo II, respectivamente. Elétrons da oxidação de ácidos graxos podem ser doados através do complexo de flavoproteína de transferência de elétrons. De fato, uma análise abrangente do OXPHOS requer uma abordagem holística com substratos de combustível apropriados (Figura 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig1v2.jpg"> Figura 1: Fosforilação oxidativa mitocondrial e protocolos específicos de substrato e inibidor. (A) Mitoconddrion e esquema do sistema de transferência de elétrons (CI-CIV) e mitocondrial F1F0 ATP synthase (CV). Todas as estruturas são do PDB. As figuras retratam apenas substratos e inibidores descritos neste estudo). (B) Traços de amostra de fluxo de oxigênio em células HEK293 intactas usando protocolo padrão em um dispositivo mHRR. (C) Traços amostrais de fluxo de oxigênio em células HEK293 intactas usando protocolo padrão em um dispositivo cHRR. (D) Traços amostrais de fluxo de oxigênio em fibroblastos humanos permeabilizados de um doador saudável com o respectivo protocolo SUIT. Abreviaturas: 1 = Respiração rotineira de células intactas; 2 = Estado 2; 3 = Estado 3(I); 4 = Estado 3(I) com cítara; 5 = Estado 3 (I+II); 6 = Vazamento(OM); 7 = Capacidade de ETS; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenone, AM = Antimicina, ATP = Adenosina triphosfato, Az = Azide, OM = Oligomicina, FCCP = Cianeto carbonilizado p-trifluoro-metoxifenil-hidratante; Asc = Ascorbate, TMPD = N,N,N′,N'-tetramethyl-p-fenilelenediamina, Succ = Succinato, M = Malato, P = Piruado, ADP = Difosfato de Adenosina, NAD = Nicotinamida adenina dinucleotídeo, IMS = Espaço Intermembrano, FAD = Flavin adenina dinucleotídeo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A análise da capacidade mitocondrial oxphos usando HRR tornou-se um método bioquímico instrumental de valor diagnóstico não apenas para defeitos mitocondriais primários10,11, mas estendendo-se a todos os outros domínios da biologia, como câncer e envelhecimento12. O HRR permite a determinação da respiração celular pela análise da capacidade mitocondrial de OXPHOS, que reflete diretamente deficiência do complexo respiratório mitocondrial individual ou combinado, e indiretamente está associada à disfunção celular e ao metabolismo energético alterado9. Metodologicamente, as medidas respiratórias são realizadas utilizando células, tecidos ou mitocôndrias isoladas 11,13,14, com material congelado apenas parcialmente adequado15,16. O tecido congelado é mostrado ter um ETS intacto com estabilidade de supercomplex mantido15. Assim, ao contrário dos intermediários tradicionais do TCA, os respectivos substratos são diretamente alimentados no ETS. No entanto, o acoplamento entre a síntese de ETS e ATP é perdido à medida que a integridade da membrana é comprometida por danos congelantes (formação de cristais de gelo).
Experimentos de respiração normalmente ocorrem a uma temperatura fisiológica de 37 °C para endotermias em células ou tecidos não permeabilizados ou permeabilizados. Enquanto o primeiro considera o contexto metabólico citosomático, este último fornece a contribuição energética dos complexos oxphos individuais e do ATPase através da adição de substratos específicos (e inibidores). A sequência e variação de substratos e inibidores levaram ao desenvolvimento de uma matriz diversificada de protocolos SUIT17 e ensaios18 para abordar várias questões científicas da função OXPHOS (revisadas abaixo de12). O protocolo básico de respiração celular avalia quatro estados diferentes: i) respiração de rotina - a respiração em uma respectiva mídia respiratória sem qualquer adição de substratos ou inibidores que consumam, mas substratos endógenos. Este estado pode revelar defeitos de respiração geralmente ou induzidos por secundários causados, por exemplo, por perfis metabólitos alterados. Em seguida, a adição do oligomicina inibidora de ATPase revela a permeabilidade da membrana mitocondrial interna aos prótons, definida como ii) respiração de vazamento. A titulação subsequente de um prótonophore como o desacontedor cianeto de cyanide carbonyl p-trifluoro-metoxiphenyl-hydrazone (FCCP) permite determinar o estado em que a capacidade de ETS é máxima em um modo de circuito de próton aberto transmembrano, definido como iii) respiração nãocopada. É importante ressaltar que um estado desacoplado também pode ocorrer por intervenções experimentais através de danos mecânicos excessivos às membranas mitocondriais. Por outro lado, o estado não acoplado refere-se ao desacoplamento respiratório por um mecanismo intrínseco que é fisiologicamente controlado. Finalmente, a inibição completa do ETS por adição do complexo inibidor III antimicina e do inibidor complexo I rotenona determina o consumo residual de oxigênio (ROX) de processos não mitocondriais de consumo de oxigênio (Figura 1A-C).
A bioenergetics mitocondrial consiste em cinco estados de respiração distintos19,20. A respiração do estado 1 é sem substratos adicionais ou ADP, exceto pelo que está disponível de forma endógena. Após a adição de ADP, mas ainda assim, sem substratos, a respiração estadual 2 é alcançada. Quando substratos são adicionados, permitindo transferência de elétrons e síntese ATP, a respiração do estado 3 é atingida. Neste estado, a capacidade oxphos pode ser definida em concentrações saturadas de ADP, fosfato inorgânico, oxigênio, nadh- e substratos ligados ao succinato. A respiração do estado 4 ou a respiração DE VAZAMENTO podem ser definidas como um estado sem ADP ou sintetizadores ATP quimicamente inibidos enquanto têm substratos suficientes. Por fim, quando todo o oxigênio é esgotado (anoxico) em um ambiente de câmara fechada, o estado 5 respiração é observado.
Existem vários métodos para avaliar os estados de energia celular14 com dois dispositivos dominando a avaliação atual em tempo real do OXPHOS através da análise do consumo de oxigênio, medido como função da diminuição do oxigênio ao longo do tempo em um sistema de câmara fechada com diferentes aplicabilidade dependentes do modelo experimental e da questão da pesquisa: o respirômetro oroboros de alta resolução e o analisador de fluxo extracelular Seahorse XF. Ambos os dispositivos registram as taxas de consumo de oxigênio como uma diminuição nos picomoles (pmol) de oxigênio (O2) por segundo como um valor absoluto dentro da câmara ou poço de microplato. O consumo específico de oxigênio por massa é obtido pela normalização do respectivo consumo de oxigênio em uma receita tampão específica por número de células (milhões), peso tecidual (mg) ou quantidade de proteína.
O O2k (Instrumentos Oroboros) é um sistema fechado de duas câmaras equipado com um sensor de oxigênio polarográfico (abreviado como respirômetro de alta resolução baseado em câmara: cHRR). Cada câmara experimental contém 2 mL de líquido que é mantido homogêneo por agitadores magnéticos. O sensor de oxigênio polarográfico utiliza uma abordagem amperométrica para medir o oxigênio: contém um cátodo de ouro, um ânodo de cloreto de prata/prata, e entre uma solução KCI criando uma célula eletroquímica sobre a qual uma tensão (0,8 V) é aplicada. O oxigênio do ensaio difere através de uma membrana fluorina de etileno fluorado de 25 μm (O 2-permeável) e sofre redução no cátodo, produzindo peróxido de hidrogênio. No ânodo, a prata é oxidada por peróxido de hidrogênio, gerando uma corrente elétrica. Esta corrente elétrica (ampere) está linearmente relacionada com a pressão parcial de oxigênio. A pressão parcial do oxigênio e o fator de solubilidade de oxigênio do meio de ensaio são usados para calcular a concentração de oxigênio. Uma vez que a pressão parcial do oxigênio depende da temperatura experimental e as medidas polarográficas são sensíveis à temperatura, as flutuações na temperatura precisam de regulação precisa (±0,002 °C) por um bloco de aquecimento Peltier. A temperatura pode ser controlada dentro de uma faixa de 4 °C e 47 °C.
O analisador de fluxo extracelular Seahorse XF (Agilent) é um sistema baseado em placas com formato de microplaca de 24 ou 96 poços no qual três eletrodos de fluorescência medem o consumo de oxigênio ao longo do tempo em cada poço (abreviado como respirômetro de alta resolução baseado em microplaca: mHRR). Um máximo de quatro portas no cartucho de ensaio estão disponíveis para injeção automatizada durante o ensaio. Um ensaio contém vários ciclos, cada um com três fases: 1) mistura, 2) espera e 3) medição. Durante a fase de medição, as sondas de sensores são reduzidas na microplacão criando uma câmara temporariamente fechada contendo volume de 7-10 μL para medir a luz emitida. Esta luz é emitida por fluoroforos embutidos em polímero na ponta das sondas do sensor, que sentem O2 com base na saciamento da fosforescência. A intensidade do sinal de fluorescência é proporcional a O2 e influenciada pela temperatura do sensor e do meio de ensaio. Portanto, a estimativa precisa de oxigênio requer uma abordagem relativa com um poço de fundo sem qualquer amostra. A restauração da concentração de oxigênio ocorre durante a fase de mistura quando o sensor se move para cima e para baixo para misturar o volume acima da câmara temporária. Cada ciclo calcula uma taxa de consumo de oxigênio. A temperatura pode ser controlada dentro de uma faixa de 16 °C e 42 °C.
O HRR é o padrão-ouro para avaliar bioenergetics celulares em doenças primárias e mitocôndrias associadas e metabolismo celular geral. Neste estudo, protocolos básicos para HRR são fornecidos para avaliar a função OXPHOS em células e tecidos.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig2v2.jpg"> Figura 2: Fluxo de trabalho para preparações celulares e tecidos para rCR, e preparação celular para respirometria mHRR. (A) Esboço dos protocolos fornecidos. (B) Células mamíferas (passo 1.2): pelota HEK293 igual a 3 x 106 células (painel esquerdo). Tecido não fibroso (passo 1.3): Preparação de cerebelo murino em 2 mL Teflon potter (painel médio). Permeabilização do músculo esquelético induzida por sapona (etapa 1.4) painel direito) para respirometria de HRR. (C) Layout de semeamento de microplaca padrão (etapa 2.4) e verificação de confluência para a análise de células eucarióticas (HEK293) para respirometria mHRR. (D, E) Esquema de carregamento da porta de injeção para respirometria mHRR (etapa 2.4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>07-358029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2 medical gas mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Potter for tissue grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PHR1279-1G</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty accid free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 4830</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 7752</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5628</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 0632</td>
			<td>Chemical, dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (High glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium&#160;(No Glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E 4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1905</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax&#160;(100x)&#160;(200 nM&#160;L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267151B</td>
			<td>Instrument for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>56750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 1000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 2383</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 7936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate&#160;(100 mM)&#160;(100x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA&#160;(Non-essential amino acids) 100x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal FBS&#160;(10x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Titration Set</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes for chemical injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O 4876</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 4509</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 2256</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA-Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7.4</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td>High-throughput respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td> 
			Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>72-57-1</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two thin-edged forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine stock (500x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers

A respirometria de alta resolução (HRR) permite monitorar a fosforilação oxidativa em tempo real para análise de estados de energia celular individuais e avaliação de complexos respiratórios usando protocolos diversificados de titulação inibidora de substrato-uncoupler (SUIT). Aqui, demonstra-se o uso de dois dispositivos de respirometria de alta resolução, e uma coleção básica de protocolos aplicáveis para a análise de células cultivadas, fibras musculares esqueléticas e cardíacas, e tecidos moles como o cérebro e o fígado são apresentados. Protocolos para células e tecidos cultivados são fornecidos para um respirômetro baseado em câmara e células cultivadas para um respirômetro à base de microplato, ambos abrangendo protocolos de respiração padrão. Para fins comparativos, as células HEK293 projetadas pelo CRISPR deficientes na tradução mitocondrial que causam deficiência múltipla do sistema respiratório são usadas com ambos os dispositivos para demonstrar defeitos celulares na respiração. Ambos os respirômetros permitem uma medição abrangente da respiração celular com seus respectivos méritos técnicos e adequação dependente da questão da pesquisa e do modelo em estudo.

Aqui, fornecemos protocolos para determinar os bioenergetics mitocondriais em células eucarióticas, tecido não fibroso (por exemplo, cerebelo) e tecido fibroso (por exemplo, músculo esquelético). Para células eucarióticas, hek293 com nocaute projetado por CRISPR de duas proteínas diferentes associadas à tradução mitocondrial resultando em múltiplas (CRISPRKO1) e deficiência oxphos grave/completa (CRISPRKO2) foram medidas com cHRR (Figura 3A-C</stron...

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High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

Avaliar a fosforilação oxidativa usando respirômetros de alta resolução tornou-se parte integrante da análise funcional das mitocôndrias e do metabolismo de energia celular. Aqui, apresentamos protocolos para a análise do metabolismo de energia celular usando respirômetros de alta resolução baseados em câmara e microplatos e discutimos os principais benefícios de cada dispositivo.

Respirometria de alta resolução para avaliar bioenergésicos em células e tecidos usando respirômetros baseados em câmara e placas

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and ...

Mitocôndrias fornecem energia celular através da fosforilação oxidativa contribuindo para quase todos os processos dentro da célula. Consequentemente, as disfunções mitocondriais estão associadas a um amplo espectro de doenças. A principal vantagem dessa técnica é a medição em tempo real dos bioenergésicos mitocondriais pelo consumo de oxigênio e, portanto, uma avaliação precisa do metabolismo total da energia celular.A respirometria de alta resolução permite uma avaliação direta do que no sistema de fosforilação oxidativa está falhando, potencialmente fornecendo pistas diagnósticas em doenças mitocondriais primárias e disfunções mitocondriais secundárias associadas a muitos distúrbios. Demonstrando o procedimento será Ryan Awadhpersad, doutorando no meu laboratório. Para começar, realize a calibração de oxigênio executando os respirômetros em 2,1 mililitros de meio de respiração mitocondrial a 37 graus Celsius por mais de 45 minutos e proceda se a variação da linha de base estiver dentro de quatro picomoles por segundo.Cultura HEK293 células em DMEM de alta glicose suplementadas com FBS ativados pelo calor de 10%, GlutaMAX, aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio e uridina em uma incubadora a 37 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono. No dia do experimento, colete e conte as células e resuspende 2,5 milhões de células em 2,5 mililitros de respiração. Para avaliar a respiração de rotina, adicione 2,3 mililitros de suspensão de células médias de respiração quente à câmara.Corra as câmaras a 37 graus Celsius e uma velocidade de agitação de 700 RPM. Aguarde pelo menos três minutos para permitir que a mídia desconste, em seguida, feche as câmaras torcendo a rolha em um movimento rotativo. Em seguida, aspire o excesso de líquido em cima da rolha.Após 10 minutos, obtenha um sinal estável de fluxo de oxigênio para registrar a rotina ou afirmar que eu respiração. Para realizar a análise oxphos em células intactas, adicione dois microliters de oligomicina de 0,01 mililitro para uma concentração final de 10-nanomolar. Titrate FCCP de estoque de dois mililitros adicionando 0,6 microliters a 0,2-microliter passos até que nenhum aumento na respiração seja observado e a respiração seja maximamente desacoplada.Em seguida, adicione um microliter de rotenona de um mililitro para uma concentração final de 0,5-micromolar. Em seguida, adicione dois microliters de um miligrama por estoque de antimicina mililitro para uma concentração final de um micrograma por mililitro. Reoxigenar a câmara ao mesmo nível de oxigênio, aproximadamente 150-micromolar, levantando o êmbolo.Depois, adicione cinco microliters de 0,8-molar ascorbate para uma concentração final de dois mililitros. Em seguida, adicione imediatamente cinco microliters de 0,2-molar TMPD para uma concentração final de 0,5 mililitro e avalie a atividade iv complexa. À medida que o pico de fluxo de oxigênio é atingido com TMPD, adicione cinco microliters ou quatro molares azida para uma concentração final de 10 mililitros.Em seguida, continue a execução por pelo menos cinco minutos para avaliar a auto-oxidação do TMPD para o cálculo complexo do nível base IV. Após a execução, colete um mililitro de suspensão amostral de cada câmara e centrífuga a 1.000 G para células permeabilizadas ou a 20.000 G para lise tecidual. Em seguida, descarte o supernasciente e congele a pelota a menos 80 graus Celsius para uma análise mais a jusante.Primeiro, semear as células de acordo com as taxas de crescimento das linhas celulares individuais. Diluir a oligomicina, FCCP, rotenona e antimicina em três microliters de médio ensaio para uma concentração final de 1,5-micromolar, 1.125-micromolar e um micromolar, respectivamente. Posteriormente, preencha-os em portas separadas.Observe as portas de injeção para garantir um carregamento uniforme das amostras. Ligue o sistema baseado em microplacos e computador e equilibre-os a 37 graus Celsius por pelo menos três horas. No dia do ensaio baseado em microplacos, verifique a confluência da placa de cultura celular, a morfologia das células e certifique-se de que os poços de fundo estão vazios.Em seguida, remova tudo, exceto 20 microliters do meio cultural de cada poço. Em seguida, lave cada poço com 90 microliters de médio ensaio e adicione 100 microliters de meio de ensaio para fazer um volume final de até 120 microliters. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora sem dióxido de carbono por 60 minutos.Depois de recuperar a placa da incubadora, remova a tampa e coloque a microplaca na ranhura. Clique em Continuar para iniciar a execução. Depois que a corrida estiver concluída, retire a placa e remova a mídia restante do ensaio sem perturbar as células.Em seguida, congele a placa inteira a menos 80 graus Celsius. Após a realização dos experimentos de permeabilização e respiração de digitonina, foram registrados traços de consumo de oxigênio bruto de células HEK293 do tipo selvagem e células HEK293 com um nocaute genético mediado pelo CRISPR, resultando em múltiplas deficiências de OXPHOS. Foram obtidos traços de consumo de oxigênio normalizados por entrada de células sobrepostas.Crispr knockout 1 mostra respiração prejudicada e crispr nocaute 2 não mostra respiração em comparação com tipo selvagem quando normalizado para número de célula. As quantidades proteicas foram quantificadas e os valores respiratórios foram normalizados em quantidade proteica, a fim de determinar valores absolutos dos estados respiratórios e respectivas razões de controle de fluxo. As taxas de acidificação extracelular foram encontradas para aumentar a deficiência de OXPHOS no nocaute CRISPR 2, sugerindo compensação da deficiência de fosforilação oxidativa mitocondrial nas células HEK293 através do aumento da glicólise.Além disso, os valores respiratórios foram determinados na presença de oligomicina, FCCP e rotenona, e os valores obtidos foram normalizados para a quantidade proteica. Foram estudados traços de consumo de oxigênio normalizados de células HEK293 do tipo selvagem e células HEK293 com deficiência de tradução mitocondrial mediada pelo CRISPR, causando múltiplas deficiências de OXPHOS. Foram obtidos traços de consumo de oxigênio normalizados pelo tecido molhado do cérebro do rato e do músculo soleus do rato.Os músculos soleus apresentam três vezes mais capacidade de OXPHOS e respiração do que o cerebelo. Com a respirometria baseada em câmara, é importante trabalhar rápido, pois a função mitocondrial diminuirá no momento em que você coletar suas amostras, e com a respirometria baseada em placas, é crucial adquirir uma densidade de semeadura ideal para minimizar a variabilidade. Para análise mais aprofundada, quantificação de proteínas ou imuno-blotting é possível.Isso poderia determinar se uma alteração na função respiratória mitocondrial foi devido à abundância de complexos OXPHOS ou quantidade mitocondrial. Já há um século, foram encontradas células cancerígenas para realizar glicólise anaeróbica, além de OXPHOS mitocondrial. Isso sublinha a necessidade de avaliar bioenergetics mitocondriais.Aqui demonstramos dois respirômetros considerados o padrão-ouro de hoje.

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