Name: combined mechanical and enzymatic dissociation of mouse brain hippocampal tissue
Uploaded: 2021-10-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue at JoVE.com

Agradecemos a Aimee Rogers por proporcionar capacitación práctica y soporte continuo del producto. Agradecemos a la Dra. Amanda Burke por la solución de problemas en curso y las discusiones aclaratorias. Agradecemos a Meredith Joheim y al Grupo de Comunicación Científica de la UAMS por la edición gramatical y el formato de este manuscrito. Este estudio fue apoyado por NIH R25GM083247 y NIH 1R01CA258673 (A.R.A).

Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares éticos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en UAMS. Se compraron ratones hembra C57Bl6 / J de 6 meses de edad y se alojaron en grupo (4 ratones por jaula) bajo un ciclo constante de luz / oscuridad de 12 h.
1. Preparación de reactivos
<ol><li>Prepare una solución reparable de material de manchas vivas / muertas. Reconstituir la tinción fluorescente con 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO).</l...

<ol>
	<li>Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Hippocampus Book. , (2007).</li><li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+influence+on+neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+adult+mice.">Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).</li><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Functional+Implications+of+Adult+Neurogenesis.">Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li><li>Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+hippocampus.">Neurogenesis in the adult hippocampus.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812 (2015).</li><li>Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mammalian+neural+stem+cells+and+neurogenesis:+Five+decades+later.">Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later.</a> Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).</li><li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+microglia+on+neurogenesis.">Effects of microglia on neurogenesis.</a> Glia. 63, 1394-1405 (2015).</li><li>Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+in+adult+neurogenesis.">Signaling in adult neurogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).</li><li>Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+hippocampus:+history,+regulation,+and+prospective+roles.">Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles.</a> International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).</li><li>Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+stem+cells+in+the+hippocampus.">Heterogeneity of stem cells in the hippocampus.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).</li><li>Abbott, L. C., Nigussie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+dentate+gyrus.">Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus.</a> Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).</li><li>Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+precursors+using+magnetic+activated+cell+sorting.">Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting.</a> Methods in Molecular Biology. 1283, 137-145 (2015).</li><li>Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+analysis+of+multiple+surface+markers+expressed+on+rat+neural+stem+cells+using+antibody+microarrays.">Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays.</a> Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).</li><li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).</li><li>Volovitz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-aggressive,+highly+efficient,+enzymatic+method+for+dissociation+of+human+brain-tumors+and+brain-tissues+to+viable+single-cells.">A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells.</a> BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).</li><li>Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec Available from: <a target="_blank" href="https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf">https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf</a> (2020)</li><li>Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec Available from: <a target="_blank" href="https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html">https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html</a> (2021)</li><li>Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CytoML+for+cross-platform+cytometry+data+sharing.">CytoML for cross-platform cytometry data sharing.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).</li><li>Tura&#231;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+flow+cytometric+analysis+of+surface+and+intracellular+antigens+reveals+surface+molecule+markers+of+human+neuropoiesis.">Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis.</a> PLoS One. 8, 1-14 (2013).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence+activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Brummelman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=application+and+computational+analysis+of+high-dimensional+fluorescent+antibody+panels+for+single-cell+flow+cytometry.">application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry.</a> Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).</li><li>Recommended controls for flow cytometry. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry">https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry</a> (2021)</li><li>. Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry Available from: <a target="_blank" href="https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf">https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf</a> (2021)</li><li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation.">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li><li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes.">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109, 11-26 (2021).</li><li>Ho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+single-cell+transcriptomics+in+adult+rodent+brain:+The+medium+spiny+neuron+transcriptome+revisited.">A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+technologies+in+studying+brain+immune+response.">Novel technologies in studying brain immune response.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566 (2021).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+atlas+of+the+mouse+brain+at+single-cell+resolution.">DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations.">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing.">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).</li><li>Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Surface+markers+and+beyond.">Flow cytometry: Surface markers and beyond.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).</li><li>O'Connor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+flow+cytometry+for+biochemical+analysis.">The relevance of flow cytometry for biochemical analysis.</a> IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241 (2014).</li></ol>

Varios pasos en este protocolo de disociación neuronal requieren una técnica competente y destreza: perfusión, aspiración sobrenadante y eliminación de mielina. Durante todo el proceso de perfusión, los órganos internos deben permanecer intactos (aparte de extirpar el diafragma y recortar el corazón); esto incluye evitar las cámaras superiores del corazón con la aguja de mariposa. Si bien la cantidad de solución salina con heparina necesaria varía, el líquido transparente que fluye desde el corazón indica q...

El hipocampo fue descrito por primera vez por un anatomista boloñés, Giulio Cesare Aranzio, en la década de 15001. Al nombrar esta nueva estructura, Aranzio probablemente se inspiró en su extraño parecido con el caballito de mar del género Hippocampus1. El hipocampo está involucrado en las respuestas al estrés, pero es ampliamente conocido por su papel en el aprendizaje y la memoria. Más específicamente, el hipocampo es responsable de la codificación y recuperación de la memoria declarativa y espacial1.
El hipocampo, o hipocampo propiamente dicho, se divide en los subcampos CA1 (cornu ammonis), CA2 y CA31. En comparación con el resto del sistema nervioso, el hipocampo tiene varias características definitorias únicas, incluida su plasticidad y potencial para la neurogénesis en curso2. La neurogénesis es el proceso de proliferación y diferenciación de las células madre neurales, seguido de su integración en la red neuronal preexistente. La neurogénesis se restringe a la zona subgranular del giro dentado y a la zona subventricular de los ventrículos laterales (y los bulbos olfativos)3. Si bien la neurogénesis es abundante en la embriogénesis, es un proceso de por vida 3,4. Como tal, esta discusión se centrará en la neurogénesis adulta en el hipocampo.
Las zonas subventricular y subgranular son nichos neurogénicos que contienen células ependimarias y vasculares, así como linajes inmaduros y maduros de células madre neurales5. La microglía contribuye a estos nichos como células inmunes para regular la neurogénesis6. Las células progenitoras neurales son progenies de células no madre de células madre neurales7. Tres tipos de progenitores neurales están presentes en la zona subventricular: células tipo B similares a la glía radial, progenitores amplificadores de tránsito tipo C y neuroblastos tipo A 3,8. Las células progenitoras neurales tipo B que se dividen lentamente en la zona subventricular pueden diferenciarse en células tipo C que se dividen rápidamente8. Posteriormente, las células de tipo C se diferencian en células de tipo A8. Estos neuroblastos migran a través de la corriente migratoria rostral hasta el bulbo olfatorio antes de diferenciarse en interneuronas u oligodendrocitos9. Estas interneuronas del bulbo olfatorio son clave para la memoria olfativa a corto plazo y el aprendizaje asociativo, mientras que los oligodendrocitos mielinizan los axones del cuerpo calloso9. La mayoría de la neurogénesis adulta ocurre en la zona subgranular del giro dentado, donde se encuentran progenitores neurales radiales tipo 1 y no radiales tipo 23. La mayoría de las células progenitoras neurales están destinadas a convertirse en neuronas granulosas dentadas y astrocitos10. Conectados por uniones de brecha, los astrocitos forman redes para modular la plasticidad, la actividad sináptica y la excitabilidad neuronal5. Como neurona excitadora primaria del giro dentado, las células granulares proporcionan entrada desde la corteza entorrinal a la región CA311.
Las poblaciones de células madre neurales pueden aislarse utilizando estrategias de aislamiento inmunomagnético o inmunofluorescente12,13. El tejido neural es particularmente difícil de disociar; los esfuerzos para hacerlo a menudo resultan en muestras con poca viabilidad celular y / o no producen la suspensión de una sola célula necesaria para el análisis posterior. La disociación neuronal se puede realizar a través de la disociación mecánica (como el uso de filtros, técnicas de corte o trituración de pipetas), digestión enzimática o una combinación de técnicas14,15. En un estudio que evaluó los métodos de disociación neural, se comparó la viabilidad y calidad de la disociación mecánica manual por trituración de pipetas versus combinaciones de trituración de pipetas y digestión con diversas enzimas15. La calidad se calificó en función de la cantidad de grupos celulares y ADN o restos subcelulares en la suspensión preparada15. Las suspensiones de tumores gliales sometidos a disociación mecánica manual sola tuvieron una viabilidad celular significativamente menor que los tratamientos con dispasa o una combinación de DNasa, colagenasa e hialuronidasa15. Volovitz et al. reconocieron la variación en viabilidad y calidad entre los diferentes métodos y enfatizaron que una disociación inadecuada puede reducir la precisión del análisis aguas abajo15.
En un estudio separado, los autores compararon más de 60 métodos y combinaciones diferentes de disociación de células neuronales cultivadas14. Estos métodos incluyeron ocho variaciones diferentes de disociación mecánica manual por trituración de pipetas, una comparación de la incubación con cinco enzimas individuales a tres intervalos diferentes y varias combinaciones de disociación mecánica con digestión enzimática o la combinación de dos enzimas14. Ninguno de los métodos mecánicos produjo una suspensión de una sola célula14. Cuatro de los tratamientos de enzima única, diez de los tratamientos enzimáticos combinados y cuatro de las combinaciones de disociación mecánica con digestión enzimática produjeron una suspensión de una sola célula14. La digestión enzimática con TrypLE seguida de las muestras disociadas de Tripsina-EDTA de manera más efectiva14. Por cierto, las muestras tratadas con TrypLE y/o Tripsina-EDTA tendían a formar grupos gelatinosos14. Si bien este estudio se realizó en células cultivadas, habla de las deficiencias de la trituración de pipetas o la digestión enzimática sola.
Faltan comparaciones lado a lado de la disociación mecánica manual versus automatizada. Sin embargo, un grupo ejecutó la citometría de flujo para comparar la disociación mecánica manual y semiautomatizada de cerebros de ratones enteros junto con kits de disociación enzimática de papaína comercial o tripsina16. El procesamiento con el disociador produjo células viables de manera más consistente16. Después de la disociación, los autores también aislaron células prominina-1, células precursoras neuronales y microglia16. Para dos de las tres poblaciones de células aisladas, la pureza de las células aisladas fue ligeramente mayor cuando las muestras se procesaron con el disociador, en comparación con16 manualmente. Reiß et al. señalaron que la variabilidad de persona a persona en la técnica de pipeteo dificulta la reproducibilidad del rendimiento de la población celular viable en la disociación tisular16. Los autores concluyeron que la disociación mecánica automatizada estandariza el procesamiento de muestras16.
El método de disociación descrito en este manuscrito es una combinación de disociación mecánica totalmente automatizada y digestión enzimática, utilizando soluciones que acompañan a un kit comercial de disociación cerebral adulta17. A diferencia de los protocolos estándar, este protocolo optimizado reduce la manipulación de muestras, produce una suspensión unicelular altamente viable y está destinado a procesar cantidades mínimas de tejido de partida.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-003</td>
			<td>Basix, assorted color</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson Labware Europe</td>
			<td>352009</td>
			<td>Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>&#160;130-107-677</td>
			<td>Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3821-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-117-394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-111-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Hot Plate Stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-100SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>(v10.7.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-555-25A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>504011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15012-12</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244-3KG</td>
			<td>Prilled, 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips GP LTS 20 &#181;L 960A/10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips GP LTS 250 &#181;L 960A/10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips RT LTS 1000 &#181;L FL 768A/8</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 &#956;L)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBXMO FITC XADS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Ice Bucket with Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>100-0087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 Pipet Fillers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula &#38; Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td>Dissection &#38; Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4&#34;</td>
			<td>Termuno</td>
			<td>SV-23BLK</td>
			<td>Butterfly needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Tube Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-809-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Or other standard table top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable-Flow Peristaltic Pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-2</td>
			<td>Low-flow model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetFlo Starter Kit for Mice</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>VetFlo-MSEKIT</td>
			<td>Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>VetFlo-1210S</td>
			<td>0.2&#8211;4 LPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>731196</td>
			<td>Cell Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>383721</td>
			<td>Cell Counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined mechanical and enzymatic dissociation of mouse brain hippocampal tissue

Este protocolo de disociación neuronal (una adaptación del protocolo que acompaña a un kit comercial de disociación cerebral adulta) optimiza el procesamiento de tejidos en preparación para análisis detallados aguas abajo, como la citometría de flujo o la secuenciación de una sola célula. La disociación neuronal se puede llevar a cabo a través de la disociación mecánica (como el uso de filtros, técnicas de corte o trituración de pipetas), digestión enzimática o una combinación de las mismas. La naturaleza delicada de las células neuronales puede complicar los esfuerzos para obtener la suspensión unicelular verdadera y altamente viable con un mínimo de desechos celulares que se requiere para el análisis de una sola célula. Los datos demuestran que esta combinación de disociación mecánica automatizada y digestión enzimática produce consistentemente una suspensión unicelular altamente viable (>90%), superando las dificultades antes mencionadas. Si bien algunos de los pasos requieren destreza manual, estos pasos disminuyen el manejo de muestras y la posible pérdida de células. Este manuscrito detalla cada paso del proceso para equipar a otros laboratorios para disociar con éxito pequeñas cantidades de tejido neural en preparación para el análisis posterior.

Las muestras se procesaron con un citómetro de flujo en una instalación central, y los datos resultantes se evaluaron con un paquete de software para el análisis de flujo. Anteriormente, se analizaron los controles de compensación: la mancha viva / muerta y el control negativo. Si se utilizan múltiples fluorocromos, se deben preparar controles de fluorescencia menos uno (FMO) y controles de tinción única para cada anticuerpo. La compensación por superposición espectral para las muestras experimentales se calcul?...

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Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

Este protocolo de disociación de células neuronales está destinado a muestras con una baja cantidad de material de partida y produce una suspensión unicelular altamente viable para el análisis posterior, con pasos opcionales de fijación y tinción.

Disociación mecánica y enzimática combinada del tejido del hipocampo cerebral de ratón

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Disociar con éxito pequeñas cantidades de tejido neural puede equipar a los laboratorios para obtener información específica de la estructura sobre la eficacia del tratamiento, la función celular, así como la enfermedad y los mecanismos de acción del tratamiento. Este protocolo de disociación neuronal produce consistentemente una suspensión unicelular altamente viable y real. Además, podemos procesar muestras que son solo una fracción de las que están destinados los kits comerciales.La planificación y preparación adecuadas son clave para un resultado exitoso de esta técnica. Ejecutar varias rondas de práctica para familiarizarse con el protocolo sería beneficioso. Después de anestesiar a un ratón C57BL/6J hembra de seis meses de edad, pellizque la parte inferior del abdomen y levante la piel con fórceps.Luego, con tijeras, corte a través del pelaje y la piel hasta la parte inferior de la caja torácica. Haga dos incisiones diagonales que comiencen por debajo de la caja torácica y se muevan hacia cada hombro. Luego reseque cuidadosamente el diafragma y la caja torácica para exponer el corazón.Después de extraer cuidadosamente cualquier tejido conectivo alrededor del corazón, use tijeras para cortar la aurícula derecha. Luego apague el flujo de isoflurano hacia el respirador. Manteniendo el corazón firme con fórceps y con el bisel de la aguja de mariposa hacia arriba, perfore el ventrículo izquierdo mientras mantiene la aguja nivelada y paralela al animal.A continuación, mantenga la aguja en su lugar, encienda la bomba y perfunda al menos 30 mililitros de la solución salina o heparina hasta que el líquido que sale del corazón sea opaco y el hígado y los pulmones de color pálido. Después de la perfusión, apague la bomba, retire la aguja y transfiera el ratón al área de disección. Después de la decapitación, corte el pelaje desde la parte posterior de la cabeza hasta los ojos y despegue la piel hacia atrás para exponer el cráneo.A continuación, recorte el cráneo entre los ojos y haga dos cortes en la parte posterior del cráneo en las posiciones de las 10 y 2 en punto. Luego haga un corte largo a lo largo de la línea media sagital del cráneo hasta el corte original entre los ojos. A continuación, con fórceps, despegue las dos mitades del cráneo hacia los lados.Luego use una espátula para extraer el cerebro y colóquelo en una placa de Petri de vidrio de 60 milímetros llena de DPBS frío y mantenida en hielo. Usando un bisturí o una maquinilla de afeitar, separe cada hemisferio y retire los bulbos olfativos y el cerebelo. Luego retire el mesencéfalo hasta que el hipocampo esté expuesto.A continuación, asegure el cerebro con fórceps. Luego, usando un segundo juego de fórceps, saque suavemente el hipocampo de cada hemisferio. Transfiera ambos hipocampos a un tubo etiquetado de 1,5 mililitros que contenga DPBS frío y coloque el tubo sobre hielo.Usando fórceps, transfiera las piezas de tejido del hipocampo a un tubo C y agregue 30 microlitros de mezcla de enzimas 2 en el tubo. Después de girar la tapa y apretar hasta que haga clic, coloque el tubo en un disociador y ejecute el programa apropiado. Mientras el programa se está ejecutando, moje previamente un colador de células de 70 micras colocado en un tubo cónico de 50 mililitros con dos mililitros de tampón BSA.Una vez que se complete el programa de disociación, agregue cuatro mililitros de tampón BSA al tejido disociado y filtre la mezcla a través del colador celular en el tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, agregue 10 mililitros de DPBS al tubo C. Luego cierre el tubo, gire la solución suavemente y filtre a través del colador celular en el tubo cónico de 50 mililitros.Centrifugar la suspensión de la célula filtrada, desechar el sobrenadante sin molestar el pellet y almacenar el pellet. Para la eliminación de escombros, vuelva a suspender el pellet con 1, 550 microlitros de DPBS frío y transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros etiquetado. Luego agregue 450 microlitros de solución de eliminación de escombros fríos y pipetee hacia arriba y hacia abajo.Superponga suavemente la suspensión celular con un mililitro de DPBS frío, manteniendo la punta contra la pared del tubo cónico. Repita el procedimiento hasta que la superposición total sea de dos mililitros. A continuación, centrífuga la suspensión a 3.000 veces G durante 10 minutos con aceleración completa y descanso completo.Aspire la capa superior, luego barre la punta de la pipeta hacia adelante y hacia atrás para aspirar la capa media blanca. Retire la mayor cantidad posible de la capa intermedia sin perturbar la capa inferior. A continuación, agregue dos mililitros de DPBS frío y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.Luego centrífuga la suspensión a 1, 000 veces G durante 10 minutos con aceleración completa y descanso completo. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un tampón BSA de mililitros. Después del conteo celular, centrifugue la suspensión celular restante y vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de tinción muerta viva diluida.Luego transfiera la muestra a un tubo de flujo etiquetado e incube a temperatura ambiente durante 8 a 10 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, agregue 500 microlitros de tampón BSA y repita el paso de centrifugación. Luego deseche el sobrenadante, dejando una pequeña cantidad de tampón en el tubo.La puerta primaria excluyó los escombros en los gráficos de dispersión hacia adelante frente a los gráficos de dispersión lateral y las células muertas se excluyeron posteriormente. La segunda puerta excluyó las células positivas para la proteína básica de mielina. Y de las células restantes, se crearon diagramas de densidad de células positivas para cada fluorocromo.La frecuencia de cada población de células neuronales se calculó a partir de la tercera puerta. Las muestras procesadas con disociación mecánica manual y digestión enzimática produjeron una población sustancialmente menor de células de interés, mientras que tanto las muestras frescas como las fijas procesadas con disociación mecánica automatizada y digestión enzimática mostraron una población varias veces mayor de células de interés. Si bien los pasos de perfusión y eliminación de escombros pueden ser desafiantes inicialmente, mantener una mano suave y firme puede ayudar a garantizar el éxito.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparación de oligómeros β-amiloide 1-42 Y la inducción del deterioro de plasticidad sináptica en rodajas de hipocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Investigación

Neurociencias

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Combinados Optogenética y congelación-fractura Réplica Immunolabeling para Analizar Arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

La caracterización de propiedades mecánicas Multiescala de tejido cerebral mediante microscopía de fuerza atómica, Impacto sangría, y Rheometría

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...