Name: combined mechanical and enzymatic dissociation of mouse brain hippocampal tissue
Uploaded: 2021-10-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue at JoVE.com

Aimee Rogers'a uygulamalı eğitim ve sürekli ürün desteği sağladığı için teşekkür ederiz. Dr. Amanda Burke'e devam eden sorun giderme ve açıklayıcı tartışmalar için teşekkür ederiz. Meredith Joheim ve UAMS Bilim İletişim Grubu'na bu makalenin gramer düzenlemesi ve biçimlendirmesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R25GM083247 ve NIH 1R01CA258673 (A.R.A.) tarafından desteklenmiştir.

Deneyler, UAMS'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan etik standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 6 aylık dişi C57Bl6 / J vahşi tip fareler satın alındı ve sabit bir 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü altında grup barındırıldı (kafes başına 4 fare).
1. Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Sabitlenebilir canlı/ölü leke suyu çözeltisi hazırlayın. Floresan boyasını 20 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ile yeniden oluşt...

<ol>
	<li>Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Hippocampus Book. , (2007).</li><li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+influence+on+neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+adult+mice.">Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).</li><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Functional+Implications+of+Adult+Neurogenesis.">Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li><li>Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+hippocampus.">Neurogenesis in the adult hippocampus.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812 (2015).</li><li>Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mammalian+neural+stem+cells+and+neurogenesis:+Five+decades+later.">Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later.</a> Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).</li><li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+microglia+on+neurogenesis.">Effects of microglia on neurogenesis.</a> Glia. 63, 1394-1405 (2015).</li><li>Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+in+adult+neurogenesis.">Signaling in adult neurogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).</li><li>Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+hippocampus:+history,+regulation,+and+prospective+roles.">Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles.</a> International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).</li><li>Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+stem+cells+in+the+hippocampus.">Heterogeneity of stem cells in the hippocampus.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).</li><li>Abbott, L. C., Nigussie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+dentate+gyrus.">Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus.</a> Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).</li><li>Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+precursors+using+magnetic+activated+cell+sorting.">Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting.</a> Methods in Molecular Biology. 1283, 137-145 (2015).</li><li>Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+analysis+of+multiple+surface+markers+expressed+on+rat+neural+stem+cells+using+antibody+microarrays.">Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays.</a> Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).</li><li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).</li><li>Volovitz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-aggressive,+highly+efficient,+enzymatic+method+for+dissociation+of+human+brain-tumors+and+brain-tissues+to+viable+single-cells.">A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells.</a> BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).</li><li>Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec Available from: <a target="_blank" href="https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf">https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf</a> (2020)</li><li>Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec Available from: <a target="_blank" href="https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html">https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html</a> (2021)</li><li>Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CytoML+for+cross-platform+cytometry+data+sharing.">CytoML for cross-platform cytometry data sharing.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).</li><li>Tura&#231;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+flow+cytometric+analysis+of+surface+and+intracellular+antigens+reveals+surface+molecule+markers+of+human+neuropoiesis.">Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis.</a> PLoS One. 8, 1-14 (2013).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence+activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Brummelman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=application+and+computational+analysis+of+high-dimensional+fluorescent+antibody+panels+for+single-cell+flow+cytometry.">application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry.</a> Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).</li><li>Recommended controls for flow cytometry. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry">https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry</a> (2021)</li><li>. Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry Available from: <a target="_blank" href="https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf">https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf</a> (2021)</li><li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation.">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li><li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes.">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109, 11-26 (2021).</li><li>Ho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+single-cell+transcriptomics+in+adult+rodent+brain:+The+medium+spiny+neuron+transcriptome+revisited.">A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+technologies+in+studying+brain+immune+response.">Novel technologies in studying brain immune response.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566 (2021).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+atlas+of+the+mouse+brain+at+single-cell+resolution.">DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations.">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing.">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).</li><li>Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Surface+markers+and+beyond.">Flow cytometry: Surface markers and beyond.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).</li><li>O'Connor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+flow+cytometry+for+biochemical+analysis.">The relevance of flow cytometry for biochemical analysis.</a> IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241 (2014).</li></ol>

Bu nöral ayrışma protokolündeki birkaç adım, yeterli teknik ve el becerisi gerektirir – perfüzyon, süpernatant aspirasyon ve miyelin çıkarılması. Perfüzyon süreci boyunca, iç organlar sağlam kalmalıdır (diyaframı çıkarmak ve kalbi kırpmak dışında); bu, kelebek iğnesi ile kalbin üst odalarından kaçınmayı içerir. İhtiyaç duyulan heparin ile salin miktarı değişirken, kalpten akan şeffaf sıvı işlemin tamamlandığını gösterir. Beyin tamamen ve uygun şekilde perfüze edilmelidir,...

Hipokampus ilk olarak 1500'lüyıllarda bir Bolognese anatomisti olan Giulio Cesare Aranzio tarafından tanımlanmıştır. Bu yeni keşfedilen yapıyı adlandırırken, Aranzio muhtemelen Hipokampus1 cinsinin denizatına olan esrarengiz benzerliğinden ilham aldı. Hipokampus stres tepkilerinde rol oynar, ancak öğrenme ve hafızadaki rolü ile yaygın olarak bilinir. Daha spesifik olarak, hipokampus, bildirimsel ve uzamsal belleğin kodlanmasından ve alınmasından sorumludur1.
Hipokampus veya uygun hipokampus, CA1 (cornu ammonis), CA2 ve CA3 alt alanları1'e ayrılmıştır. Sinir sisteminin geri kalanıyla karşılaştırıldığında, hipokampus, plastisitesi ve devam eden nörogenezpotansiyeli de dahil olmak üzere birçok benzersiz tanımlayıcı özelliğe sahiptir 2. Nörogenez, nöral kök hücrelerin çoğalması ve farklılaşması sürecidir, bunu takiben önceden var olan nöronal ağa entegrasyonları izler. Nörogenez, dentat girusun subgranüler bölgesi ve lateral ventriküllerin (ve koku alma ampullerinin) subventriküler bölgesi ile sınırlıdır3. Nörogenez embriyogenezde bol miktarda bulunurken, yaşam boyu süren bir süreçtir 3,4. Bu nedenle, bu tartışma hipokampustaki yetişkin nörogenezine odaklanacaktır.
Subventriküler ve subgranüler bölgeler, ependimal ve vasküler hücrelerin yanı sıra nöral kök hücrelerin olgunlaşmamış ve olgun soylarını içeren nörojenik nişlerdir5. Mikroglia, nörogenezi düzenlemek için bağışıklık hücreleri olarak bu nişlere katkıda bulunur6. Nöral progenitör hücreler, nöral kök hücrelerin kök hücre dışı soylarıdır7. Subventriküler bölgede üç tip nöral progenitör bulunur: radyal glia benzeri tip B hücreleri, C tipi transitif yükseltici progenitörler ve tip A nöroblastları 3,8. Subventriküler bölgedeki yavaş bölünen tip B nöral progenitör hücreler, hızla bölünen tip C hücrelerine farklılaşabilir8. Daha sonra, C tipi hücreler A tipi hücrelere8 olarak farklılaşır. Bu nöroblastlar, internöronlara veya oligodendrositlere farklılaşmadan önce rostral göç akışından koku alma ampulüne göç eder9. Bu koku alma ampulü internöronları, koku alma kısa süreli hafızanın ve ilişkisel öğrenmenin anahtarıdır, oysa oligodendrositler korpus kallozum9'un miyelinli aksonlarını oluşturur. Erişkin nörogenezin çoğunluğu, radyal tip 1 ve radyal olmayan tip 2 nöral progenitörlerin bulunduğu dentat girusun subgranüler bölgesinde meydana gelir3. Çoğu nöral progenitör hücre, dentat granül nöronları ve astrositler haline gelmeye mahkumdur10. Boşluk kavşaklarıyla birbirine bağlanan astrositler, plastisiteyi, sinaptik aktiviteyi ve nöronal uyarılabilirliği modüle etmek için ağlar oluşturur5. Dentat girusun birincil uyarıcı nöronu olarak, granül hücreler entorinal korteksten CA3 bölgesi11'e girdi sağlar.
Nöral kök hücre popülasyonları immünomanyetik veya immünofloresan izolasyon stratejileri kullanılarak izole edilebilir12,13. Nöral dokunun ayrışması özellikle zordur; Bunu yapma çabaları genellikle zayıf hücre canlılığına sahip numunelerle sonuçlanır ve / veya aşağı akış analizi için gerekli tek hücreli süspansiyonu üretemez. Nöral ayrışma, mekanik ayrışma (filtreler, doğrama teknikleri veya pipet tritürasyonu gibi), enzimatik sindirim veya tekniklerin bir kombinasyonu yoluyla gerçekleştirilebilir14,15. Nöral ayrışma yöntemlerini değerlendiren bir çalışmada, pipet tritürasyonu ile manuel mekanik ayrışmanın canlılığı ve kalitesi ile pipet tritürasyonu ve sindiriminin çeşitli enzimlerle kombinasyonları karşılaştırılmıştır15. Kalite, hazırlanan süspansiyondaki hücre kümelerinin ve DNA veya hücre altı kalıntıların miktarına göre derecelendirildi15. Tek başına manuel mekanik ayrışmaya maruz kalan glial tümörlerin süspansiyonları, dispazlı tedavilerden veya DNaz, kollajenaz ve hyaluronidaz15'in bir kombinasyonundan önemli ölçüde daha düşük hücre canlılığına sahipti. Volovitz ve ark., farklı yöntemler arasındaki canlılık ve kalitedeki çeşitliliği kabul etmiş ve yetersiz ayrışmanın aşağı akış analizinin doğruluğunu azaltabileceğini vurgulamıştır15.
Ayrı bir çalışmada, yazarlar kültürlü nöronal hücrelerin ayrışmasının 60'tan fazla farklı yöntemini ve kombinasyonunu karşılaştırdılar14. Bu yöntemler, pipet tritürasyonu ile manuel mekanik ayrışmanın sekiz farklı varyasyonunu, üç farklı aralıkta beş ayrı enzimle inkübasyonun karşılaştırılmasını ve enzimatik sindirim veya iki enzimin kombinasyonu ile çeşitli mekanik ayrışma kombinasyonlarını içeriyordu14. Mekanik yöntemlerin hiçbiri tek hücreli bir süspansiyon14 vermedi. Tek enzim tedavilerinden dördü, enzimatik tedavilerin on kombinasyonu ve enzimatik sindirim ile mekanik ayrışma kombinasyonlarının dördü tek hücreli bir süspansiyon14 verdi. TrypLE ile enzimatik sindirim ve ardından Tripsin-EDTA en etkili şekilde ayrışmış örnekler14. Bu arada, TrypLE ve / veya Trypsin-EDTA ile muamele edilen örnekler jelatinimsi kümeler oluşturma eğilimindeydi14. Bu çalışma kültürlenmiş hücreler üzerinde yapılırken, pipet tritürasyonu veya enzimatik sindirimin tek başına eksikliklerine değinmektedir.
Manuel ve otomatik mekanik ayrışmanın yan yana karşılaştırmaları eksiktir. Bununla birlikte, bir grup, ticari papain veya tripsin enzimatik ayrışma kitleri16 ile birlikte tüm fare beyinlerinin manuel ve yarı otomatik mekanik ayrışmasını karşılaştırmak için akış sitometrisini çalıştırdı. Ayrışıcı ile işleme daha tutarlı bir şekilde canlı hücreler verdi16. Ayrışmayı takiben, yazarlar ayrıca Prominin-1 hücrelerini, nöronal öncü hücreleri ve mikroglia16'yı izole ettiler. Üç izole hücre popülasyonundan ikisi için, izole hücrelerin saflığı, örnekler ayrışıcı ile işlendiğinde, manuel olarak16'ya kıyasla biraz daha yüksekti. Reiß ve ark., pipetleme tekniğinde kişiden kişiye değişkenliğin, doku ayrışmasında canlı hücre popülasyonu veriminin tekrarlanabilirliğini engellediğini belirtmiştir16. Yazarlar, otomatik mekanik ayrışmanın numune işlemeyi standartlaştırdığı sonucuna varmışlardır16.
Bu makalede özetlenen ayrışma yöntemi, ticari bir yetişkin beyin ayrışma kiti17'ye eşlik eden çözeltiler kullanılarak, tam otomatik mekanik ayrışma ve enzimatik sindirimin bir kombinasyonudur. Standart protokollerden farklı olarak, bu optimize edilmiş protokol numune manipülasyonunu azaltır, son derece uygulanabilir tek hücreli bir süspansiyon sağlar ve minimum miktarda başlangıç dokusunun işlenmesi için tasarlanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-003</td>
			<td>Basix, assorted color</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson Labware Europe</td>
			<td>352009</td>
			<td>Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>&#160;130-107-677</td>
			<td>Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3821-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-117-394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-111-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Hot Plate Stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-100SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>(v10.7.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-555-25A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>504011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15012-12</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244-3KG</td>
			<td>Prilled, 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips GP LTS 20 &#181;L 960A/10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips GP LTS 250 &#181;L 960A/10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips RT LTS 1000 &#181;L FL 768A/8</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 &#956;L)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30386597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBXMO FITC XADS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Ice Bucket with Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>100-0087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 Pipet Fillers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula &#38; Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td>Dissection &#38; Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4&#34;</td>
			<td>Termuno</td>
			<td>SV-23BLK</td>
			<td>Butterfly needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Tube Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-809-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Or other standard table top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable-Flow Peristaltic Pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-2</td>
			<td>Low-flow model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetFlo Starter Kit for Mice</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>VetFlo-MSEKIT</td>
			<td>Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>VetFlo-1210S</td>
			<td>0.2&#8211;4 LPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>731196</td>
			<td>Cell Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>383721</td>
			<td>Cell Counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined mechanical and enzymatic dissociation of mouse brain hippocampal tissue

Bu nöral ayrışma protokolü (ticari bir yetişkin beyin ayrışma kitine eşlik eden protokolün bir uyarlaması), akış sitometrisi veya tek hücreli dizileme gibi ayrıntılı aşağı akış analizine hazırlık olarak doku işlemeyi optimize eder. Nöral ayrışma, mekanik ayrışma (filtreler, doğrama teknikleri veya pipet tritürasyonu gibi), enzimatik sindirim veya bunların bir kombinasyonu yoluyla gerçekleştirilebilir. Nöronal hücrelerin hassas doğası, tek hücreli analiz için gerekli olan minimum hücresel enkaz ile son derece canlı, gerçek tek hücreli süspansiyonu elde etme çabalarını zorlaştırabilir. Veriler, otomatik mekanik ayrışma ve enzimatik sindirimin bu kombinasyonunun, yukarıda belirtilen zorlukların üstesinden gelerek, sürekli olarak oldukça uygulanabilir (>% 90) tek hücreli bir süspansiyon sağladığını göstermektedir. Adımlardan birkaçı manuel el becerisi gerektirse de, bu adımlar numune kullanımını ve potansiyel hücre kaybını azaltır. Bu makale, aşağı akış analizine hazırlık olarak küçük miktarlarda sinir dokusunu başarılı bir şekilde ayrıştırmak için diğer laboratuvarları donatmak için sürecin her adımını detaylandırmaktadır.

Numuneler çekirdek bir tesiste bir akış sitometresi ile işlendi ve elde edilen veriler akış analizi için bir yazılım paketi ile değerlendirildi. Daha önce, kompanzasyon kontrolleri analiz edildi - canlı / ölü leke ve negatif kontrol. Birden fazla florokrom kullanılıyorsa, her antikor için floresan eksi bir (FMO) kontrolleri ve tek lekeli kontroller hazırlanmalıdır. Deneysel örnekler için spektral örtüşme tazminatı, analiz edilen kontrollere dayanarak hesaplanmıştır. Hücre popülasyonu tanım...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue at JoVE.com

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

Bu nöral hücre ayrışma protokolü, düşük miktarda başlangıç malzemesine sahip numuneler için tasarlanmıştır ve isteğe bağlı sabitleme ve boyama adımlarıyla aşağı akış analizi için oldukça uygun bir tek hücreli süspansiyon sağlar.

Fare Beyni Hipokampal Dokusunun Kombine Mekanik ve Enzimatik Ayrışması

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Küçük miktarlarda nöral dokunun başarılı bir şekilde ayrıştırılması, laboratuarları tedavi etkinliği, hücresel fonksiyon, hastalık ve tedavi etki mekanizmaları hakkında yapıya özgü bir anlayış kazanmak için donatabilir. Bu nöral ayrışma protokolü sürekli olarak oldukça uygulanabilir ve gerçek bir tek hücreli süspansiyon sağlar. Ek olarak, ticari kitlerin amaçlandığının sadece bir kısmı olan numuneleri işleyebiliriz.Doğru planlama ve hazırlık, bu teknik için başarılı bir sonucun anahtarıdır. Protokolü tanımak için birkaç alıştırma turu yapmak faydalı olacaktır. Altı aylık bir dişi C57BL / 6J fareyi uyuşturduktan sonra, alt karnı sıkıştırın ve forseps kullanarak cildi kaldırın.Daha sonra makas kullanarak, kürk ve cildi göğüs kafesinin dibine kadar kesin. Göğüs kafesinin altından başlayarak her omuza doğru hareket eden iki çapraz kesi yapın. Daha sonra kalbi açığa çıkarmak için diyaframı ve göğüs kafesini dikkatlice rezeke edin.Kalbin etrafındaki herhangi bir bağ dokusunu dikkatlice çıkardıktan sonra, sağ atriyumu kırpmak için makas kullanın. Ardından solunum cihazına izofluran akışını kapatın. Kalbi forseps ve kelebek iğnesinin eğimi yukarı bakacak şekilde sabit tutarak, iğne seviyesini ve hayvana paralel tutarken sol ventrikülü delin.Daha sonra, iğneyi yerinde tutarak, pompayı açın ve kalpten çıkan sıvı opak olana ve karaciğer ve akciğerler soluk olana kadar en az 30 mililitre salin veya heparin çözeltisini perfüze edin. Perfüzyondan sonra, pompayı kapatın, iğneyi çıkarın ve fareyi diseksiyon alanına aktarın. Kafa kesmeden sonra, kürkü başın arkasından gözlere kadar kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için cildi tekrar soyun.Ardından, kafatasını gözlerin arasına yerleştirin ve kafatasının arkasında saat 10 ve 2 pozisyonlarında iki kesik yapın. Ardından, kafatasının midsagital çizgisi boyunca gözler arasındaki orijinal kesime uzun bir kesim yapın. Daha sonra, forseps kullanarak, kafatasının iki yarısını yanlara doğru soyun.Daha sonra beyni çıkarmak için bir spatula kullanın ve soğuk DPBS ile doldurulmuş ve buz üzerinde tutulan 60 milimetrelik bir cam Petri kabına yerleştirin. Bir neşter veya tıraş bıçağı kullanarak, her yarım küreyi ayırın ve koku alma ampullerini ve beyinciği çıkarın. Daha sonra hipokampus açığa çıkana kadar orta beyni çıkarın.Daha sonra, beyni forseps ile güvence altına alın. Daha sonra ikinci bir forseps seti kullanarak, hipokampüsü her yarım küreden nazikçe kızdırın. Her iki hipokampiyi de soğuk DPBS içeren etiketli 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.Forseps kullanarak, hipokampi doku parçalarını bir C tüpüne aktarın ve tüpe 30 mikrolitre enzim karışımı 2 ekleyin. Kapağı büktükten ve tıklayana kadar sıktıktan sonra, tüpü bir ayrıştırıcıya yerleştirin ve uygun programı çalıştırın. Program çalışırken, iki mililitre BSA tamponu ile 50 mililitrelik bir konik tüp üzerine yerleştirilmiş 70 mikronluk bir hücre süzgecini önceden ıslatın.Ayrışma programı tamamlandıktan sonra, ayrışmış dokuya dört mililitre BSA tamponu ekleyin ve karışımı 50 mililitrelik konik tüp üzerindeki hücre süzgecinden süzün. Ardından, C tüpüne 10 mililitre DPBS ekleyin. Ardından tüpü kapatın, çözeltiyi yavaşça döndürün ve 50 mililitrelik konik tüp üzerindeki hücre süzgecinden süzün.Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu santrifüj edin, pelet rahatsız etmeden süpernatantı atın ve peleti saklayın. Enkaz kaldırma için, peleti 1.550 mikrolitre soğuk DPBS ile yeniden askıya alın ve süspansiyonu etiketli 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ardından 450 mikrolitre soğuk döküntü giderme çözeltisi ve pipeti yukarı ve aşağı ekleyin.Hücre süspansiyonunu yavaşça bir mililitre soğuk DPBS ile kaplayın ve ucu konik tüpün duvarına karşı tutun. Toplam kaplama iki mililitre olana kadar prosedürü tekrarlayın. Daha sonra, süspansiyonu tam hızlanma ve tam mola ile 10 dakika boyunca 3.000 kez G'de santrifüj yapın.En üst tabakayı aspire edin, ardından beyaz orta tabakayı aspire etmek için pipet ucunu ileri geri süpürün. En alt katmanı rahatsız etmeden orta katmanın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Ardından, karıştırmak için iki mililitre soğuk DPBS ve pipeti yukarı ve aşağı ekleyin.Daha sonra süspansiyonu tam hızlanma ve tam mola ile 10 dakika boyunca 1.000 kez G'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peleti bir mililitre BSA tamponunda yeniden askıya alın. Hücre sayımından sonra, kalan hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve peleti 50 mikrolitre seyreltilmiş canlı ölü lekede yeniden askıya alın.Daha sonra numuneyi etiketli bir akış tüpüne aktarın ve karanlıkta 8 ila 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Kuluçkadan sonra, 500 mikrolitre BSA tamponu ekleyin ve santrifüjleme adımını tekrarlayın. Daha sonra süpernatanı atın ve tüpte az miktarda tampon bırakın.Birincil kapı, ileri saçılmaya karşı yan saçılma grafiklerindeki kalıntıları dışladı ve ölü hücreler daha sonra dışlandı. İkinci kapı, miyelin bazik proteini için pozitif hücreleri dışladı. Ve kalan hücrelerden, her florokrom için pozitif hücrelerin yoğunluk grafikleri oluşturuldu.Her nöronal hücre popülasyonunun sıklığı üçüncü kapıdan hesaplandı. Manuel mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim ile işlenen örnekler, ilgilenilen hücrelerin önemli ölçüde daha düşük bir popülasyonunu verirken, otomatik mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim ile işlenen hem taze hem de sabit örnekler, ilgilenilen hücrelerin birkaç kat daha yüksek bir popülasyonunu göstermiştir. Perfüzyon ve enkaz kaldırma adımları başlangıçta zor olsa da, pürüzsüz ve sabit bir elin korunması başarının sağlanmasına yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42</subHipokampal Dilimleri Sinaptik Plastisite değer düşüklüğü> İndüksiyon

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Nörobilim

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Immünopresipitasyon ve Açil-Biotin Borsası (ABE) tarafından Yetiştirilmiş Hipokampal Nöronlar Protein Palmitoylation tespiti

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

Atomik Kuvvet Mikroskobu, Darbe girinti ve reometre kullanarak Beyin Doku Ölçekli Mekanik Özellikleri karakterize

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...