Name: indel detection following crispr/cas9 mutagenesis using high-resolution melt analysis in the mosquito aedes aegypti
Uploaded: 2021-09-10T14:45:00
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Tutte le figure sono state create con Biorender.com sotto licenza alla Texas A & M University. Questo lavoro è stato supportato da fondi del National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 e AI115138 a Z.N.A.), Texas A & M AgriLife Research nell'ambito del programma Insect Vectored Disease Grant e USDA National Institute of Food and Agriculture, progetto Hatch 1018401.

1. Scansione per polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), progettazione di primer HRMA e convalida del primer
<ol><li>Identificazione SNP nelle zanzare selvatiche delle colonie di laboratorio<ol><li>Selezionare l'esone bersaglio per interrompere la corretta traduzione polipeptidica. NOTA: il bersaglio deve essere vicino al codone iniziale o tra i residui chiave necessari per la funzione proteica. Più corto è l'esone (ad esempio, ≤200 basi), più difficile è il target e l'analisi. Evita di modificare vicino ai c...

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+Guidelines+for+diagnosis,+treatment,+prevention+and+control.">Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control.</a> WHO. , 160 (2009).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+epidemiology+update.">Zika epidemiology update.</a> WHO. , 1-13 (2019).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+prevention+and+control+of+Chikungunya+fever.">Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever.</a> WHO. , (2009).</li><li>World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791">https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791</a> (2020)</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease.">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li><li>Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+resolvases+T4+endonuclease+VII+and+T7+endonuclease+I+in+mutation+detection.">The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection.</a> Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).</li><li>Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melting+applications+for+clinical+laboratory+medicine.">High resolution melting applications for clinical laboratory medicine.</a> Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).</li><li>Reed, G. H., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+specificity+of+single-nucleotide+polymorphism+scanning+by+high-resolution+melting+analysis.">Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis.</a> Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).</li><li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants.">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li><li>Tong, S. Y., Giffard, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+applications+of+high-resolution+melting+analysis.">Microbiological applications of high-resolution melting analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).</li><li>Simko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+melting+analysis+in+plant+research.">High-resolution DNA melting analysis in plant research.</a> Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN/CRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti.">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li><li>O'Leary, S., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+knockout+of+female-biased+genes+AeAct-4+or+myo-fem+in+Ae.+aegypti+results+in+a+flightless+phenotype+in+female,+but+not+male+mosquitoes.">CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).</li><li>Kojin, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+SGS1+is+critical+for+Plasmodium+gallinaceum+infection+of+both+the+mosquito+midgut+and+salivary+glands.">Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands.</a> Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Larkin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustal+W+and+Clustal+X+version+2.0.">Clustal W and Clustal X version 2.0.</a> Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).</li><li>Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Coffee:+A+novel+method+for+fast+and+accurate+multiple+sequence+alignment.">T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment.</a> Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).</li><li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction.">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li><li>Hill, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+peak+parser:+Method+and+software+for+identification+of+unknown+indels+using+sanger+sequencing+of+polymerase+chain+reaction+products.">Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).</li><li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+candidate+iron+transporters+from+the+ZIP/ZnT+gene+families+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).</li><li>Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melting+(HRM)+for+high-throughput+genotyping-limitations+and+caveats+in+practical+case+studies.">High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).</li><li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases.">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), 407-415 (2015).</li></ol>

L'analisi del fuso ad alta risoluzione offre una soluzione semplice e veloce per l'identificazione di indels generati dalla tecnologia CRISPR/Cas9 nella zanzara vettore Ae. aegypti. Fornisce flessibilità, consentendo la genotipizzazione delle zanzare mutate per una vasta gamma di geni dal muscolo di volo al metabolismo del ferro e altro ancora13,14. L'HRMA può essere eseguito in poche ore dalla raccolta dei campioni alle analisi finali. È necessario u...

Come vettori di agenti patogeni come i virus dengue1, Zika2 e chikungunya3, nonché i parassiti malarici4, le zanzare rappresentano una significativa minaccia per la salute pubblica umana. Per tutte queste malattie, c'è un focus sostanziale dell'intervento di trasmissione sul controllo dei vettori di zanzare. Lo studio dei geni importanti, ad esempio, per il permissivismo nei confronti degli agenti patogeni, la forma fisica delle zanzare, la sopravvivenza, la riproduzione e la resistenza agli insetticidi è fondamentale per lo sviluppo di nuove strategie di controllo delle zanzare. Per tali scopi, l'editing del genoma nelle zanzare sta diventando una pratica comune, specialmente con lo sviluppo di tecnologie come HEs, ZFN, TALEN e, più recentemente, CRISPR con Cas9. La creazione di ceppi geneticamente modificati comporta tipicamente il backcrossing di individui portatori delle mutazioni desiderate per alcune generazioni per ridurre al minimo gli effetti off-target e founder (collo di bottiglia), seguiti dall'incrocio di individui eterozigoti per generare linee omozigoti o trans-eterozigoti. In assenza di un marcatore dominante, la genotipizzazione molecolare è necessaria in questo processo perché, in molti casi, non è possibile rilevare tratti fenotipici chiari per i mutanti eterozigoti.
Sebbene il sequenziamento sia il gold standard per la caratterizzazione genotipica, l'esecuzione di questo su centinaia, o forse migliaia di individui, pone costi significativi, manodopera e tempo necessari per ottenere risultati, il che è particolarmente critico per gli organismi con una vita breve come le zanzare. Le alternative comunemente utilizzate sono surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 e analisi della fusione ad alta risoluzione (HRMA, recensito in7). Sia SNA che T7E1 utilizzano endonucleasi che scindere solo basi non corrispondenti. Quando una regione mutata del genoma mutante eterozigote viene amplificata, i frammenti di DNA di alleli mutanti e wild-type vengono ricotti per produrre DNA a doppio filamento (dsDNA) non corrispondente. SNA rileva la presenza di disallineamenti attraverso la digestione con un'endonucleasi specifica per la mancata corrispondenza e una semplice elettroforesi su gel di agarosio. In alternativa, HRMA utilizza le proprietà termodinamiche del dsDNA rilevate dai coloranti fluorescenti leganti il dsDNA, con la temperatura di dissociazione del colorante che varia in base alla presenza e al tipo di mutazione. HRMA è stato utilizzato per il rilevamento di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP)8, genotipizzazione mutante di pesci zebra9, applicazioni microbiologiche10 e ricerca genetica vegetale11, tra gli altri.
Questo articolo descrive l'HRMA, un semplice metodo di genotipizzazione molecolare per le zanzare mutanti generato dalla tecnologia CRISPR/Cas9. I vantaggi dell'HRMA rispetto alle tecniche alternative includono 1) flessibilità, in quanto si è dimostrato utile per vari geni, una vasta gamma di dimensioni indel, nonché la distinzione tra diverse dimensioni indel e differenziazione eterozigote, omozigote e trans-eterozigote12,13,14, 2) costo, in quanto si basa su reagenti PCR comunemente usati e 3) risparmio di tempo, in quanto può essere eseguito in poche ore. Inoltre, il protocollo utilizza una piccola parte del corpo (una gamba) come fonte di DNA, consentendo alla zanzara di sopravvivere al processo di genotipizzazione, consentendo la creazione e il mantenimento di linee mutanti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70% ethanol solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR and Real-time PCR plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td>For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate templates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>House-made printed, for genotype recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Rad CFX96</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td>PCR machine with gradient and HRMA capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversified Biotech reagent reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490006-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E1050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-246</td>
			<td>150 mm x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>HSP9665</td>
			<td>For HRMA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipettor (P10)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipettor (P300)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>37000-548</td>
			<td>To use with the 96-well&#160; PCR plates for obtaining genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical sealing tape</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>2239444</td>
			<td>To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F140WH</td>
			<td>For obtaining genomic DNA and performing PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Fly Vial Dividers</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>59-128W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Melt Analysis Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1845025</td>
			<td>Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeqMan Pro</td>
			<td>DNAstar Lasergene software</td>
			<td></td>
			<td>For multiple sequence alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-channel pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Dumont #5 11 cm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White foam plugs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60882-189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Drosophila Vials, Polystyrene</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>32-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Fly Vial Tray, Blue</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>59-164B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

indel detection following crispr/cas9 mutagenesis using high-resolution melt analysis in the mosquito aedes aegypti

L'editing genetico delle zanzare è diventato di routine in diversi laboratori con la creazione di sistemi come le nucleasi effettori simili a stimolatori di trascrizione (TALEN), le nucleasi a dita di zinco (ZFN) e le endonucleasi di homing (HE). Più recentemente, la tecnologia CRISPR (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) aggregolate regolarmente intervallate ha offerto un'alternativa più semplice ed economica per l'ingegneria del genoma di precisione. Seguendo l'azione della nucleasi, i percorsi di riparazione del DNA risolveranno le estremità del DNA rotte, spesso introducendo indel. Queste mutazioni fuori dal quadro vengono quindi utilizzate per comprendere la funzione genica negli organismi bersaglio. Uno svantaggio, tuttavia, è che gli individui mutanti non portano marcatori dominanti, rendendo difficile l'identificazione e il tracciamento degli alleli mutanti, specialmente alle scale necessarie per molti esperimenti. 
L'analisi della fusione ad alta risoluzione (HRMA) è un metodo semplice per identificare le variazioni nelle sequenze di acidi nucleici e utilizza le curve di fusione pcr per rilevare tali variazioni. Questo metodo di analisi post-PCR utilizza coloranti fluorescenti a doppio filamento che legano il DNA con strumentazione che ha capacità di acquisizione dei dati di controllo della rampa di temperatura ed è facilmente scalabile a formati di piastre a 96 pozzetti. Qui è descritto un semplice flusso di lavoro che utilizza HRMA per il rilevamento rapido di indel indotti da CRISPR / Cas9 e la creazione di linee mutanti nella zanzara Ae. aegypti. Criticamente, tutti i passaggi possono essere eseguiti con una piccola quantità di tessuto delle gambe e non richiedono il sacrificio dell'organismo, consentendo l'esecuzione di incroci genetici o saggi di fenotipizzazione dopo la genotipizzazione.

Le zanzare contenenti mutazioni nei geni AaeZIP11 (presunto trasportatore di ferro21) e myo-fem (un gene della miosina polarizzato femminile correlato ai muscoli di volo13) sono state ottenute utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9, genotipizzate utilizzando HRMA e verificate in sequenza (Figura 5). La Figura 5A e la Figura 5C mostrano l'intensità di fluorescenza norm...

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Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per la rapida identificazione degli indel indotti da CRISPR / Cas9 e la selezione delle linee mutanti nella zanzara Aedes aegypti utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione.

Rilevamento Indel a seguito della mutagenesi CRISPR/Cas9 mediante analisi della fusione ad alta risoluzione nell'aegittito di Mosquito Aedes

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases ...

Questo protocollo è un modo molto semplice ed efficiente per rilevare i mutanti generati dalla tecnologia CRISPR / Cas9 da numerosi individui. I due principali vantaggi di questa tecnica sono che può essere fatto in poche ore e che è applicabile a una moltitudine di organismi. La progettazione del primer può essere impegnativa per alcuni geni e possono essere necessari più cicli di progettazione e verifica del primer per rendere efficiente l'HRMA.Per eseguire una PCR sfumata, iniziare preparando un mix master. Quindi rimuovere 19 microlitri del mix master per il controllo non modello o NTC in una piastra a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere il modello al mix master rimanente.Aliquot 20 microlitri della miscela campione nella piastra a 96 pozzetti. Eseguire la PCR seguendo i parametri ciclici e quindi generare i profili di fusione termica utilizzando i parametri menzionati nel manoscritto. Dopo aver raccolto tutto il materiale richiesto, preparare una miscela principale con 0,5 microlitri del reagente di rilascio del DNA e 20 microlitri di tampone di diluizione per individuo da genotipizzare.Utilizzando un pipetto multicanale, aliquota 20 microlitri della miscela in una piastra PCR e lasciare la piastra PCR sul ghiaccio. Quindi, posizionare le zanzare G1 anestetizzate in una capsula di Petri di vetro per tenerle sedate e posizionare otto zanzare selvatiche nella seconda capsula di Petri. Pulire un paio di pinzette con etanolo al 70% e utilizzare le pinzette disinfettate per rimuovere una delle zampe posteriori delle zanzare.Quindi, immergere la gamba nella soluzione di reagente di rilascio del DNA. Posizionare la zanzara nella fiala corrispondente e chiudere la fiala con una spugna. Una volta fatto, pulire le pinzette con etanolo al 70% prima di procedere con la rimozione della gamba dalla zanzara successiva fino a quando la piastra a 96 pozzetti non è completata.Successivamente, sigillare la piastra con un sigillo ottico della piastra PCR e incubare la piastra PCR contenente le gambe a temperatura ambiente per due-cinque minuti, seguita dall'incubazione a 98 gradi Celsius per due minuti. Lasciare raffreddare la piastra a temperatura ambiente. Per la PCR, preparare una miscela master contenente i componenti preferiti e quindi utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 19 microlitri della miscela master in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.Dopo aver trasferito un microlitro della soluzione di rilascio del DNA contenente DNA di zanzara precedentemente preparato sulla piastra, sigillare la piastra con un sigillo ottico della piastra PCR. Eseguire la PCR con gli opportuni parametri ciclici per generare profili termici di fusione seguendo i parametri descritti nel manoscritto, quindi esaminare i profili di fusione assegnando il controllo wild-type al cluster di riferimento. Contrassegnare i diversi cluster con i colori corrispondenti sul modello a 96 pozzetti.Quindi, selezionare gli individui con curve di interesse e rimuovere gli individui selezionati dai tubi da incrociare. Il sangue nutre le femmine fatte, seguito dalla raccolta di G2A. Nell'analisi rappresentativa, viene mostrata l'analisi di sequenza del mutante ZIP11 di Aedes aegypti.L'elettroferogramma di mutanti eterozigoti Aedes aegypti ZIP11 ha indicato la posizione nucleotidica in cui si è verificato l'indel. L'indel è rappresentato da uno spostamento da picchi singoli a doppi poiché le posizioni polimorfiche mostrano entrambi i nucleotidi contemporaneamente. Al termine dell'esecuzione, il numero di coppie di basi eliminate o inserite è stato calcolato contando i singoli picchi.Le zanzare contenenti mutazioni nei geni Aedes aegypti ZIP11 e myo-fem sono state genotipizzate e sequenziate verificate utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione di HRMA. I segnali fluorescenti dei campioni sono stati normalizzati a valori relativi da uno a zero. Inoltre, ogni curva è stata sottratta dal riferimento wild-type e ha indicato l'ingrandimento corrispondente.Un'assegnazione automatica del cluster non riuscita viene mostrata nei risultati rappresentativi, in cui non è stata fatta una distinzione adeguata tra i gruppi. Inoltre, ogni campione è stato analizzato individualmente e assegnato ai gruppi corretti in base alla somiglianza con campioni di riferimento di eterozigoti, omozigoti e transeterozigoti. Dopo aver eseguito gli HRMA, è necessario sequenziare il DNA dagli individui mutati per analizzare gli indel e identificare le altre mutazioni nella sequenza mirata.

Research

JoVE Journal

Genetics

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Ricerca

Genetica

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Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

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Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Presentazione di un Gene Knockout direttamente nello stadio Amastigote di Trypanosoma cruzi Utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Indagine sul ruolo trascrizionale di un silenziatore intronico RUNX1 di CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein acuta

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...