Name: indel detection following crispr/cas9 mutagenesis using high-resolution melt analysis in the mosquito aedes aegypti
Uploaded: 2021-09-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti at JoVE.com

Todos os números foram criados com Biorender.com sob licença para a Texas A&M University. Este trabalho foi apoiado por fundos do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (AI137112 e AI115138 a Z.N.A.), Texas A&M AgriLife Research sob o Insect Vectored Disease Grant Program, e o UsDA National Institute of Food and Agriculture, projeto Hatch 1018401.

1. Digitalização para polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs), projeto de primer HRMA e validação do primer
<ol><li>Identificação do SNP em mosquitos de colônia de laboratório silvestre<ol><li>Selecione o exon de destino para interromper a tradução adequada do polipeptídeo. NOTA: O alvo deve estar próximo do códon inicial ou entre os principais resíduos necessários para a função proteica. Quanto menor o exon (por exemplo, ≤200 bases), mais difícil é mirar e analisar. Evite editar perto dos...

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+Guidelines+for+diagnosis,+treatment,+prevention+and+control.">Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control.</a> WHO. , 160 (2009).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+epidemiology+update.">Zika epidemiology update.</a> WHO. , 1-13 (2019).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+prevention+and+control+of+Chikungunya+fever.">Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever.</a> WHO. , (2009).</li><li>World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+applications+of+high-resolution+melting+analysis.">Microbiological applications of high-resolution melting analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).</li><li>Simko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+melting+analysis+in+plant+research.">High-resolution DNA melting analysis in plant research.</a> Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN/CRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti.">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li><li>O'Leary, S., Adelman, Z. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+SGS1+is+critical+for+Plasmodium+gallinaceum+infection+of+both+the+mosquito+midgut+and+salivary+glands.">Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands.</a> Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Larkin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustal+W+and+Clustal+X+version+2.0.">Clustal W and Clustal X version 2.0.</a> Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).</li><li>Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Coffee:+A+novel+method+for+fast+and+accurate+multiple+sequence+alignment.">T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment.</a> Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).</li><li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction.">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li><li>Hill, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+peak+parser:+Method+and+software+for+identification+of+unknown+indels+using+sanger+sequencing+of+polymerase+chain+reaction+products.">Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).</li><li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+candidate+iron+transporters+from+the+ZIP/ZnT+gene+families+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).</li><li>Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melting+(HRM)+for+high-throughput+genotyping-limitations+and+caveats+in+practical+case+studies.">High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).</li><li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases.">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), 407-415 (2015).</li></ol>

A análise de derretimento de alta resolução oferece uma solução simples e rápida para a identificação de indels gerados pela tecnologia CRISPR/Cas9 no mosquito vetor Ae. aegypti. Ele fornece flexibilidade, permitindo a genotipagem de mosquitos mutados para uma ampla gama de genes, desde o músculo de voo até o metabolismo do ferro e mais 13,14. O HRMA pode ser realizado em apenas algumas horas, desde a coleta de amostras até as análises finais...

Como vetores de patógenos como os vírus da dengue1, zika2 e chikungunya3, bem como parasitas maláricos4, os mosquitos representam uma ameaça significativa à saúde pública para os seres humanos. Para todas essas doenças, há um foco substancial de intervenção de transmissão no controle de mosquitos vetores. O estudo dos genes importantes, por exemplo, na permissividade aos patógenos, na aptidão dos mosquitos, na sobrevivência, na reprodução e na resistência aos inseticidas é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias de controle de mosquitos. Para tais efeitos, a edição de genomas em mosquitos está se tornando uma prática comum, especialmente com o desenvolvimento de tecnologias como HEs, ZFNs, TALENs e, mais recentemente, CRISPR com Cas9. O estabelecimento de cepas editadas por genes normalmente envolve o backcrossing de indivíduos que carregam as mutações desejadas por algumas gerações para minimizar efeitos fora do alvo e fundador (gargalo), seguido pela travessia de indivíduos heterozigosos para gerar linhas homozigosas ou trans-heterozigosas. Na ausência de um marcador dominante, a genotipagem molecular é necessária nesse processo porque, em muitos casos, não podem ser detectados traços fenotípicos claros para mutantes heterozigosos.
Embora o sequenciamento seja o padrão-ouro para a caracterização genotipípica, realizar isso em centenas, ou possivelmente milhares de indivíduos, representa custos significativos, mão-de-obra e tempo necessários para obter resultados, o que é especialmente crítico para organismos com vida útil curta, como mosquitos. Alternativas comumente utilizadas são Surveyor nuclease assay5 (SNA), ensaio T7E1 e análise de derretimento de alta resolução (HRMA, revisado in7). Tanto o SNA quanto o T7E1 usam endonucleases que apenas se descompatem bases incompatíveis. Quando uma região mutante mutante mutada do genoma mutante heterozigoso é amplificada, fragmentos de DNA de alelos mutantes e do tipo selvagem são enais para fazer DNA de dupla cadeia incompatível (dsDNA). A SNA detecta a presença de incompatibilidades via digestão com uma endonuclease específica de incompatibilidade e eletroforese de gel de agarose simples. Alternativamente, o HRMA utiliza as propriedades termodinâmicas do dsDNA detectadas por corantes fluorescentes de ligação dsDNA, com a temperatura de dissociação do corante variando com base na presença e tipo de mutação. O HRMA tem sido utilizado para a detecção de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs)8, genotipagem mutante de peixe-zebra9, aplicações microbiológicas10 e pesquisa genética vegetal11, entre outros.
Este artigo descreve o HRMA, um método simples de genotipagem molecular para mosquitos mutantes gerado pela tecnologia CRISPR/Cas9. As vantagens do HRMA sobre técnicas alternativas incluem 1) flexibilidade, pois tem sido comprovadamente útil para vários genes, uma ampla gama de tamanhos indel, bem como a distinção entre diferentes tamanhos indel e heterozigous, homozygous e trans-heterozygous diferenciação12,13,14, 2) custo, pois é baseado em reagentes PCR comumente usados, e 3) economia de tempo, como pode ser realizado em apenas algumas horas. Além disso, o protocolo utiliza uma pequena parte do corpo (uma perna) como fonte de DNA, permitindo que o mosquito sobreviva ao processo de genotipagem, permitindo o estabelecimento e manutenção de linhas mutantes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70% ethanol solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR and Real-time PCR plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82006-636</td>
			<td>For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate templates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>House-made printed, for genotype recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Rad CFX96</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td>PCR machine with gradient and HRMA capabilities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diversified Biotech reagent reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490006-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E1050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-246</td>
			<td>150 mm x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>HSP9665</td>
			<td>For HRMA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipettor (P10)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipettor (P300)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>37000-548</td>
			<td>To use with the 96-well&#160; PCR plates for obtaining genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical sealing tape</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>2239444</td>
			<td>To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F140WH</td>
			<td>For obtaining genomic DNA and performing PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Fly Vial Dividers</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>59-128W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Melt Analysis Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1845025</td>
			<td>Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeqMan Pro</td>
			<td>DNAstar Lasergene software</td>
			<td></td>
			<td>For multiple sequence alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-channel pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Dumont #5 11 cm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White foam plugs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60882-189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Drosophila Vials, Polystyrene</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>32-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Fly Vial Tray, Blue</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>59-164B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

indel detection following crispr/cas9 mutagenesis using high-resolution melt analysis in the mosquito aedes aegypti

A edição de genes de mosquitos tornou-se rotina em vários laboratórios com o estabelecimento de sistemas como nucleases efeitos (TALENs) de ativação de transcrição, núcleos de dedo de zinco (ZFNs) e endonucleases (HEs). Mais recentemente, a tecnologia de repetições palindômicas curtas interespaçadas regularmente (CRISPR)/CRISPR(Cas9) ofereceu uma alternativa mais fácil e barata para a engenharia de genomas de precisão. Após a ação nuclease, as vias de reparação de DNA consertarão as extremidades de DNA quebradas, muitas vezes introduzindo indels. Essas mutações fora do quadro são então usadas para entender a função genética nos organismos alvo. Uma desvantagem, no entanto, é que indivíduos mutantes não carregam nenhum marcador dominante, tornando a identificação e o rastreamento de alelos mutantes desafiadores, especialmente em escalas necessárias para muitos experimentos. 
A análise de derretimento de alta resolução (HRMA) é um método simples para identificar variações nas sequências de ácido nucleico e utiliza curvas de fusão pcr para detectar tais variações. Este método de análise pós-PCR usa corantes fluorescentes de ligação de DNA de dupla fita com instrumentação que tem capacidade de captura de dados de controle de rampa de temperatura e é facilmente dimensionado para formatos de placas de 96 poços. Descrito aqui é um simples fluxo de trabalho utilizando o HRMA para a detecção rápida de indeles induzidos pelo CRISPR/Cas9 e o estabelecimento de linhas mutantes no mosquito Ae. aegypti. Criticamente, todas as etapas podem ser realizadas com uma pequena quantidade de tecido da perna e não requerem o sacrifício do organismo, permitindo que cruzes genéticas ou ensaios de fenotipagem sejam realizados após a genotipagem.

Mosquitos contendo mutações nos genes AaeZIP11 (transporte de ferro putativo21) e mio-fem (gene de miosina tendenciosa da fêmea relacionado aos músculos de voo13) foram obtidos utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9, genótipo usando HRMA e sequência verificada (Figura 5). As amostras mutantes Figura 5A e Figura 5C mostram a intensidade de fluorescência normalizada...

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Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

Este artigo detalha um protocolo para identificação rápida de indels induzidos pelo CRISPR/Cas9 e seleção de linhas mutantes no mosquito Aedes aegypti utilizando análise de derretimento de alta resolução.

Detecção indel seguindo CRISPR/Cas9 Mutagenesis usando análise de derretimento de alta resolução no mosquito Aedes aegypti

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases ...

Este protocolo é uma maneira muito simples e eficiente de detectar mutantes gerados pela tecnologia CRISPR/Cas9 de inúmeros indivíduos. As duas principais vantagens dessa técnica são que ela pode ser feita em poucas horas e que é aplicável a uma infinidade de organismos. O design primer pode ser desafiador para certos genes e várias rodadas de design e verificação de primer podem ser necessários para tornar o HRMA eficiente.Para realizar um PCR gradiente, comece preparando uma mistura mestra. Em seguida, remova 19 microliters da mistura mestre para o controle não-modelo ou NTC em uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione o modelo à mistura principal restante.Aliquot 20 microliters da mistura de amostra na placa de 96 poços. Realize o PCR seguindo os parâmetros de ciclismo e, em seguida, gere os perfis de derretimento térmico utilizando os parâmetros mencionados no manuscrito. Depois de reunir todo o material necessário, prepare uma mistura mestre com 0,5 microliters do reagente de liberação de DNA e 20 microliters de tampão de diluição por indivíduo para ser genótipado.Usando um pipet multicanal, aliquot 20 microliters da mistura em uma placa PCR e deixe a placa PCR no gelo. Em seguida, coloque os mosquitos G1 anestesiados em uma placa de vidro petri para mantê-los sedados e coloque oito mosquitos selvagens na segunda placa de Petri. Limpe um par de pinças com 70% de etanol e use a pinça desinfetada para remover uma das pernas traseiras dos mosquitos.Em seguida, submergir a perna na solução de reagente de liberação de DNA. Coloque o mosquito no frasco correspondente e feche o frasco com uma esponja. Uma vez feito, limpe as pinças com 70% de etanol antes de prosseguir com a remoção da perna do próximo mosquito até que a placa de 96 poços seja concluída.Mais tarde, sele a placa com uma vedação óptica de placa PCR e incubar a placa PCR contendo as pernas em temperatura ambiente por dois a cinco minutos, seguida de incubação a 98 graus Celsius por dois minutos. Deixe a placa esfriar até a temperatura ambiente. Para PCR, prepare uma mistura mestre contendo os componentes preferidos e, em seguida, use uma pipeta multicanal para transferir 19 microliters da mistura mestre em cada poço da placa de 96 poços.Depois de transferir um microliter da solução de liberação de DNA contendo DNA de mosquito previamente preparado para a placa, sele a placa com uma vedação óptica de placa PCR. Execute o PCR com os parâmetros de ciclismo apropriados para gerar perfis de derretimento térmico seguindo os parâmetros descritos no manuscrito e, em seguida, examine os perfis de derretimento atribuindo controle do tipo selvagem ao cluster de referência. Marque os diferentes clusters com cores correspondentes no modelo de 96 poços.Em seguida, selecione os indivíduos com curvas de interesse e remova os indivíduos selecionados dos tubos para trás cruzado. O sangue alimenta as fêmeas, seguido pela coleta de G2As. Na análise representativa, mostra-se a análise sequencial do mutante ZIP11 do Aedes aegypti.O eletroferograma do Aedes aegypti ZIP11 mutantes heterozigosos indicou a posição nucleotídea onde ocorreu o indel. O indel é representado por uma mudança de picos únicos para duplos, pois as posições polimórficas mostram ambos os nucleotídeos concomitantemente. Ao final da execução, o número de pares de base excluídos ou inseridos foi calculado contando os picos únicos.Mosquitos contendo mutações nos genes Aedes aegypti ZIP11 e mio-fem foram genótipados e sequenciados verificados através da análise de derretimento de alta resolução do HRMA. Os sinais fluorescentes das amostras foram normalizados a valores relativos de um a zero. Além disso, cada curva foi subtraída da referência do tipo selvagem e denotou a ampliação correspondente.Uma atribuição de cluster automático falhada é mostrada nos resultados representativos, onde uma distinção adequada entre os grupos não foi feita. Além disso, cada amostra foi analisada individualmente e atribuída aos grupos corretos com base na semelhança com amostras de heterozygotes, homozygotes e transheterozygotes. Após a realização das HRMAs, o sequenciamento do DNA dos indivíduos mutantes é necessário para analisar os indels e identificar as outras mutações na sequência alvo.

Research

JoVE Journal

Genetics

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Genética

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigação do papel transcricional de um silenciador intrônico RUNX1 por crispr/Cas9 Ribonucleoproteína em células de leucemia mielóide aguda

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...