Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الكندية للابتكار (CFI 35492)، ومجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا منحة ديسكفري (RGPIN-2017-04407)، وصندوق الحدود الجديدة في البحوث (NFRFE-2018-00969)، ومؤسسة مايكل سميث للبحوث الصحية (SCH-2020-0559)، وصندوق جامعة كولومبيا البريطانية.

1. الوسم Oligonucleotide والتهجين
<ol><li>تخفيض الروابط ثنائي كبريتيد البروتين G<ol>
<li>حل 10 ملغ من البروتين G (ProtG) في 1 مل من المياه فائقة البور. ملاحظة: يتم تعديل البروتين G هنا مع بقايا السيستين واحد في C-terminus وعلامة بولي هيستيدين N-terminus.</li>
		<li>تبادل المخزن المؤقت ≥20 ميكرولتر من ProtG (10 ملغم / مل) ...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

يتيح فحص بصمة الالتصاق تصور أحداث التصاق الجزيئي بين PSGL-1 و P-selectin أثناء التصاق التدحرج الخلوي. يتم بدء هذه العملية عن طريق التقاط P-selectin بوساطة تليها المتداول تحت إجهاد القص السائل. عادة ما تنطوي المشكلات المحتملة أثناء التجربة على مسارات فلورية ضعيفة أو مفقودة حتى عندما تتدحرج الخلايا بشك...

تصف سلسلة التصاق المتداول كيف ترتبط الخلايا المتداولة بحائط الأوعية الدموية ولفه على طوله1. يتم التوسط في المقام الأول المتداول السلبي من قبل selectins ، وهي فئة رئيسية من جزيئات الالتصاق الخلوي (CAMs)1. تحت تدفق القص من الدم، الكريات البيض التعبير عن P-selectin جليكبروتين ليغند-1 (PSGL-1) تشكل روابط عابرة للغاية مع P-selectin، والتي يمكن التعبير عنها على سطح الخلايا البطانية الملتهبة. هذه العملية حاسمة بالنسبة للخلايا البيض للهجرة إلى موقع الالتهاب2. وبالإضافة إلى ذلك، سان جيرمان-1 هو أيضا مستقبلات حساسة ميكانيكية قادرة على تحريك مرحلة الالتصاق الشركة اللاحقة من سلسلة التصاق المتداول عند مشاركتها مع P-selectin3.
الطفرات الوراثية التي تؤثر على وظيفة CAM يمكن أن تؤثر بشدة على الجهاز المناعي، كما هو الحال في المرض النادر لنقص التصاق الكريات البيض (LAD)، حيث يؤدي خلل جزيئات الالتصاق التي تتوسط المتداول إلى الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة الشديد4،5،6. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن الخلايا السرطانية المتداولة تهاجر بعد عملية المتداول مماثلة ، مما يؤدي إلى الانبثاث7،8. ومع ذلك ، لأن المتداول الخلية سريعة وديناميكية ، والأساليب التجريبية التقليدية الميكانيكية غير مناسبة لدراسة التفاعلات الجزيئية أثناء المتداول الخلية. في حين أن أساليب التلاعب أحادية الخلية وجزيء واحد مثل المجهر القوة الذرية وملاقط البصرية كانت قادرة على دراسة التفاعلات الجزيئية مثل التفاعل P-selectin تعتمد على القوة مع PSGL-1 على مستوى جزيء واحد9، فهي غير مناسبة للتحقيق في أحداث الالتصاق الحية أثناء المتداول الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن للتفاعل المميز في المختبر الإجابة مباشرة على السؤال حول الالتصاق الجزيئي في الجسم الحي. على سبيل المثال، ما هو نطاق التوتر الجزيئي ذي الصلة بيولوجيا عندما تعمل الخلايا في بيئتها الأصلية؟ وقد استولت الأساليب الحاسوبية مثل محاكاة ديناميات لاصقة10 أو بسيطة ثابتة الحالة11 بعض التفاصيل الجزيئية وكيف تؤثر على السلوك المتداول ولكن تعتمد اعتمادا كبيرا على دقة المعلمات والافتراضات النمذجة. ويمكن لتقنيات أخرى مثل الفحص المجهري لقوة الجر الكشف عن القوى أثناء هجرة الخلايا ولكنها لا توفر دقة مكانية كافية أو معلومات كمية عن التوتر الجزيئي. لا يمكن لأي من هذه التقنيات أن توفر ملاحظات تجريبية مباشرة للديناميكيات الزمنية والتوزيع المكاني وعدم التجانس في القوى الجزيئية ، والتي ترتبط مباشرة بوظيفة الخلية وسلوكها في بيئتها الأصلية.
لذلك ، فإن تنفيذ مستشعر القوة الجزيئية القادر على قياس التفاعلات بوساطة selectin بدقة أمر بالغ الأهمية لتحسين فهمنا للالتصاق المتداول. هنا، ونحن نصف بروتوكول لacesay12 بصمة الالتصاق حيث يتم تدحرجت الخرز المغلفة PSGL-1 على سطح تقديم ف selectin الحبال قياس التوتر الوظيفية (TGTs)13. هذه TGTs هي أجهزة استشعار قوة تعتمد على الحمض النووي لا رجعة فيها والتي تؤدي إلى تاريخ دائم من أحداث التمزق في شكل قراءات مضان. ويتحقق ذلك من خلال تمزق TGT (dsDNA) ومن ثم وضع العلامات اللاحقة لTGT الممزق (ssDNA) مع حبلا تكميلية وصفت الفلورسنت. إحدى المزايا الرئيسية لهذا النظام هي توافقه مع كل من التصوير محدود الحيود والتصوير فائق الدقة. يمكن ربط الخيط التكميلي المسمى بالفلورسنت إما بشكل دائم (>12 نقطة أساس) للتصوير المحدود الحيود أو ملزم بشكل عابر (7-9 bp) للتصوير فائق الدقة من خلال DNA PAINT. هذا هو نظام مثالي لدراسة التصاق المتداول كما تمزق TGTs أثناء المتداول النشط، ولكن يتم تحليل قراءات مضان بعد المتداول. كما توفر طريقتان للتصوير للمستخدم المزيد من الحرية للتحقيق في التصاق المتداول. عادة، التصوير محدود الحيود مفيد لاستخراج قوة التمزق الجزيئي من خلال كثافة الفلورسينس13، في حين أن التصوير فائق الدقة يسمح بالتحليل الكمي لكثافة المستقبلات. مع القدرة على التحقيق في هذه الخصائص من التصاق المتداول، وهذا النهج يوفر منصة واعدة لفهم آلية تنظيم القوة على الالتصاق الجزيئي للخلايا المتداول تحت تدفق القص.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

التصاق المتداول ، الذي تسهله التفاعلات بوساطة selectin ، هو حركة ديناميكية وسلبية للغاية في تجنيد الكريات البيض إلى موقع الالتهاب. تحدث هذه الظاهرة في عدد الخلايا الجنوية بعد الشعيرات الدموية ، حيث يدفع تدفق الدم الكريات البيض في حركة متجددة على الخلايا البطانية. يتطلب المتداول المستقر توازنا دقيقا بين تكوين رابطة التصاق وانفصالها المدفوع ميكانيكيا ، مما يسمح للخلية بالبقاء ملتصقة بالسطح أثناء الدوران في اتجاه التدفق. وخلافا لعمليات الالتصاق الأخرى التي تحدث في بيئات ثابتة نسبيا، الالتصاق المتداول ديناميكية للغاية كما الخلايا المتداول السفر عبر الآلاف من ميكرون في عشرات ميكرون في الثانية الواحدة. وبالتالي، فإن أساليب علم الأحياء الميكانيكية التقليدية مثل المجهر قوة الجر غير مناسبة لقياس أحداث الالتصاق الفردية والقوى الجزيئية المرتبطة بها بسبب النطاق الزمني القصير والحساسية العالية المطلوبة. هنا، ونحن نصف لدينا أحدث تنفيذ قياس بصمة الالتصاق لتصوير P-selectin: PSGL-1 التفاعلات في التصاق المتداول على المستوى الجزيئي. تستخدم هذه الطريقة الحبال مقياس التوتر المستندة إلى الحمض النووي لا رجعة فيه لإنتاج تاريخ دائم من أحداث الالتصاق الجزيئي في شكل مسارات مضان. يمكن تصوير هذه المسارات بطريقتين: (1) خياطة الآلاف من الصور المحدودة الحيود لإنتاج مجال رؤية كبير ، مما يتيح استخراج بصمة التصاق لكل خلية متجددة على آلاف الميكرونات في الطول ، (2) أداء DNA-PAINT لإعادة بناء صور فائقة الدقة للمسارات الفلورية داخل مجال صغير من الرؤية. في هذه الدراسة، تم استخدام فحص بصمة الالتصاق لدراسة خلايا HL-60 المتداول في ضغوط القص المختلفة. وبذلك، تمكنا من تصوير التوزيع المكاني ل P-selectin: تفاعل PSGL-1 واكتساب نظرة ثاقبة على قواهم الجزيئية من خلال كثافة الفلورسينس. وهكذا، توفر هذه الطريقة الأساس للتحقيق الكمي لمختلف التفاعلات بين الخلايا والسطح المشاركة في التصاق المتداول على المستوى الجزيئي.

يصف البروتوكول أعلاه الإجراء التجريبي لمقايسة بصمة الالتصاق. يوضح سير عمل التجربة العامة في الشكل 1، بدءا من تجميع غرفة التدفق (الشكل 1A) إلى التشغيل السطحي (الشكل 1B) وخطوات التجربة والتصوير (الشكل 1C).
<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

يقدم هذا البروتوكول الإجراءات التجريبية لإجراء فحص بصمة الالتصاق لتصوير أحداث التصاق أثناء التصاق سريع بالخلايا.

التصوير الالتصاق الجزيئي في الخلية المتداول بواسطة Adhesion بصمة المقايسة

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

يساعد هذا البروتوكول على تأسيس الصلة بين القوة الجزيئية وسلوك المتداول الخلوي إلى جانب السماح برسم خريطة مكانية وتحديد التصاق المتداول على المستوى الجزيئي. تسمح هذه التقنية بدراسة أحداث التصاق الفردية أثناء تدحرج الخلية الفعلية مما يسمح لنا بقياس قوة الالتصاق الجزيئي الفسيولوجية ذات الصلة مباشرة. يعد إعداد السطح باستخدام وقت التركيز والحضانة المناسب في كل خطوة أمرا حاسما لتحقيق وظيفية سطحية عالية الجودة.كما أن نوعية الأحكام البيولوجية والظروف المناسبة هي أيضا مسألة حاسمة. تعتبر المظاهرة البصرية حاسمة لمساعدة الباحثين على تكرار هذا البروتوكول. على وجه الخصوص ، فإن خطوات مثل تجميع غرفة التدفق وصور ما بعد المعالجة ستستفيد بشكل كبير من العرض التوضيحي المرئي.تبدأ بنشر رقيقة كمية صغيرة من الايبوكسي على جانبي الشريط على الوجهين مع شفرة حلاقة. باستخدام الليزر، وقطع الشريط المغلفة الايبوكسي لإنشاء أربع قنوات. إنشاء رقاقة تدفق عن طريق شطيرة الشريط الايبوكسي بين شريحة من أربعة حفرة وأغطية PEG.باستخدام طرف ماصة، وتطبيق ضغط لطيف على طول القنوات لخلق ختم جيدة، ثم علاج الايبوكسي لمدة ساعة واحدة على الأقل. قم بمحاذاة الشريحة بحيث يتم وضع فتحة كل قناة في مراكز المحول. ثم ضع اثنين من الفواصل الاكريليك شفافة على رأس رقاقة.تطبيق ضغط ثابت في منتصف كتلة والمسمار في نهايات كل فاصل. المسمار مداخل في الثقوب مترابطة على الجانب الآخر من قوس ورصد حالة الختم من خلال كتلة الاكريليك شفافة. تدفق 200 ميكرولتر من العازلة غسل في الغرفة للتحقق من وجود تسرب.إذا تشكلت الفقاعات في القناة ، فادفع بقوة 200 ميكرولتر إضافي من مخزن الغسيل لإزالة الفقاعات. أضف 40 ميكرولتر من BSA إلى غرفة التدفق لمنع الربط غير المحدد واحتضانه لمدة 10 دقائق في غرفة الرطوبة. بعد الحضانة، أضف 40 ميكرولتر في توين 20 إلى غرفة التدفق واحتضن مرة أخرى لمدة 10 دقائق لزيادة تقليل الربط غير المحدد.ثم غسل القناة مع 200 ميكرولتر من العازلة غسل لإزالة جميع وكلاء يفرز. لسطح الغرفة الوظيفية، إضافة 40 ميكرولتر من ستريبتافيدين إلى غرفة التدفق واحتضان لمدة 20 دقيقة، ثم غسل الغرفة مع 200 ميكرولتر من العازلة غسل. الآن، إضافة 40 ميكرولتر من البروتين الهجين G-TGT إلى غرفة التدفق واحتضان لمدة 20 دقيقة.بعد الغسيل مع عازلة غسل، إضافة 40 ميكرولتر من البروتين G-TGT حبلا أعلى واحتضان لمدة 20 دقيقة لإكمال أي حبلا أسفل TGT غير المخمورة على السطح ومن ثم غسل مع عازلة غسل. وأخيرا، إضافة 40 ميكرولتر من P-selectin-Fc إلى غرفة التدفق واحتضان لمدة 60 دقيقة قبل الغسيل مع عازلة غسل. ملء حقنة زجاجية خمسة ملليلتر مع المخزن المؤقت المتداول والاستفادة من جانبي الحقنة لطرد ودفع الفقاعات لأنها تطفو نحو الطرف.بعد إدخال إبرة معقمة في قطعة 200 ملليمتر من أنابيب البولي إيثيلين، قم بتوصيل الإبرة بحقنة زجاجية. إصلاح المحاقن على مضخة حقنة وإمالة مضخة حقنة بحيث يتم رفع الجانب المكبس لمنع فقاعات الهواء من دخول القناة. أدخل نهاية الأنبوب في مدخل غرفة التدفق.أدخل نهاية قطعة أخرى من أنابيب البولي إيثيلين مقاس 200 ملليمتر في المنفذ واغمر الطرف الآخر في كوب نفايات. خذ من ملليلتر إلى اثنين من عينة تعليق الخلية والطرد المركزي لكريات الخلايا. إزالة المتوسطة وإعادة إنفاق الخلايا بلطف في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المتداول.قطع بعناية الأنابيب من مداخل ومنفذ وماصة 40 ميكرولتر من تعليق الخلية في غرفة التدفق. إعادة توصيل الأنابيب كما هو موضح سابقا ضمان عدم إدخال فقاعات في قناة التدفق. بدء تجربة المتداول الخلية عن طريق بدء مضخة حقنة بمعدلات التدفق المطلوب.مراقبة المتداول الخلية باستخدام مجهر حقل الظلام مع هدف 10X. بمجرد الانتهاء من التجربة، قم بإزالة الخلايا من القناة عن طريق غرس المخزن المؤقت المتداول بمعدل 100 ملليلتر في الساعة حتى يصبح السطح خاليا من الخلايا. لتصوير المسارات المحلية بواسطة DNA-PAINT، أضف 40 ميكرولتر من حبلا صور DNA-PAINT المعدة في مخزن الحمض النووي PAINT إلى القناة.إجراء مجهرية مضان الانعكاس الداخلي الكلي باستخدام الشروط المذكورة في المخطوطة النصية. ترجمة وتقديم الصور فائقة الدقة. لتصوير المسارات الطويلة عن طريق وضع العلامات الدائمة، أضف حبلا الصور الدائمة واحتضن لمدة 120 ثانية في المخزن المؤقت T50M5.ثم غسل القناة عن طريق غرس 200 ميكرولتر من العازلة غسل. تسجيل صورة مع ليزر الإثارة قبالة للحصول على ضجيج الكاميرا الخلفية. صورة مساحة كبيرة في نمط الشبكة بواسطة المجهر TIRF.برمجة المجهر لمسح أكثر من مساحة 400 من قبل 50 صورة وتقسيم البيانات الخام إلى ملفات TIP الفردية التي تحتوي على كل حد أقصى من 10،000 الصور باستخدام برنامج ImageJ. تسطيح جميع الصور باستخدام ملف الإضاءة واستخدام البرنامج المساعد MIST لغرزة الصور. وأظهرت نتيجة توصيف التكيف البيولوجي G ssDNA البروتين واحد تقريبا هو إلى نسبة واحدة من البروتين G إلى ssDNA حيث البروتين G Maleimide ssDNA وimidazole الأطياف العازلة الغذال من الأساس المتعامد لتركيبها مع طيف المنتج التعديل البيولوجي.تم استخدام الصفحة الأصلية لتأكيد التعديل البيولوجي الذي يظهر النطاقات الخضراء الزاهية التي تتزامن مع نطاق البروتين G أحادية الألوان التي تشير إلى اقتران ناجح وغلة جيدة. ملف الإضاءة TIRF المقدمة من الألياف وضع واحد هو عموما أكثر إشراقا في منتصف مجال الرؤية وخفت حول حواف. للتعويض عن الإضاءة غير المستوية وتسوية الصور للتحليل الكمي ، تم تحديد ملف الإضاءة بمتوسط آلاف الإطارات الفردية.تم إنتاج الصور المسطحة عن طريق طرح ضوضاء الكاميرا من كل من ملفات تعريف الخام والإضاءة ومن ثم تطبيعها من قبل ملف الإضاءة. وأظهرت الخياطة الخام أنماط دورية واضحة مطابقة للصور غير المصححة، في حين أن نفس مجال الرؤية مخيط من الصور بالارض أنتجت خلفية مسطحة. تم استخدام ملف تعريف التدفق المنحدر لتحديد نطاق إجهاد القص مما أدى إلى المتداول الخلوي والمسارات الفلورية العائدة التي يمكن بموجبها رؤية بصمة التصاق نموذجية أحادية الخلية.تظهر النتائج دون المستوى الأمثل والأمثل للمسارات الفلورية مع تباين غير كاف وكثافة المسار المفرطة وكثافة المسار المثلى والتباين والتصوير المحدود للحمود النووي PAINT. وقت الحضانة من أكثر من 60 دقيقة ضمان التشغيل السطحي والبناء السليم غرفة يمنع مرور الفقاعات التي تضر سطح وظيفية. ينطبق هذا الإجراء على التحليل الكمي للقوة الجزيئية المشاركة في التصاق المتداول ويسمح للباحثين بفهم السلوك المتداول لأنواع الخلايا المختلفة.تسمح هذه التقنية للباحثين باستكشاف أسئلة جديدة تتعلق بأحداث الالتصاق السريع مما يؤدي إلى مزيد من التقدم في أبحاث جزيء واحد وعلم الأحياء الميكانيكية.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

مقايسة للالتصاق وغزو آجار في البيرة س.

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

تشريح المنظم وExplants القطب الحيواني من أجنة القيطم المورق وجمعية خلية الفحص الالتصاق

Title Cell Encapsulation by Droplets

عنوان تغليف الخلية عن طريق الرذاذ

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

والفحص السلوكية لقياس الاستجابة للاسماك الزرد إلى التغيرات في شدة الضوء

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

التصاق وتكدس الصفيحات تحت التدفق باستخدام خلايا تدفق ميكروفلويديك

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

يعيش التصوير الفحص لتقييم أدوار كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; وSphingomyelinase في إصلاح مسام تشكيل الجروح السمية

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

تفعيل الالتهام الذاتي من قبل بممارسة الهوائية في الفئران

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

تحليل الخلايا السطحية التصاق إعادة عرض في الاستجابة للتوتر الميكانيكية باستخدام الخرز المغناطيسي

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...