Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) og University of British Columbia Eminence Fund.

1. Oligonucleotid mærkning og hybridisering
<ol><li>Reduktion af protein G disulfidbindinger<ol>
<li>10 mg protein G (ProtG) opløses i 1 mL ultrapurt vand. BEMÆRK: Protein G her er modificeret med en enkelt cystein rest på C-endestation og en N-terminus poly-histidin tag.</li>
		<li>Bufferudveksling ≥20 μL protG (10 mg/mL) i 1x PBS (pH 7.2) med en P6-kolonne.</li>
		<li>Mål proteinkoncentrationen efter bufferudveksling. BEMÆRK: Typisk koncentration på 7-8 mg/mL.</li>
		<li>Der fremstill...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

Vedhæftning fodaftryk assay muliggør visualisering af molekylær vedhæftning begivenheder mellem PSGL-1 og P-selectin under celle rullende vedhæftning. Denne proces er initieret af P-selectin-medieret optagelse efterfulgt af rullende under fluidisk forskydning stress. Potentielle problemer i løbet af eksperimentet involverer normalt dårlig celle rullende eller manglende fluorescerende spor, selv når cellerne ruller godt. Disse problemer skyldes ofte kvalitetskontrol ved de kritiske trin i protokollen, som angivet ...

Den rullende vedhæftning kaskade beskriver, hvordan cirkulerende celler binde til og rulle langs blodkarvæggen1. Passiv rullende er primært medieret af selectins, en stor klasse af cellulære vedhæftning molekyler (CAMs)1. Under forskydningen af blod danner leukocytter, der udtrykker P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), meget forbigående bindinger med P-selectin, som kan udtrykkes på overfladen af betændte endotelceller. Denne proces er afgørende for leukocytter at migrere til et sted for inflammation2. Derudover er PSGL-1 også en mechanosensitiv receptor, der er i stand til at udløse den efterfølgende faste vedhæftningsfase af den rullende vedhæftningskaskade ved dets engagement med P-selectin3.
Genetiske mutationer, der påvirker CAM-funktionen, kan alvorligt påvirke immunsystemet, såsom i den sjældne sygdom af leukocyt vedhæsionsmangel (LAD), hvor funktionsfejl i vedhæftningsmolekyler, der formidler rullende, fører til alvorligt immunkompromitterede individer4,5,6. Derudover har cirkulerende tumorceller vist sig at migrere efter en lignende rullende proces, hvilket fører til metastaser7,8. Men fordi cellerullende er hurtig og dynamisk, konventionelle eksperimentelle mekanobiologi metoder er uegnede til at studere molekylære interaktioner under celle rullende. Mens enkeltcellede og enkeltmolekyle manipulationsmetoder som atomprøvesprængningsmikroskopi og optisk pincet var i stand til at studere molekylære interaktioner som P-selectins kraftafhængige interaktion med PSGL-1 på enkeltmolekyleniveau9, er de uegnede til at undersøge levende vedhæftning hændelser under cellerullende. Derudover kan interaktionen karakteriseret in vitro ikke direkte besvare spørgsmålet om molekylær vedhæhæftning in vivo. Hvilket molekylært spændingsområde er f.eks. biologisk relevant, når celler fungerer i deres oprindelige miljø? Beregningsmetoder såsom selvklæbende dynamik simulering10 eller simpel steady-state model11 har fanget visse molekylære detaljer, og hvordan de påvirker den rullende adfærd, men er meget afhængige af nøjagtigheden af modellering parametre og antagelser. Andre teknikker såsom trækkraftmikroskopi kan detektere kræfter under cellemigration, men giver ikke tilstrækkelig rumlig opløsning eller kvantitative oplysninger om molekylær spænding. Ingen af disse teknikker kan give direkte eksperimentelle observationer af den tidsmæssige dynamik, rumlige fordeling og størrelse heterogenitet af molekylære kræfter, som direkte vedrører cellefunktion og adfærd i deres oprindelige miljø.
Derfor er implementering af en molekylær kraftsensor, der er i stand til nøjagtigt at måle udvalgteinmedierede interaktioner, afgørende for at forbedre vores forståelse af rullende vedhæftning. Her beskriver vi protokollen for vedhæftning fodaftryk assay12 hvor PSGL-1 belagt perler er rullet på en overflade præsentere p-selectin funktionaliseret spænding gauge tethers (TGTs)13. Disse TGT'er er irreversible DNA-baserede kraftsensorer, der resulterer i en permanent historie med brudhændelser i form af fluorescensudlæsning. Dette opnås gennem brud på TGT (dsDNA) og derefter efterfølgende mærkning af den bristede TGT (ssDNA) med en fluorescerende mærket komplementær streng. En stor fordel ved dette system er dets kompatibilitet med både diffraktionsbeskret og superopløsningsbilleddannelse. Den fluorescerende mærkede komplementære streng kan enten være permanent bundet (>12 bp) for diffraktionsbegrænset billeddannelse eller forbigående bundet (7-9 bp) til billeddannelse i superopløsning gennem DNA PAINT. Dette er et ideelt system til at studere rullende vedhæftning som TGTs er bristet under aktiv rullende, men fluorescens udlæsning er analyseret post-rullende. De to billeddannelsesmetoder giver også brugeren mere frihed til at undersøge rullende vedhæftning. Typisk, diffraktion-begrænset billeddannelse er nyttig til udvinding molekylær brudkraft gennem fluorescens intensitet13, mens super-opløsning billeddannelse giver mulighed for kvantitativ analyse af receptortæthed. Med evnen til at undersøge disse egenskaber ved rullende vedhæftning giver denne tilgang en lovende platform for forståelse af kraftreguleringsmekanismen på den molekylære vedhæftning af rullende celler under forskydningsstrømning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

Rullende vedhæftning, lettet af selectin-medieret interaktioner, er en meget dynamisk, passiv motilitet i at rekruttere leukocytter til stedet for betændelse. Dette fænomen forekommer i postcapillary venules, hvor blodgennemstrømningen skubber leukocytter i en rullende bevægelse på endotelcellerne. Stabil rulning kræver en delikat balance mellem vedhæftningsbindingsdannelse og deres mekanisk drevne dissociation, så cellen kan forblive fastgjort til overfladen, mens den ruller i strømmens retning. I modsætning til andre vedhæftningsprocesser, der forekommer i relativt statiske miljøer, er rullende vedhæftning meget dynamisk, da de rullende celler bevæger sig over tusindvis af mikron med snesevis af mikron i sekundet. Derfor er konventionelle mekanobiologiske metoder såsom trækkraftmikroskopi uegnede til måling af de enkelte vedhæftning og de tilhørende molekylære kræfter på grund af den korte tidshorisont og høj følsomhed, der kræves. Her beskriver vi vores seneste implementering af vedhæftning fodaftryk assay til billede P-selectin: PSGL-1 interaktioner i rullende vedhæftning på molekylært niveau. Denne metode udnytter irreversible DNA-baserede spændingsmåler tøjre til at producere en permanent historie af molekylære vedhæftning begivenheder i form af fluorescens spor. Disse spor kan afbildes på to måder: (1) syning sammen tusindvis af diffraction-begrænsede billeder til at producere et stort synsfelt, der muliggør udvinding af vedhæftning fodaftryk af hver rullende celle over tusindvis af mikron i længden, (2) udfører DNA-PAINT at rekonstruere super-opløsning billeder af fluorescens spor inden for et lille synsfelt. I denne undersøgelse, vedhæftning fodaftryk assay blev brugt til at studere HL-60 celler rullende på forskellige forskydning understreger. Ved at gøre det var vi i stand til at forestille os den rumlige fordeling af P-selectin: PSGL-1 interaktion og få indsigt i deres molekylære kræfter gennem fluorescensintensitet. Denne metode danner således grundlag for den kvantitative undersøgelse af de forskellige celleoverfladeinteraktioner, der er involveret i rullende vedhæftning på molekylært niveau.

Protokollen ovenfor beskriver den eksperimentelle procedure for vedhæftning fodaftryk assay. Den generelle eksperimentarbejdsgang er illustreret i figur 1, fra flowkammersamlingen (figur 1A) til overfladefunktionalisering (figur 1B) og eksperiment- og billedtrin (figur 1C).
Figur 2 er et repræsentativt resultat for ProtG-ssDNA biokonjugationska...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Denne protokol præsenterer de eksperimentelle procedurer til at udføre vedhæftning fodaftryk assay til billede vedhæftning begivenheder under hurtig celle rullende vedhæftning.

Imaging Molekylær vedhæftning i Cell Rolling ved vedhæftning Fodaftryk Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Denne protokol hjælper med at etablere forbindelsen mellem molekylær kraft og cellerullende adfærd udover at gøre det muligt rumligt at kortlægge og kvantificere rullende vedhæftning på molekylært niveau. Denne teknik gør det muligt at studere individuelle vedhæftningshændelser under selve cellerullende, så vi kan måle den fysiologiske relevante molekylære vedhæftningskraft direkte. Overfladeforberedelse ved hjælp af den passende koncentrations- og inkubationstid i hvert trin er afgørende for at opnå overfladefunktionalisering af høj kvalitet.Kvaliteten af biokonjugationer og ordentlige forhold er også afgørende. Visuel demonstration er afgørende for at hjælpe forskere med at replikere denne protokol. Især vil trinene som flowkammersamling og efterbehandlingsbilleder drage stor fordel af en visuel demonstration.Begynd med at sprede en lille mængde epoxy på begge sider af det dobbeltsidede bånd med et barberblad. Ved hjælp af en laser skal du skære det epoxybelagte bånd for at skabe fire kanaler. Opret flow chip ved sandwiching epoxy tape mellem en fire-hullers slide og PEG coverlip.Brug en pipettespids skal du anvende blidt tryk langs kanalernes længde for at skabe en god forsegling og derefter helbrede epoxyen i mindst en time. Juster chippen, så åbningen af hver kanal placeres i midten af kortet. Placer derefter to gennemsigtige akryl spacers oven på chippen.Påfør fast tryk i midten af blokken og skrue i enderne af hver afstandstrækker. Skru indløbene ind i gevindhullerne på den anden side af beslaget, og overvåg tætningsbetingelsen gennem den gennemsigtige akrylblok. Flow 200 mikroliter af vaskebuffer ind i kammeret for at kontrollere for lækage.Hvis der dannes bobler i kanalen, skal du aggressivt skubbe yderligere 200 mikroliter vaskebuffer for at fjerne boblerne. Tilsættes 40 mikroliter BSA til strømningskammeret for at forhindre uspecifik binding og inkubation i 10 minutter i fugtighedskammeret. Efter inkubation tilsættes 40 mikroliter ved Tween 20 til flowkammeret og inkuberes igen i 10 minutter for yderligere at reducere den uspecifikke binding.Vask derefter kanalen med 200 mikroliter vaskebuffer for at fjerne alle passiveringsmidler. For kammeroverfladefunktionalisering tilsættes 40 mikroliter af Streptavidin til flowkammeret og inkuberes i 20 minutter, og vask derefter kammeret med 200 mikroliter vaskebuffer. Nu tilsættes 40 mikroliter af hybridiseret protein G-TGT til flowkammeret og inkuberes i 20 minutter.Efter vask med vaskebuffer tilsættes 40 mikroliter protein G-TGT top streng og inkuberes i 20 minutter for at fuldføre enhver uhybridiseret TGT bundstreng på overfladen og derefter vaskes med vaskebuffer. Endelig tilsættes 40 mikroliter P-selectin-Fc til flowkammeret og inkuberes i 60 minutter før vask med vaskebuffer. Fyld en fem milliliter glassprøjte med den rullende buffer og bank på siderne af sprøjten for at løsne og skubbe boblerne ud, når de flyder mod spidsen.Efter at have indsat en steril nål i et 200 millimeter stykke polyethylenrør, skal du forbinde nålen til glassprøjten. Fastgør sprøjten på sprøjtepumpen, og vip sprøjtepumpen, så stemplet er hævet for at forhindre luftbobler i at komme ind i kanalen. Sæt enden af røret ind i flowkammerets indløb.Indsæt den ene ende af en anden 200 millimeter stykke af polyethylen slange i stikkontakten og nedsænke den anden ende i et affald bæger. Tag en til to milliliter af celleaffjedringsprøven og centrifugen for at pille cellerne. Fjern mediet og forsigtigt genbruge cellerne i 500 mikroliter af den rullende buffer.Afbryd forsigtigt slangen fra indløbene og udløbet og pipetten 40 mikroliter af celleaffjedringen ind i flowkammeret. Tilslut slangen igen som beskrevet tidligere, så boblerne ikke indføres i flowkanalen. Begynd cellerullende eksperiment ved at starte sprøjtepumpen med de ønskede strømningshastigheder.Overhold cellerullende ved hjælp af et mørkt feltmikroskop med et 10X-mål. Når eksperimentet er afsluttet, skal du fjerne cellerne fra kanalen ved at tilføre den rullende buffer med 100 milliliter i timen, indtil overfladen er cellefri. Til billeddannelse af de lokale spor ved DNA-PAINT, tilføje 40 mikroliter af DNA-PAINT imager streng udarbejdet i DNA-PAINT buffer til kanalen.Udfør total intern refleksion fluorescensmikroskopi ved hjælp af de betingelser, der er nævnt i tekstmanuskriptet. Lokalisere og gengive billederne i superopløsningen. For billeddannelse af de lange spor ved permanent mærkning, tilføje den permanente imager streng og inkubere i 120 sekunder i T50M5 buffer.Vask derefter kanalen ved at tilføre 200 mikroliter vaskebuffer. Optag et billede med excitation laser off for at få baggrundskamera støj. Billede et stort område i et gitter mønster af TIRF mikroskopi.Programmer mikroskopet til at scanne over 400 med 50 billeder og opdele de rå data i individuelle TIP-filer, der hver indeholder maksimalt 10.000 billeder ved hjælp af ImageJ-programmet. Flad alle billederne ved hjælp af belysningsprofilen og brug MIST-pluginet til at sy billederne. Resultatet for proteinet G ssDNA biokonjugation karakterisering viste en næsten en er til et forhold mellem protein G til ssDNA hvor proteinet G Maleimide ssDNA og imidazole elution buffer spektre fra det ortogonale grundlag for montering til biokonjugation produkt spektrum.Native PAGE blev brugt til at bekræfte biokonjugationen, der viser de lysegrønne bånd, der falder sammen med det monomeriske protein G-bånd, der indikerer vellykket bøjning og godt udbytte. TIRF belysning profil indført fra en enkelt tilstand fiber er generelt lysere i midten af synsfeltet og lysdæmper rundt om kanterne. For at kompensere for den ujævne belysning og flade billederne til kvantitativ analyse blev belysningsprofilen bestemt af i gennemsnit tusindvis af individuelle rammer.Flade billeder blev produceret ved at trække kameraet støj fra både rå og belysning profiler og derefter normalisere ved belysning profil. Rå syninger viste klare periodiske mønstre svarende til de ikke-korrigerede billeder, mens det samme synsfelt syet fra flade billeder producerede en flad baggrund. En rampe op flow profil blev brugt til at bestemme rækken af forskydning stress resulterer i celle rullende og udbytte fluorescens spor, hvorunder en typisk enkeltcellet vedhæftning fodaftryk kunne ses.Suboptimale og optimale resultater af lysstofrør med utilstrækkelig kontrast, overdreven sportæthed, optimal sportæthed og kontrast samt diffraktion begrænset og DNA-PAINT-billeddannelse vises. inkubationstid på mere end 60 minutter sikrer overfladefunktionalisering og korrekt kammerkonstruktion forhindrer passage af bobler, der beskadiger funktionaliseret overflade. Denne procedure gælder for kvantitativ analyse af molekylær kraft, der er involveret i rullende vedhæftning og giver forskerne mulighed for at forstå den rullende adfærd af de forskellige celletyper.Denne teknik gør det muligt for forskere at udforske nye spørgsmål vedrørende hurtige vedhæftningshændelser, der fører til yderligere fremskridt af enkeltmolekyle og mekanobiologiforskning.

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Title Cell Encapsulation by Droplets

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Lev Imaging Assay for at vurdere de roller Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Og sphingomyelinase i reparation af poredannende Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Aktivering Autophagy ved aerob træning i mus

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analyse Cell Surface Vedhæftning Remodeling i Reaktion på Mekanisk Tension Brug magnetiske perler

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...