Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) en het Eminence Fund van de University of British Columbia.

1. Oligonucleotide labeling en hybridisatie
<ol><li>Vermindering van eiwit G-disulfidebindingen<ol>
<li>Los 10 mg eiwit G (ProtG) op in 1 ml ultrapuur water. OPMERKING: Het eiwit G wordt hier gemodificeerd met een enkel cysteïneresidu aan de C-terminus en een N-terminus poly-histidine-tag.</li>
		<li>Bufferuitwisseling ≥20 μL ProtG (10 mg/ml) in 1x PBS (pH 7,2) met een P6-kolom.</li>
		<li>Meet de eiwitconcentratie na bufferuitwisseling. OPMERKING: Typische concentratie van 7-8 mg / ml.</li>
...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

De adhesievoetafdruktest maakt visualisatie mogelijk van de moleculaire adhesiegebeurtenissen tussen PSGL-1 en P-selectine tijdens celrollende adhesie. Dit proces wordt geïnitieerd door P-selectin-gemedieerde opname gevolgd door rollen onder vloeistofschuifspanning. Mogelijke problemen tijdens het experiment hebben meestal betrekking op slecht rollen van cellen of het missen van fluorescerende sporen, zelfs als cellen goed rollen. Deze problemen zijn vaak het gevolg van kwaliteitscontroles bij de kritieke stappen in het...

De rollende adhesiecascade beschrijft hoe circulerende cellen aan de bloedvatwand vastklampen en langs de bloedvatwand rollen1. Passief rollen wordt voornamelijk gemedieerd door selectins, een belangrijke klasse van cellulaire adhesiemoleculen (CAMs)1. Onder de schuifstroom van bloed vormen leukocyten die P-selectine glycoproteïneligand-1 (PSGL-1) tot expressie brengen, zeer voorbijgaande bindingen met P-selectine, die tot expressie kunnen komen op het oppervlak van ontstoken endotheelcellen. Dit proces is van cruciaal belang voor leukocyten om te migreren naar een plaats van ontsteking2. Bovendien is PSGL-1 ook een mechanosensitieve receptor die in staat is om de daaropvolgende stevige adhesiefase van de rollende adhesiecascade te activeren bij zijn betrokkenheid bij P-selectin3.
Genetische mutaties die de CAM-functie beïnvloeden, kunnen het immuunsysteem ernstig beïnvloeden, zoals bij de zeldzame ziekte van leukocytenadhesiedeficiëntie (LAD), waar storing van adhesiemoleculen die het rollen bemiddelen, leidt tot ernstig immuungecompromitteerde individuen4,5,6. Bovendien is aangetoond dat circulerende tumorcellen migreren volgens een vergelijkbaar rollend proces, wat leidt tot metastase7,8. Omdat celrollen echter snel en dynamisch is, zijn conventionele experimentele mechanobiologische methoden niet geschikt voor het bestuderen van moleculaire interacties tijdens het rollen van cellen. Hoewel manipulatiemethoden met één cel en één molecuul, zoals atoomkrachtmicroscopie en optisch pincet, moleculaire interacties zoals de krachtafhankelijke interactie van P-selectine met PSGL-1 op het niveau van één molecuul9 konden bestuderen, zijn ze niet geschikt voor het onderzoeken van live adhesiegebeurtenissen tijdens het rollen van cellen. Bovendien kan de in vitro gekarakteriseerde interactie de vraag over moleculaire adhesie in vivo niet direct beantwoorden. Welk moleculair spanningsbereik is bijvoorbeeld biologisch relevant wanneer cellen in hun oorspronkelijke omgeving functioneren? Computationele methoden zoals lijmdynamicasimulatie10 of eenvoudig steady-state model11 hebben bepaalde moleculaire details vastgelegd en hoe ze het rolgedrag beïnvloeden, maar zijn sterk afhankelijk van de nauwkeurigheid van de modelleringsparameters en aannames. Andere technieken zoals tractiekrachtmicroscopie kunnen krachten detecteren tijdens celmigratie, maar bieden onvoldoende ruimtelijke resolutie of kwantitatieve informatie over moleculaire spanning. Geen van deze technieken kan directe experimentele observaties bieden van de temporele dynamica, ruimtelijke verdeling en magnitude heterogeniteit van moleculaire krachten, die rechtstreeks verband houden met celfunctie en gedrag in hun oorspronkelijke omgeving.
Daarom is het implementeren van een moleculaire krachtsensor die in staat is om selectin-gemedieerde interacties nauwkeurig te meten cruciaal voor het verbeteren van ons begrip van rollende adhesie. Hier beschrijven we het protocol voor de adhesievoetafdruktest12 waarbij PSGL-1 gecoate kralen worden gerold op een oppervlak dat p-selectin gefunctionaliseerde spanningsmeter tethers (TGT's) presenteert13. Deze TGT's zijn onomkeerbare DNA-gebaseerde krachtsensoren die resulteren in een permanente geschiedenis van breukgebeurtenissen in de vorm van fluorescentie-uitlezing. Dit wordt bereikt door het scheuren van de TGT (dsDNA) en vervolgens het labelen van de gescheurde TGT (ssDNA) met een fluorescerend gelabelde complementaire streng. Een groot voordeel van dit systeem is de compatibiliteit met zowel diffractie-beperkte als superresolutie beeldvorming. De fluorescerend gelabelde complementaire streng kan permanent gebonden zijn (>12 bp) voor diffractie-beperkte beeldvorming of tijdelijk gebonden (7-9 bp) voor superresolutie beeldvorming via DNA PAINT. Dit is een ideaal systeem om de rolhechting te bestuderen, omdat de TGT's tijdens actief rollen worden gescheurd, maar de fluorescentie-uitlezing na het rollen wordt geanalyseerd. De twee beeldvormingsmethoden bieden de gebruiker ook meer vrijheid om rolhechting te onderzoeken. Doorgaans is diffractie-beperkte beeldvorming nuttig voor het extraheren van moleculaire breukkracht door fluorescentie-intensiteit13, terwijl superresolutiebeeldvorming kwantitatieve analyse van receptordichtheid mogelijk maakt. Met de mogelijkheid om deze eigenschappen van rolhechting te onderzoeken, biedt deze aanpak een veelbelovend platform voor het begrijpen van het krachtregulatiemechanisme op de moleculaire adhesie van rollende cellen onder schuifstroom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

Rollende adhesie, vergemakkelijkt door selectin-gemedieerde interacties, is een zeer dynamische, passieve beweeglijkheid bij het rekruteren van leukocyten naar de plaats van ontsteking. Dit fenomeen treedt op in postcapillaire venules, waar de bloedstroom leukocyten in een rollende beweging op de endotheelcellen duwt. Stabiel rollen vereist een delicaat evenwicht tussen de vorming van hechtingsbindingen en hun mechanisch aangedreven dissociatie, waardoor de cel aan het oppervlak vast kan blijven zitten tijdens het rollen in de stroomrichting. In tegenstelling tot andere hechtingsprocessen die plaatsvinden in relatief statische omgevingen, is de rolhechting zeer dynamisch omdat de rollende cellen over duizenden micron reizen met tientallen micron per seconde. Bijgevolg zijn conventionele mechanobiologische methoden zoals tractiekrachtmicroscopie ongeschikt voor het meten van de individuele adhesiegebeurtenissen en de bijbehorende moleculaire krachten vanwege de korte tijdschaal en hoge gevoeligheid die vereist is. Hier beschrijven we onze nieuwste implementatie van de adhesievoetafdruktest om de P-selectine in beeld te brengen: PSGL-1-interacties bij rollende adhesie op moleculair niveau. Deze methode maakt gebruik van onomkeerbare DNA-gebaseerde spanningsmeter-tethers om een permanente geschiedenis van moleculaire adhesiegebeurtenissen te produceren in de vorm van fluorescentiesporen. Deze sporen kunnen op twee manieren worden afgebeeld: (1) het samenvoegen van duizenden diffractie-beperkte beelden om een groot gezichtsveld te produceren, waardoor de adhesievoetafdruk van elke rollende cel over duizenden micron lang kan worden geëxtraheerd, (2) DNA-PAINT uitvoeren om superresolutiebeelden van de fluorescentiesporen binnen een klein gezichtsveld te reconstrueren. In deze studie werd de adhesievoetafdruktest gebruikt om HL-60-cellen te bestuderen die rollen bij verschillende schuifspanningen. Daarbij konden we de ruimtelijke verdeling van de P-selectine: PSGL-1 interactie in beeld brengen en inzicht krijgen in hun moleculaire krachten door fluorescentie-intensiteit. Deze methode vormt dus de basis voor het kwantitatieve onderzoek van de verschillende cel-oppervlakte-interacties die betrokken zijn bij de roladhesie op moleculair niveau.

Het bovenstaande protocol beschrijft de experimentele procedure van de adhesievoetafdruktest. De algemene experimentworkflow wordt geïllustreerd in figuur 1, van de assemblage van de stroomkamer (figuur 1A) tot de oppervlaktefunctionalisatie (figuur 1B) en experiment- en beeldvormingsstappen (figuur 1C).
Figuur 2 is een representatief resultaat ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Dit protocol helpt bij het leggen van het verband tussen moleculaire kracht en celrolgedrag, naast het ruimtelijk in kaart brengen en kwantificeren van rollende adhesie op moleculair niveau. Deze techniek maakt het mogelijk om individuele adhesiegebeurtenissen tijdens het eigenlijke celrollen te bestuderen, waardoor we de fysiologisch relevante moleculaire adhesiekracht direct kunnen meten. Oppervlaktevoorbereiding met behulp van de juiste concentratie en incubatietijd in elke stap is cruciaal om hoogwaardige oppervlaktefunctionalisatie te bereiken.De kwaliteit van bioconjugaties en de juiste omstandigheden zijn ook cruciaal. Visuele demonstratie is van cruciaal belang om onderzoekers te helpen dit protocol te repliceren. Met name de stappen zoals flow chamber assembly en nabewerkingsbeelden zullen veel baat hebben bij een visuele demonstratie.Begin met het dun verspreiden van een kleine hoeveelheid epoxy aan beide zijden van de dubbelzijdige tape met een scheermesje. Knip met behulp van een laser de epoxy-gecoate tape om vier kanalen te creëren. Maak de flowchip door de epoxytape tussen een schuif met vier gaten en peg-afdekkingslip te sandwichen.Gebruik een pipetpunt, oefen zachte druk uit over de lengte van de kanalen om een goede afdichting te creëren en laat de epoxy vervolgens minimaal een uur uitharden. Lijn de chip zo uit dat de opening van elk kanaal zich in het midden van de adapter bevindt. Plaats vervolgens twee transparante acryl afstandhouders op de chip.Oefen stevige druk uit in het midden van het blok en schroef aan de uiteinden van elke afstandhouder. Schroef de inlaten in de schroefgaten aan de andere kant van de beugel en controleer de afdichtingsconditie door het transparante acrylblok. Stroom 200 microliter wasbuffer in de kamer om te controleren op lekkage.Als er bubbels in het kanaal ontstaan, duw dan agressief op nog eens 200 microliter wasbuffer om de bubbels te verwijderen. Voeg 40 microliter BSA toe aan de stroomkamer om niet-specifieke binding te voorkomen en incubeer gedurende 10 minuten in de vochtigheidskamer. Voeg na incubatie 40 microliter bij Tween 20 toe aan de stroomkamer en incubeer opnieuw gedurende 10 minuten om de niet-specifieke binding verder te verminderen.Was vervolgens het kanaal met 200 microliter wasbuffer om alle passiveringsmiddelen te verwijderen. Voeg voor de functionalisering van het kameroppervlak 40 microliter Streptavidin toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 20 minuten en was de kamer vervolgens met 200 microliter wasbuffer. Voeg nu 40 microliter gehybridiseerd eiwit G-TGT toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 20 minuten.Voeg na het wassen met de wasbuffer 40 microliter eiwit G-TGT-bovenstreng toe en incubeer gedurende 20 minuten om elke ongehybridiseerde TGT-onderstreng op het oppervlak te voltooien en was vervolgens met wasbuffer. Voeg ten slotte 40 microliter P-selectin-Fc toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 60 minuten voor het wassen met wasbuffer. Vul een glazen spuit van vijf milliliter met de rolbuffer en tik op de zijkanten van de spuit om de bubbels los te maken en naar buiten te duwen terwijl ze naar de punt drijven.Nadat u een steriele naald in een 200 millimeter stuk polyethyleenslang hebt ingebracht, sluit u de naald aan op de glazen spuit. Bevestig de spuit op de spuitpomp en kantel de spuitpomp zodanig dat de zuigerzijde verhoogd is om te voorkomen dat luchtbellen het kanaal binnendringen. Steek het uiteinde van de buis in de inlaat van de stroomkamer.Steek het ene uiteinde van een ander stuk van 200 millimeter van de polyethyleenbuis in de uitlaat en dompel het andere uiteinde onder in een afvalbeker. Neem één tot twee milliliter van het celsuspensiemonster en centrifugeer om de cellen te pelleteren. Verwijder het medium en resuspend de cellen voorzichtig in 500 microliter van de rolbuffer.Koppel de slang voorzichtig los van de inlaten en de uitlaat en pipetteer 40 microliter van de celsuspensie in de stroomkamer. Sluit de slang opnieuw aan zoals eerder beschreven, zodat er geen bubbels in het stroomkanaal worden gebracht. Begin het celrolexperiment door de spuitpomp met de gewenste stroomsnelheden te starten.Observeer het rollen van cellen met behulp van een microscoop met een 10X objectief. Zodra het experiment is voltooid, verwijdert u de cellen uit het kanaal door de rolbuffer met 100 milliliter per uur te injecteren totdat het oppervlak celvrij is. Voor het in beeld brengen van de lokale sporen door DNA-PAINT, voegt u 40 microliter DNA-PAINT-beeldstreng geprepareerd in DNA-PAINT-buffer toe aan het kanaal.Voer totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie uit met behulp van de voorwaarden die in het tekstmanuscript worden vermeld. Lokaliseer en render de afbeeldingen met superresolutie. Voor het in beeld brengen van de lange sporen door permanente labeling, voegt u de permanente imager-streng toe en incubeert u gedurende 120 seconden in de T50M5-buffer.Was vervolgens het kanaal door 200 microliter wasbuffer toe te voegen. Neem een afbeelding op met de excitatielaser uit om achtergrondcameraruis te verkrijgen. Stel een groot gebied in een rasterpatroon voor met TIRF-microscopie.Programmeer de microscoop om over het gebied van 400 bij 50 afbeeldingen te scannen en splits de onbewerkte gegevens in individuele TIP-bestanden met elk maximaal 10.000 afbeeldingen met behulp van het ImageJ-programma. Vlak alle afbeeldingen af met behulp van het verlichtingsprofiel en gebruik de MIST-plug-in om de afbeeldingen te naaien. Het resultaat voor de eiwit G ssDNA bioconjugatiekarakterisering toonde een bijna één-op-één verhouding van eiwit G tot ssDNA waar het eiwit G Maleimide ssDNA en imidazoolelutiespectra van de orthogonale basis bufferen voor aanpassing aan het bioconjugatieproductspectrum.Native PAGE werd gebruikt om de bioconjugatie te bevestigen die de felgroene banden liet zien die samenvallen met de monomere eiwit G-band, wat wijst op succesvolle conjugatie en een goede opbrengst. Het TIRF-verlichtingsprofiel dat wordt geïntroduceerd vanuit een single-mode vezel is over het algemeen helderder in het midden van het gezichtsveld en dimmer rond de randen. Om de ongelijke verlichting te compenseren en de beelden af te vlakken voor kwantitatieve analyse, werd het verlichtingsprofiel bepaald door gemiddeld duizenden individuele frames.Afgevlakte beelden werden geproduceerd door de cameraruis af te trekken van zowel raw- als verlichtingsprofielen en vervolgens te normaliseren door het verlichtingsprofiel. Onbewerkte stiksels toonden duidelijke periodieke patronen die overeenkomen met de ongecorrigeerde afbeeldingen, terwijl hetzelfde gezichtsveld gestikt uit afgeplatte afbeeldingen een vlakke achtergrond produceerde. Een opvoerstroomprofiel werd gebruikt om het bereik van schuifspanning te bepalen, wat resulteerde in celrollen en vloeisporen opbrengen waaronder een typische eencellige adhesievoetafdruk kon worden gezien.Suboptimale en optimale resultaten van fluorescerende sporen met onvoldoende contrast, overmatige spoordichtheid, optimale spoordichtheid en contrast, en diffractie beperkt en DNA-PAINT beeldvorming worden getoond. incubatietijd van meer dan 60 minuten zorgt voor oppervlaktefunctionalisatie en een goede kamerconstructie voorkomt de passage van bellen die het gefunctionaliseerde oppervlak beschadigen. Deze procedure is van toepassing op kwantitatieve analyse van moleculaire kracht die betrokken is bij rollende adhesie en stelt onderzoekers in staat om het rollende gedrag van de verschillende celtypen te begrijpen.Deze techniek stelt onderzoekers in staat om nieuwe vragen te onderzoeken met betrekking tot snelle adhesiegebeurtenissen die leiden tot verdere vooruitgang van onderzoek naar één molecuul en mechanobiologie.

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Test voor Adhesie en Agar invasie in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Ontleding van Organisator en dierlijke Pole Explantaten van Xenopus laevis embryo&#39;s en montage van een Celadhesie Assay

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel Cell Encapsulation door Droplets

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

Een Behavioral Assay aan responsiviteit van zebravis Maatregel om veranderingen in lichtintensiteit

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Bloedplaatjes adhesie en aggregatie Onder Flow met behulp van Microfluïdische Flow Cellen

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cel Vorm wijzigen in Living Drosophila Embryo&#39;s

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Wonen Imaging Assay voor het beoordelen van de Rollen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; En sphingomyelinase in de Reparatie van Pore-vormende Toxine Wonden

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Het activeren van Autofagie door Aerobic Oefening in Muizen

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...