Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), dem New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), der Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) und dem University of British Columbia Eminence Fund unterstützt.

1. Oligonukleotid-Markierung und Hybridisierung
<ol><li>Reduktion von Protein G Disulfidbindungen<ol>
<li>Lösen Sie 10 mg Protein G (ProtG) in 1 ml Reinstwasser auf. HINWEIS: Das Protein G ist hier mit einem einzelnen Cysteinrest am C-Terminus und einem N-Terminus-Polyhistidin-Tag modifiziert.</li>
		<li>Pufferaustausch ≥20 μL ProtG (10 mg/ml) in 1x PBS (pH 7,2) mit einer P6-Säule.</li>
		<li>Messen Sie die Proteinkonzentration nach dem Pufferaustausch. ANMERKUNG: Typische Konzentration von ...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

Der Adhäsions-Footprint-Assay ermöglicht die Visualisierung der molekularen Adhäsionsereignisse zwischen PSGL-1 und P-Selektin während der Zellrollenadhäsion. Dieser Prozess wird durch P-Selektin-vermittelte Erfassung eingeleitet, gefolgt von einem Walzen unter fluidischer Scherspannung. Mögliche Probleme während des Experiments beinhalten in der Regel ein schlechtes Zellrollen oder fehlende fluoreszierende Spuren, selbst wenn die Zellen gut rollen. Diese Probleme resultieren häufig aus Qualitätskontrollen an de...

Die rollende Adhäsionskaskade beschreibt, wie zirkulierende Zellen an die Blutgefäßwand binden und entlang dieser rollen1. Passives Walzen wird hauptsächlich durch Selectine vermittelt, eine Hauptklasse zellulärer Adhäsionsmoleküle (CAMs)1. Unter dem Scherfluss des Blutes bilden Leukozyten, die P-Selektin-Glykoprotein-Ligand-1 (PSGL-1) exprimieren, hochtransiente Bindungen mit P-Selektin, die auf der Oberfläche entzündeter Endothelzellen exprimiert werden können. Dieser Prozess ist entscheidend dafür, dass Leukozyten an einen Ort der Entzündung wandern2. Darüber hinaus ist PSGL-1 auch ein mechanosensitiver Rezeptor, der in der Lage ist, die nachfolgende feste Adhäsionsstufe der rollenden Adhäsionskaskade auszulösen, wenn er mit P-Selektin3 interagiert.
Genetische Mutationen, die die CAM-Funktion beeinflussen, können das Immunsystem stark beeinträchtigen, wie z.B. bei der seltenen Erkrankung des Leukozytenadhäsionsmangels (LAD), bei der eine Fehlfunktion der Adhäsionsmoleküle, die das Rollen vermitteln, zu stark immungeschwächten Personen führt4,5,6. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass zirkulierende Tumorzellen nach einem ähnlichen Rollprozess wandern, was zu Metastasen führt7,8. Da das Zellrollen jedoch schnell und dynamisch ist, sind herkömmliche experimentelle mechanotische Methoden ungeeignet, um molekulare Wechselwirkungen während des Zellrollens zu untersuchen. Während Einzelzell- und Einzelmolekül-Manipulationsmethoden wie Rasterkraftmikroskopie und optische Pinzette molekulare Wechselwirkungen wie die kraftabhängige Wechselwirkung von P-Selectin mit PSGL-1 auf Einzelmolekülebene untersuchen konnten9, sind sie für die Untersuchung von Live-Adhäsionsereignissen während des Zellrollens ungeeignet. Darüber hinaus kann die in vitro charakterisierte Interaktion die Frage nach der molekularen Adhäsion in vivo nicht direkt beantworten. Welcher molekulare Spannungsbereich ist beispielsweise biologisch relevant, wenn Zellen in ihrer natürlichen Umgebung funktionieren? Berechnungsmethoden wie die Klebstoffdynamiksimulation10 oder das einfache stationäre Modell11 haben bestimmte molekulare Details und deren Einfluss auf das Walzverhalten erfasst, sind aber stark von der Genauigkeit der Modellierungsparameter und -annahmen abhängig. Andere Techniken wie die Zugkraftmikroskopie können Kräfte während der Zellmigration erkennen, liefern jedoch keine ausreichende räumliche Auflösung oder quantitative Informationen über die molekulare Spannung. Keine dieser Techniken kann direkte experimentelle Beobachtungen der zeitlichen Dynamik, der räumlichen Verteilung und der Magnitudenheterogenität molekularer Kräfte liefern, die sich direkt auf die Zellfunktion und das Zellverhalten in ihrer nativen Umgebung beziehen.
Daher ist die Implementierung eines molekularen Kraftsensors, der in der Lage ist, selektive Wechselwirkungen genau zu messen, von entscheidender Bedeutung, um unser Verständnis der Walzadhäsion zu verbessern. Hier beschreiben wir das Protokoll für den Adhäsions-Footprint-Assay12, bei dem PSGL-1-beschichtete Kügelchen auf einer Oberfläche gerollt werden, die p-selektin-funktionalisierte Spannungsmessstreifen-Tethers (TGTs)13 präsentiert. Diese TGTs sind irreversible DNA-basierte Kraftsensoren, die zu einer permanenten Historie von Bruchereignissen in Form von Fluoreszenzanzeigen führen. Dies wird durch das Aufbrechen des TGT (dsDNA) und anschließende Markierung des rupturierten TGT (ssDNA) mit einem fluoreszierend markierten Komplementärstrang erreicht. Ein großer Vorteil dieses Systems ist seine Kompatibilität sowohl mit beugungsbegrenzter als auch mit hochauflösender Bildgebung. Der fluoreszenzmarkierte Komplementärstrang kann entweder dauerhaft gebunden (>12 bp) für die beugungsbegrenzte Bildgebung oder vorübergehend gebunden (7-9 bp) für die hochauflösende Bildgebung durch DNA PAINT. Dies ist ein ideales System, um die Walzhaftung zu untersuchen, da die TGTs während des aktiven Walzens gerissen sind, aber die Fluoreszenzanzeige wird nach dem Walzen analysiert. Die beiden bildgebenden Verfahren geben dem Anwender zudem mehr Freiheit, die Rollhaftung zu untersuchen. Typischerweise ist die beugungsbegrenzte Bildgebung nützlich, um die molekulare Bruchkraft durch Fluoreszenzintensität zu extrahieren13, während die hochauflösende Bildgebung eine quantitative Analyse der Rezeptordichte ermöglicht. Mit der Fähigkeit, diese Eigenschaften der Walzadhäsion zu untersuchen, bietet dieser Ansatz eine vielversprechende Plattform für das Verständnis des Kraftregulationsmechanismus auf die molekulare Adhäsion von rollenden Zellen unter Scherfluss.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

Die rollende Adhäsion, die durch selektinvermittelte Wechselwirkungen erleichtert wird, ist eine hochdynamische, passive Motilität bei der Rekrutierung von Leukozyten an der Entzündungsstelle. Dieses Phänomen tritt in postkapillaren Venolen auf, wo der Blutfluss Leukozyten in einer rollenden Bewegung auf die Endothelzellen drückt. Stabiles Walzen erfordert ein empfindliches Gleichgewicht zwischen der Bildung von Adhäsionsbindungen und deren mechanisch angetriebener Dissoziation, so dass die Zelle während des Walzens in Strömungsrichtung an der Oberfläche befestigt bleibt. Im Gegensatz zu anderen Adhäsionsprozessen, die in relativ statischen Umgebungen ablaufen, ist die Rolladhäsion hochdynamisch, da sich die Rollelzellen mit mehreren zehn Mikrometern pro Sekunde über Tausende von Mikrometern bewegen. Konventionelle mechanoologische Methoden wie die Zugkraftmikroskopie sind daher aufgrund der kurzen Zeitskala und der erforderlichen hohen Sensitivität ungeeignet, um die einzelnen Adhäsionsereignisse und die damit verbundenen molekularen Kräfte zu messen. Hier beschreiben wir unsere neueste Implementierung des Adhäsions-Footprint-Assays zur Abbildung des P-Selektins: PSGL-1-Wechselwirkungen in der rollenden Adhäsion auf molekularer Ebene. Diese Methode verwendet irreversible DNA-basierte Spannungsmessstreifenbinder, um eine permanente Historie molekularer Adhäsionsereignisse in Form von Fluoreszenzspuren zu erzeugen. Diese Spuren können auf zwei Arten abgebildet werden: (1) Zusammenfügen von Tausenden von beugungsbegrenzten Bildern, um ein großes Sichtfeld zu erzeugen, das die Extraktion des Adhäsionsfußabdrucks jeder rollenden Zelle über Tausende von Mikrometern Länge ermöglicht, (2) Durchführen von DNA-PAINT, um hochauflösende Bilder der Fluoreszenzspuren in einem kleinen Sichtfeld zu rekonstruieren. In dieser Studie wurde der Adhäsions-Footprint-Assay verwendet, um HL-60-Zellen zu untersuchen, die bei verschiedenen Scherspannungen rollen. Dabei konnten wir die räumliche Verteilung der P-Selektin:PSGL-1-Wechselwirkung abbilden und durch fluoreszenzintensität Einblick in ihre molekularen Kräfte gewinnen. Damit liefert diese Methode die Grundlage für die quantitative Untersuchung der verschiedenen Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen, die an der Rolladhäsion auf molekularer Ebene beteiligt sind.

Das obige Protokoll beschreibt das experimentelle Verfahren des Adhäsion Footprint Assays. Der allgemeine Experimentablauf ist in Abbildung 1 dargestellt, von der Durchflusskammeranordnung (Abbildung 1A) über die Oberflächenfunktionalisierung (Abbildung 1B) bis hin zu den Experiment- und Bildgebungsschritten (Abbildung 1C).
Abbildung 2 ist ein...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Dieses Protokoll stellt die experimentellen Verfahren zur Durchführung des Adhäsions-Footprint-Assays vor, um die Adhäsionsereignisse während der schnellen Zellrollenadhäsion abzubilden.

Abbildung der molekularen Adhäsion im Zellrollen durch Adhäsion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Dieses Protokoll hilft, die Verbindung zwischen molekularer Kraft und Zellrollenverhalten herzustellen und ermöglicht es, die rollende Adhäsion auf molekularer Ebene räumlich abzubilden und zu quantifizieren. Diese Technik ermöglicht es, individuelle Adhäsionsereignisse während des eigentlichen Zellrollens zu untersuchen, so dass wir die physiologisch relevante molekulare Adhäsionskraft direkt messen können. Die Oberflächenvorbereitung mit der entsprechenden Konzentration und Inkubationszeit in jedem Schritt ist entscheidend, um eine qualitativ hochwertige Oberflächenfunktionalisierung zu erreichen.Die Qualität der Biokonjugationen und die richtigen Bedingungen sind ebenfalls entscheidend. Die visuelle Demonstration ist entscheidend, um Forschern zu helfen, dieses Protokoll zu replizieren. Insbesondere die Schritte wie die Montage der Durchflusskammer und die Nachbearbeitung von Bildern werden von einer visuellen Demonstration stark profitieren.Beginnen Sie, indem Sie eine kleine Menge Epoxidharz auf beiden Seiten des doppelseitigen Klebebandes mit einer Rasierklinge dünn verteilen. Schneiden Sie das epoxidbeschichtete Klebeband mit einem Laser ab, um vier Kanäle zu erzeugen. Erstellen Sie den Flow-Chip, indem Sie das Epoxidband zwischen einem Vier-Loch-Schlitten und einem PEG-Deckglas einklemmen.Üben Sie mit einer Pipettenspitze sanften Druck entlang der Länge der Kanäle aus, um eine gute Abdichtung zu erzeugen, und härten Sie das Epoxidharz dann für mindestens eine Stunde aus. Richten Sie den Chip so aus, dass die Öffnung jedes Kanals in der Mitte des Adapters positioniert ist. Platzieren Sie dann zwei transparente Acryl-Abstandhalter auf dem Chip.Üben Sie festen Druck in der Mitte des Blocks aus und schrauben Sie an den Enden jedes Abstandhalters. Schrauben Sie die Einlässe in die Gewindelöcher auf der anderen Seite der Halterung und überwachen Sie den Dichtungszustand durch den transparenten Acrylblock. 200 Mikroliter Waschpuffer in die Kammer strömen, um nach Leckagen zu suchen.Wenn sich Blasen im Kanal bilden, drücken Sie aggressiv weitere 200 Mikroliter Waschpuffer, um die Blasen zu entfernen. Geben Sie 40 Mikroliter BSA in die Durchflusskammer, um eine unspezifische Bindung zu verhindern, und inkubieren Sie für 10 Minuten in der Feuchtigkeitskammer. Nach der Inkubation 40 Mikroliter bei Tween 20 in die Durchflusskammer geben und erneut 10 Minuten inkubieren, um die unspezifische Bindung weiter zu reduzieren.Dann waschen Sie den Kanal mit 200 Mikrolitern Waschpuffer, um alle Passivierungsmittel zu entfernen. Für die Funktionalisierung der Kammeroberfläche fügen Sie 40 Mikroliter Streptavidin in die Durchflusskammer hinzu und inkubieren Sie für 20 Minuten, dann waschen Sie die Kammer mit 200 Mikrolitern Waschpuffer. Geben Sie nun 40 Mikroliter hybridisiertes Protein G-TGT in die Durchflusskammer und inkubieren Sie für 20 Minuten.Nach dem Waschen mit Waschpuffer 40 Mikroliter Protein G-TGT oberer Strang hinzufügen und 20 Minuten inkubieren, um jeden unhybridisierten TGT-Bodenstrang auf der Oberfläche zu vervollständigen, und dann mit Waschpuffer waschen. Zum Schluss 40 Mikroliter P-Selectin-Fc in die Durchflusskammer geben und vor dem Waschen mit Waschpuffer 60 Minuten inkubieren. Füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Glasspritze mit dem Rollpuffer und klopfen Sie auf die Seiten der Spritze, um die Blasen zu lösen und herauszudrücken, während sie in Richtung der Spitze schweben.Nachdem Sie eine sterile Nadel in ein 200 Millimeter großes Stück Polyethylenschlauch eingeführt haben, verbinden Sie die Nadel mit der Glasspritze. Befestigen Sie die Spritze an der Spritzenpumpe und neigen Sie die Spritzenpumpe so, dass die Kolbenseite angehoben ist, um zu verhindern, dass Luftblasen in den Kanal gelangen. Setzen Sie das Ende des Rohrs in den Einlass der Durchflusskammer ein.Setzen Sie ein Ende eines weiteren 200-Millimeter-Stücks des Polyethylenschlauchs in den Auslass ein und tauchen Sie das andere Ende in ein Abfallbecherglas. Nehmen Sie ein bis zwei Milliliter der Zellsuspensionsprobe und zentrifugieren Sie sie, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 500 Mikrolitern des Rollpuffers.Trennen Sie den Schlauch vorsichtig von den Einlässen und dem Auslass und pipettieren Sie 40 Mikroliter der Zellsuspension in die Durchflusskammer. Schließen Sie den Schlauch wie zuvor beschrieben wieder an, um sicherzustellen, dass keine Blasen in den Strömungskanal eingeführt werden. Beginnen Sie das Zellwalzexperiment, indem Sie die Spritzenpumpe mit den gewünschten Durchflussraten starten.Beobachten Sie das Rollen von Zellen mit einem Dunkelfeldmikroskop mit einem 10-fachen Objektiv. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, entfernen Sie die Zellen aus dem Kanal, indem Sie den Rollpuffer mit 100 Millilitern pro Stunde infundieren, bis die Oberfläche zellfrei ist. Um die lokalen Spuren durch DNA-PAINT abzubilden, fügen Sie dem Kanal 40 Mikroliter DNA-PAINT-Imager-Strang hinzu, der im DNA-PAINT-Puffer hergestellt wurde.Führen Sie eine totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung der im Textmanuskript genannten Bedingungen durch. Lokalisieren und rendern Sie die hochauflösenden Bilder. Um die langen Spuren durch permanente Beschriftung abzubilden, fügen Sie den permanenten Imager-Strang hinzu und inkubieren Sie für 120 Sekunden im T50M5-Puffer.Dann waschen Sie den Kanal, indem Sie 200 Mikroliter Waschpuffer infundieren. Nehmen Sie ein Bild mit ausgeschaltetem Anregungslaser auf, um Hintergrundrauschen der Kamera zu erhalten. Stellen Sie eine große Fläche in einem Gittermuster mit TIRF-Mikroskopie dar.Programmieren Sie das Mikroskop so, dass es über die Fläche von 400 mal 50 Bildern scannt, und teilen Sie die Rohdaten mit dem Programm ImageJ in einzelne TIP-Dateien mit jeweils maximal 10.000 Bildern auf. Reduzieren Sie alle Bilder mit dem Beleuchtungsprofil und verwenden Sie das MIST-Plugin, um die Bilder zusammenzusetzen. Das Ergebnis für die Charakterisierung der Protein-G-ssDNA-Biokonjugation zeigte ein Verhältnis von fast eins zu eins von Protein G zu ssDNA, wobei das Protein G Maleimid ssDNA und Imidazol-Elutionspufferspektren aus der orthogonalen Basis für die Anpassung an das Produktspektrum der Biokonjugation vorliegen.Native PAGE wurde verwendet, um die Biokonjugation zu bestätigen, die die hellgrünen Bänder zeigt, die mit dem monomeren Protein G-Band zusammenfallen, was auf eine erfolgreiche Konjugation und einen guten Ertrag hinweist. Das TIRF-Beleuchtungsprofil, das von einer Singlemode-Faser eingeführt wird, ist im Allgemeinen in der Mitte des Sichtfeldes heller und an den Rändern dunkler. Um die ungleichmäßige Ausleuchtung auszugleichen und die Bilder für die quantitative Analyse abzuflachen, wurde das Beleuchtungsprofil durch Mittelung tausender Einzelbilder ermittelt.Abgeflachte Bilder wurden erzeugt, indem das Kamerarauschen sowohl von Roh- als auch von Beleuchtungsprofilen subtrahiert und dann durch das Beleuchtungsprofil normalisiert wurde. Raw Stitching zeigte klare periodische Muster, die den unkorrigierten Bildern entsprachen, während das gleiche Sichtfeld, das aus abgeflachten Bildern zusammengefügt wurde, einen flachen Hintergrund erzeugte. Ein Ramp-up-Strömungsprofil wurde verwendet, um den Bereich der Scherspannung zu bestimmen, was zu Zellwalz- und Fluoreszenzspuren führte, unter denen ein typischer Einzelzell-Adhäsions-Footprint zu sehen war.Suboptimale und optimale Ergebnisse von fluoreszierenden Spuren mit unzureichendem Kontrast, übermäßiger Spurdichte, optimaler Spurdichte und Kontrast sowie Beugungsbegrenzter und DNA-PAINT-Bildgebung werden gezeigt. Eine Inkubationszeit von mehr als 60 Minuten gewährleistet eine Oberflächenfunktionalisierung und eine ordnungsgemäße Kammerkonstruktion verhindert den Durchgang von Blasen, die die funktionalisierte Oberfläche beschädigen. Dieses Verfahren eignet sich für die quantitative Analyse der molekularen Kraft, die an der Walzadhäsion beteiligt ist, und ermöglicht es den Forschern, das Walzverhalten der verschiedenen Zelltypen zu verstehen.Diese Technik ermöglicht es den Forschern, neue Fragen zu schnellen Adhäsionsereignissen zu untersuchen, die zu einer weiteren Weiterentwicklung der Einzelmolekül- und Mechanobiologieforschung führen.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Forschung

Biologie

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel der Verkapselung von Zellen durch Tröpfchen

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Adhäsion und Aggregation unter Fluss mit Mikrofluidik-Flow-Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sphingomyelinase und in der Reparatur von Pore Toxin-bildenden Wunden

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

Die Aktivierung Autophagy von Aerobic-Übung bei Mäusen

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...