Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן קנדה לחדשנות (CFI 35492), המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה של קנדה דיסקברי גרנט (RGPIN-2017-04407), גבולות חדשים בקרן המחקר (NFRFE-2018-00969), קרן מייקל סמית לחקר הבריאות (SCH-2020-0559) וקרן אמיליה הבריטית.

1. תיוג והיברידיה של אוליגונוקלאוטיד
<ol><li>הפחתת קשרים דיסולפידים של חלבון G<ol>
<li>יש להמיס 10 מ"ג חלבון G (ProtG) ב-1 מ"ל של מים אולטרה-תותים. הערה: החלבון G כאן משתנה עם שאריות ציסטאין בודדות בטרמינל C ותג פולי-היסטידין N-טרמינוס.</li>
		<li>חילופי חוצצים ≥20 μL של ProtG (10 מ"ג /מ"ל) לתוך 1x PBS (pH 7.2) עם ע?...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

טביעת הרגל של הידבקות מאפשרת הדמיה של אירועי הידבקות מולקולרית בין PSGL-1 ו- P-selectin במהלך הידבקות מתגלגלת תאים. תהליך זה מופעל על ידי לכידה בתיווך P-selectin ואחריו מתגלגל תחת לחץ גיזום נוזלי. בעיות פוטנציאליות במהלך הניסוי כרוכות בדרך כלל גלגול תאים עניים או חסר מסלולי פלורסנט גם כאשר תאים מתגלגל...

מפל ההדבקה המתגלגל מתאר כיצד תאים במחזור לקשור ולהתגלגל לאורך קיר כלי הדם1. גלגול פסיבי הוא בעיקר בתיווך selectins, מחלקה עיקרית של מולקולות הידבקות הסלולר (CAMs)1. תחת זרם הגיזה של דם, לויקוציטים המבטאים P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1) יוצרים קשרים ארעיים מאוד עם P-selectin, אשר עשוי לבוא לידי ביטוי על פני השטח של תאי אנדותל מודלקים. תהליך זה הוא קריטי עבור לויקוציטים לעבור לאתר של דלקת2. בנוסף, PSGL-1 הוא גם קולטן mechanosensitive מסוגל להפעיל את שלב הידבקות המשרד הבאים של מפל הידבקות מתגלגל על מעורבותו עם P-selectin3.
מוטציות גנטיות המשפיעות על תפקוד CAM יכולות להשפיע קשות על המערכת החיסונית, כגון במחלה הנדירה של מחסור בהידבקות לויקוציטים (LAD), שבה תקלה במולקולות הידבקות המתווכות בגלגול מובילה לאנשים אימונו-מוגעים קשות4,5,6. בנוסף, תאים סרטניים במחזור הוכחו לנדוד בעקבות תהליך גלגול דומה, המוביל גרורות7,8. עם זאת, מכיוון שגלגול תאים הוא מהיר ודינמי, שיטות מכניות ניסיוניות קונבנציונליות אינן מתאימות לחקר אינטראקציות מולקולריות במהלך גלגול תאים. בעוד ששיטות מניפולציה של תאים יחידים ומולקולה אחת כמו מיקרוסקופיה של כוח אטומי ופינצטה אופטית הצליחו לחקור אינטראקציות מולקולריות כגון האינטראקציה התלויה בכוח של P-selectin עם PSGL-1 ברמת המולקולה הבודדת9, הן אינן מתאימות לחקירת אירועי הידבקות חיה במהלך גלגול תאים. בנוסף, האינטראקציה המאופיינת במבחנה אינה יכולה לענות ישירות על השאלה על הידבקות מולקולרית ב- vivo. לדוגמה, איזה טווח מתח מולקולרי רלוונטי מבחינה ביולוגית כאשר תאים מתפקדים בסביבתם הטבעית? שיטות חישוביות כגון סימולציית דינמיקה דבק10 או מודל מצב יציב פשוט11 לכדו פרטים מולקולריים מסוימים וכיצד הם משפיעים על ההתנהגות המתגלגלת אך תלויים מאוד בדיוק הפרמטרים וההנחות של המודל. טכניקות אחרות כגון מיקרוסקופיה כוח המתיחה יכול לזהות כוחות במהלך נדידת תאים אבל לא מספקים רזולוציה מרחבית מספקת או מידע כמותי על מתח מולקולרי. אף אחת מהטכניקות הללו אינה יכולה לספק תצפיות ניסיוניות ישירות של הדינמיקה הזמנית, ההטרוגניות המרחבית וההטרוגניות בעוצמה של כוחות מולקולריים, המתייחסים ישירות לתפקוד התא ולהתנהגות בסביבתם הטבעית.
לכן, יישום חיישן כוח מולקולרי המסוגל למדוד במדויק אינטראקציות בתיווך סלקטיבי חיוני לשיפור הבנתנו של הידבקות מתגלגלת. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור טביעת הרגל הידבקות assay12 שבו חרוזים מצופים PSGL-1 מגולגלים על משטח המציג p-selectin פונקציונלי מד צמיגים (TGTs)13. TGTs אלה הם חיישני כוח מבוססי DNA בלתי הפיכים שגורמים להיסטוריה קבועה של אירועי קרע בצורה של קריאת פלואורסצנטיות. זה מושג באמצעות הקרע של TGT (dsDNA) ולאחר מכן תיוג לאחר מכן של TGT קרוע (ssDNA) עם גדיל משלימה תווית פלואורסצנטית. אחד היתרונות העיקריים של מערכת זו הוא התאימות שלה הן להדמיה מוגבלת עקיפה והן עם רזולוציית-על. הגדיל המשלים המסומן באופן פלואורסצנטי יכול להיות מאוגד לצמיתות (>12 bp) להדמיה מוגבלת עקיפה או כבול באופן חולף (7-9 bp) להדמיה ברזולוציית-על באמצעות DNA PAINT. זוהי מערכת אידיאלית לחקור הידבקות מתגלגלת כמו TGTs נקרעים במהלך גלגול פעיל, אבל קריאת פלואורסצנטיות מנותח לאחר גלגול. שתי שיטות ההדמיה מספקות גם למשתמש יותר חופש לחקור הידבקות מתגלגלת. בדרך כלל, הדמיה מוגבלת עקיפה שימושית לחילוץ כוח קרע מולקולרי באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות13, ואילו הדמיה ברזולוציית-על מאפשרת ניתוח כמותי של צפיפות הקולטן. עם היכולת לחקור תכונות אלה של הידבקות מתגלגלת, גישה זו מספקת פלטפורמה מבטיחה להבנת מנגנון ויסות הכוח על הידבקות מולקולרית של תאים מתגלגלים תחת זרימת גיסת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

הידבקות מתגלגלת, הקלה על ידי אינטראקציות בתיווך סלקטיבי, היא תנועתיות דינמית מאוד, פסיבית בגיוס לויקוציטים לאתר של דלקת. תופעה זו מתרחשת venules postcapillary, שבו זרימת הדם דוחפת לויקוציטים בתנועה מתגלגלת על תאי האנדותל. גלגול יציב דורש איזון עדין בין היווצרות קשר הידבקות לבין הניתוק המכני שלהם, ומאפשר לתא להישאר מחובר לפני השטח תוך כדי גלגול לכיוון הזרימה. שלא כמו תהליכי הידבקות אחרים המתרחשים בסביבות סטטיות יחסית, הידבקות מתגלגלת היא דינמית מאוד כאשר התאים המתגלגלים נעים על פני אלפי מיקרון בעשרות מיקרון לשנייה. כתוצאה מכך, שיטות מכניות קונבנציונליות כגון מיקרוסקופיה כוח המתיחה אינם מתאימים למדידת אירועי הידבקות בודדים ואת הכוחות המולקולריים הקשורים בשל ציר הזמן הקצר ורגישות גבוהה הנדרשים. כאן, אנו מתארים את היישום האחרון שלנו של טביעת הרגל הידבקות assay כדי לדמיין את P-selectin: אינטראקציות PSGL-1 בהידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית. שיטה זו משתמשת רצועות מד מתח מבוססות DNA בלתי הפיכות כדי לייצר היסטוריה קבועה של אירועי הידבקות מולקולרית בצורה של מסלולי פלואורסצנטיות. ניתן לדמיין מסלולים אלה בשתי דרכים: (1) תפירת אלפי תמונות מוגבלות עקיפה כדי לייצר שדה ראייה גדול, המאפשרת הפקת טביעת רגל של הידבקות של כל תא מתגלגל לאורך אלפי מיקרון, (2) ביצוע DNA-PAINT כדי לשחזר תמונות ברזולוציית-על של מסלולי הפלואורסצנטיות בתוך שדה ראייה קטן. במחקר זה, נעשה שימוש ב-90% מטביעת הרגל של הידבקות כדי לחקור תאי HL-60 המתגלגלים בלחצי גיסה שונים. בעשותנו כן, הצלחנו לדמיין את ההתפלגות המרחבית של P-selectin: אינטראקציית PSGL-1 ולקבל תובנה על הכוחות המולקולריים שלהם באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות. לפיכך, שיטה זו מספקת את היסודות לחקירה כמותית של אינטראקציות פני התא השונות המעורבות בהידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית.

הפרוטוקול לעיל מתאר את ההליך הניסיוני של תוחם טביעת הרגל של הידבקות. זרימת העבודה של הניסוי הכללי מודגמת באיור 1, החל מהרכבת תא הזרימה (איור 1A) וכלה בפונקציונליזציה של פני השטח (איור 1B) ושלבי הניסוי וההדמיה (איור 1C).
<p class="jove_c...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

פרוטוקול זה מסייע לבסס את הקשר בין כוח מולקולרי להתנהגות גלגול תאים מלבד מתן אפשרות למפות ולכומת הידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית. טכניקה זו מאפשרת לחקור אירועי הידבקות בודדים במהלך גלגול התא בפועל ומאפשרת לנו למדוד את כוח ההידבקות המולקולרית הרלוונטי הפיזיולוגי ישירות. הכנת פני השטח באמצעות זמן הריכוז והדגירה המתאימים בכל שלב חיונית להשגת פונקציונליזציה משטחית באיכות גבוהה.איכות הביו-תנאים והתנאים המתאימים הם גם חיוניים. הדגמה חזותית היא קריטית כדי לעזור לחוקרים לשכפל פרוטוקול זה. בפרט, השלבים כגון הרכבה תא זרימה ותמונות לאחר עיבוד ייהנו מאוד מהדגמה חזותית.התחל על ידי פיזור דק של כמות קטנה של אפוקסי משני צידי הסרט הדו-צדדי עם סכין גילוח. בעזרת לייזר, חותכים את הסרט מצופה אפוקסי כדי ליצור ארבעה ערוצים. צור את שבב הזרימה על ידי כריכת סרט אפוקסי בין שקופית של ארבעה חורים וכיסוי PEG.באמצעות קצה פיפטה, להפעיל לחץ עדין לאורך הערוצים כדי ליצור חותם טוב, ולאחר מכן לרפא את אפוקסי במשך מינימום של שעה אחת. ישר את השבב כך שפתיחת כל ערוץ תתמקם במרכזי המתאם. לאחר מכן הנח שני מרווחי אקריל שקופים על גבי השבב.יש להפעיל לחץ מוצק באמצע הבלוק ולבורג בקצו של כל מרווח. בורג את הכניסות לתוך החורים השחלה בצד השני של הסוגר לפקח על מצב האיטום דרך בלוק אקריליק שקוף. להזרים 200 microliters של חוצץ לשטוף לתוך התא כדי לבדוק דליפה.אם נוצרות בועות בערוץ, דחוף באגרסיביות 200 מיקרוליטרים נוספים של חוצץ כביסה כדי להסיר את הבועות. הוסף 40 מיקרוליטרים של BSA לתא הזרימה כדי למנוע כריכה לא-מינית ודגרה במשך 10 דקות בתא הלחות. לאחר הדגירה, מוסיפים 40 מיקרוליטרים ב- Tween 20 לתא הזרימה ושוב מדגירים במשך 10 דקות כדי להפחית עוד יותר את הכריכה הלא-מדעית.ואז לשטוף את הערוץ עם 200 microliters של חוצץ לשטוף כדי להסיר את כל סוכני passivation. לפונקציונליזציה של פני השטח התאיים, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של סטרפטאבידין לתא הזרימה ודגרו במשך 20 דקות, ואז שטפו את התא עם 200 מיקרוליטרים של חוצץ כביסה. עכשיו, להוסיף 40 microliters של חלבון היברידי G-TGT לתא הזרימה ודגרה במשך 20 דקות.לאחר הכביסה עם חוצץ כביסה, להוסיף 40 microliters של חלבון G-TGT העליון גדיל ודגורה במשך 20 דקות כדי להשלים כל גדיל תחתון TGT לא מרוסן על פני השטח ולאחר מכן לשטוף עם חוצץ לשטוף. לבסוף, להוסיף 40 microliters של P-selectin-Fc לתא הזרימה ודגור במשך 60 דקות לפני כביסה עם חוצץ לשטוף. מלא מזרק זכוכית חמישה מיליליטר עם חוצץ מתגלגל והקש על הצדדים של המזרק כדי להתנתק ולדחוף את הבועות החוצה כפי שהם צפים לכיוון הקצה.לאחר החדרת מחט סטרילית לתוך חתיכת 200 מ"מ של צינורות פוליאתילן, לחבר את המחט למזרק הזכוכית. תקן את המזרק על משאבת המזרק והטה את משאבת המזרק כך שצד הבוכנה מוגבה כדי למנוע מבועות אוויר להיכנס לערוץ. הכנס את קצה הצינור לתוך הכניסה של תא הזרימה.הכנס קצה אחד של עוד 200 מילימטר של צינורות פוליאתילן לתוך השקע ולהטביע את הקצה השני פסולת. קח אחד עד שני מיליליטר של דגימת השעיית התא וצנטריפוגה כדי כדורי התאים. הסר את המדיום בעדינות resuspend התאים ב 500 microliters של המאגר המתגלגל.בזהירות לנתק את הצינורות מן הכניסות ואת השקע ואת pipette 40 microliters של התלוי התא לתוך תא הזרימה. התחבר מחדש את הצינורות כמתואר בעבר והבטיח בועות לא הוכנסו לתוך ערוץ הזרימה. התחל ניסוי גלגול תאים על ידי הפעלת משאבת המזרק בקצבי הזרימה הרצויים.צפה בגלגול תאים באמצעות מיקרוסקופ שדה כהה עם מטרה פי 10. לאחר השלמת הניסוי, הסר את התאים מהערוץ על ידי הטתת המאגר המתגלגל במהירות של 100 מיליליטר לשעה עד שהמשטח יהיה פנוי. להדמיית המסלולים המקומיים על ידי DNA-PAINT, הוסף 40 מיקרוליטרים של גדיל צלם DNA-PAINT שהוכן במאגר DNA-PAINT לערוץ.בצע מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות פנימית כוללת באמצעות התנאים המוזכרים בכתב היד של הטקסט. הפוך את התמונות ברזולוציית-על ועבד את התמונות ברזולוציית-על. להדמיית הרצועות הארוכות על-ידי תיוג קבוע, הוסיפו את גדיל הדמייה הקבוע ודגרו למשך 120 שניות במאגר T50M5.ואז לשטוף את הערוץ על ידי החדירה 200 microliters של חוצץ לשטוף. הקלט תמונה עם לייזר העירור כבוי כדי להשיג רעש מצלמת רקע. תמונה של שטח גדול בתבנית רשת על-ידי מיקרוסקופיית TIRF.תכנת את המיקרוסקופ כדי לסרוק את השטח של 400 על 50 תמונות ולפצל את הנתונים הגולמיים לקבצי TIP בודדים שכל אחד מהם מכיל מקסימום של 10,000 תמונות באמצעות תוכנית ImageJ. שיטחו את כל התמונות באמצעות פרופיל התאורה והשתמשו בתוסף MIST כדי לתפור את התמונות. התוצאה של חלבון G ssDNA bioconjugation אפיון הראה כמעט אחד הוא יחס אחד של חלבון G ל ssDNA שבו חלבון G Maleimide ssDNA ו imidazole elution חוצץ ספקטרום מן הבסיס האורתוגונלית להתאמה לספקטרום המוצר bioconjugation.Native PAGE שימש לאישור ההסתייגות הביולוגית המציגה את הרצועות הירוקות הבהירות חופפות לרצועת החלבון המונומרית G המצביעה על הטיות מוצלחות ותשואה טובה. פרופיל התאורה של TIRF המוצג מסיבי מצב יחיד בהיר בדרך כלל יותר באמצע שדה הראייה ומעמעם סביב הקצוות. כדי לפצות על התאורה הלא אחידה ולשטח את התמונות לניתוח כמותי, פרופיל התאורה נקבע על ידי ממוצע של אלפי מסגרות בודדות.תמונות שטוחות הופקו על ידי חיסור רעש המצלמה הן מפרופילים גולמיים והן מפרופילי תאורה ולאחר מכן נרמול על ידי פרופיל התאורה. תפירה גולמית הראתה דפוסים תקופתיים ברורים המתאימים לתמונות שלא תיקון, בעוד שאותו שדה ראייה שתופר מתמונות שטוחות יצר רקע שטוח. פרופיל זרימה שיפוע שימש כדי לקבוע את הטווח של מתח הגיאה וכתוצאה מכך תאים מתגלגלים ולהניב מסלולי פלואורסצנטיות שתחתיו ניתן לראות טביעת רגל טיפוסית של הידבקות של תא יחיד.תוצאות תת-אופטימליות ואופטימליות של מסלולי פלורסנט עם ניגודיות מספקת, צפיפות מסלול מופרזת, צפיפות מסלול וניגודיות אופטימליות, והדמיה מוגבלת של DNA-PAINT מוצגים. זמן הדגירה של יותר מ -60 דקות להבטיח פונקציונליזציה פני השטח ובנייה קאמרית נכונה מונעת מעבר של בועות שפוגעות פני השטח פונקציונלי. הליך זה חל על ניתוח כמותי של כוח מולקולרי המעורב בהידבקות מתגלגלת ומאפשר לחוקרים להבין את ההתנהגות המתגלגלת של סוגי התאים השונים.טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור שאלות חדשות לגבי אירועי הידבקות מהירה המובילים לקידום נוסף של מולקולה בודדת ומחקר מכנוביולוגיה.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissection של ארגונית הקוטב Explants בעלי חיים מעוברים Xenopus laevis והרכבה של Assay הידבקות התא

Title Cell Encapsulation by Droplets

תא כותרת Encapsulation על ידי טיפות

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...