Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

इस काम को कनाडा फाउंडेशन ऑफ इनोवेशन (सीएफआई 35492), कनाडा डिस्कवरी ग्रांट के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (आरजीपीआईएन-2017-04407), रिसर्च फंड में नई सीमाएं (NFRFE-2018-00969), माइकल स्मिथ फाउंडेशन फॉर हेल्थ रिसर्च (SCH-2020-0559), और ब्रिटिश कोलंबिया एमिनेंस फंड विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

1. ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड लेबलिंग और संकरण
<ol><li>प्रोटीन जी डाइसल्फ़ाइड बांड की कमी<ol>
<li>अल्ट्राप्योर पानी के 1 मिलीलीटर में 10 मिलीग्राम प्रोटीन जी (प्रोटजी) को भंग करें। नोट: प्रोटीन जी यहाँ सी टर्मिन...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. 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T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

आसंजन पदचिह्न परख सेल रोलिंग आसंजन के दौरान PSGL-1 और पी-selectin के बीच आणविक आसंजन घटनाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है। इस प्रक्रिया को पी-सेलेक्टिन-मध्यस्थता कैप्चरिंग द्वारा शुरू किया जाता है, जिसके बाद तरल प?...

रोलिंग आसंजन कैस्केड का वर्णन करता है कि रक्त वाहिका wall1 के साथ कोशिकाओं को टेदर और रोल करने के लिए कैसे परिसंचारी। निष्क्रिय रोलिंग मुख्य रूप से selectins, सेलुलर आसंजन अणुओं (CAMs) का एक प्रमुख वर्ग द्वारा मध्यस्थता की जाती है। रक्त के कतरनी प्रवाह के तहत, पी-सेलेक्टिन ग्लाइकोप्रोटीन लिगैंड -1 (पीएसजीएल -1) को व्यक्त करने वाले ल्यूकोसाइट्स पी-सेलेक्टिन के साथ अत्यधिक क्षणिक बंधन बनाते हैं, जिसे सूजन एंडोथेलियल कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त किया जा सकता है। यह प्रक्रिया ल्यूकोसाइट्स के लिए सूजन की साइट पर माइग्रेट करने के लिए महत्वपूर्ण है2। इसके अलावा, PSGL-1 भी एक mechanosensitive रिसेप्टर P-selectin3 के साथ अपनी सगाई पर रोलिंग आसंजन कैस्केड के बाद के फर्म आसंजन चरण को ट्रिगर करने में सक्षम है।
सीएएम फ़ंक्शन को प्रभावित करने वाले आनुवंशिक उत्परिवर्तन प्रतिरक्षा प्रणाली को गंभीर रूप से प्रभावित कर सकते हैं, जैसे कि ल्यूकोसाइट आसंजन की कमी (एलएडी) की दुर्लभ बीमारी में, जहां रोलिंग की मध्यस्थता करने वाले आसंजन अणुओं की खराबी गंभीर रूप से इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड व्यक्तियों की ओर ले जाती है4,5,6। इसके अलावा, परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं को एक समान रोलिंग प्रक्रिया के बाद माइग्रेट करने के लिए दिखाया गया है, जिससे मेटास्टेसिस 7,8 हो जाता है। हालांकि, क्योंकि सेल रोलिंग तेज और गतिशील है, पारंपरिक प्रयोगात्मक mechanobiology विधियां सेल रोलिंग के दौरान आणविक इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त हैं। जबकि परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और ऑप्टिकल चिमटी जैसे एकल-सेल और एकल-अणु हेरफेर विधियां एकल-अणु स्तर 9 पर पीएसजीएल -1 के साथ पी-सेलेक्टिन की बल-निर्भर बातचीत जैसे आणविक इंटरैक्शन का अध्ययन करने में सक्षम थीं, वे सेल रोलिंग के दौरान लाइव आसंजन घटनाओं की जांच के लिए अनुपयुक्त हैं। इसके अतिरिक्त, विट्रो में विशेषता वाली बातचीत सीधे विवो में आणविक आसंजन के बारे में सवाल का जवाब नहीं दे सकती है। उदाहरण के लिए, जब कोशिकाएं अपने मूल वातावरण में काम कर रही हैं तो कौन सी आणविक तनाव सीमा जैविक रूप से प्रासंगिक है? कम्प्यूटेशनल विधियों जैसे चिपकने वाली गतिशीलता सिमुलेशन 10 या सरल स्थिर-राज्य मॉडल 11 ने कुछ आणविक विवरणों पर कब्जा कर लिया है और वे रोलिंग व्यवहार को कैसे प्रभावित करते हैं लेकिन मॉडलिंग पैरामीटर और मान्यताओं की सटीकता पर अत्यधिक निर्भर हैं। अन्य तकनीकें जैसे कर्षण बल माइक्रोस्कोपी सेल माइग्रेशन के दौरान बलों का पता लगा सकती हैं लेकिन आणविक तनाव पर पर्याप्त स्थानिक संकल्प या मात्रात्मक जानकारी प्रदान नहीं करती हैं। इन तकनीकों में से कोई भी अस्थायी गतिशीलता, स्थानिक वितरण, और आणविक बलों की परिमाण विषमता के प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक अवलोकन प्रदान नहीं कर सकता है, जो सीधे अपने मूल वातावरण में सेल फ़ंक्शन और व्यवहार से संबंधित हैं।
इसलिए, एक आणविक बल सेंसर को लागू करना जो चयन-मध्यस्थता इंटरैक्शन को सटीक रूप से मापने में सक्षम है, रोलिंग आसंजन की हमारी समझ में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां, हम आसंजन पदचिह्न परख 12 के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जहां पीएसजीएल -1 लेपित मोतियों को पी-सेलेक्टिन कार्यात्मक तनाव गेज टेथर (टीजीटी) 13 प्रस्तुत करने वाली सतह पर लुढ़काया जाता है। ये टीजीटी अपरिवर्तनीय डीएनए-आधारित बल सेंसर हैं जिनके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति रीडआउट के रूप में टूटने की घटनाओं का स्थायी इतिहास होता है। यह टीजीटी (dsDNA) के rupturing के माध्यम से प्राप्त किया जाता है और फिर एक फ्लोरोसेंटली लेबल पूरक स्ट्रैंड के साथ टूट टीजीटी (ssDNA) के बाद लेबलिंग। इस प्रणाली का एक प्रमुख लाभ विवर्तन-सीमित और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग दोनों के साथ इसकी संगतता है। फ्लोरोसेंटली लेबल पूरक स्ट्रैंड को या तो विवर्तन-सीमित इमेजिंग के लिए स्थायी रूप से बाध्य (>12 बीपी) या डीएनए पेंट के माध्यम से सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए क्षणिक रूप से बाध्य (7-9 बीपी) किया जा सकता है। रोलिंग आसंजन का अध्ययन करने के लिए यह एक आदर्श प्रणाली है क्योंकि सक्रिय रोलिंग के दौरान टीजीटी टूट जाते हैं, लेकिन प्रतिदीप्ति रीडआउट का विश्लेषण पोस्ट-रोलिंग के बाद किया जाता है। दो इमेजिंग विधियां उपयोगकर्ता को रोलिंग आसंजन की जांच करने के लिए अधिक स्वतंत्रता भी प्रदान करती हैं। आमतौर पर, विवर्तन-सीमित इमेजिंग प्रतिदीप्ति तीव्रता 13 के माध्यम से आणविक टूटना बल निकालने के लिए उपयोगी है, जबकि सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग रिसेप्टर घनत्व के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। रोलिंग आसंजन के इन गुणों की जांच करने की क्षमता के साथ, यह दृष्टिकोण कतरनी प्रवाह के तहत रोलिंग कोशिकाओं के आणविक आसंजन पर बल-विनियमन तंत्र को समझने के लिए एक आशाजनक मंच प्रदान करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

रोलिंग आसंजन, selectin-मध्यस्थता इंटरैक्शन द्वारा सुविधाजनक, सूजन की साइट के लिए ल्यूकोसाइट्स की भर्ती में एक अत्यधिक गतिशील, निष्क्रिय गतिशीलता है। यह घटना पोस्टकेशिका वेन्यूल्स में होती है, जहां रक्त प्रवाह एंडोथेलियल कोशिकाओं पर एक रोलिंग गति में ल्यूकोसाइट्स को धक्का देता है। स्थिर रोलिंग के लिए आसंजन बंधन गठन और उनके यांत्रिक रूप से संचालित पृथक्करण के बीच एक नाजुक संतुलन की आवश्यकता होती है, जिससे सेल को प्रवाह की दिशा में रोल करते समय सतह से जुड़ा रहने की अनुमति मिलती है। अपेक्षाकृत स्थिर वातावरण में होने वाली अन्य आसंजन प्रक्रियाओं के विपरीत, रोलिंग आसंजन अत्यधिक गतिशील है क्योंकि रोलिंग कोशिकाएं प्रति सेकंड दसियों माइक्रोन पर हजारों माइक्रोन पर यात्रा करती हैं। नतीजतन, पारंपरिक मेकानोबायोलॉजी विधियां जैसे कि कर्षण बल माइक्रोस्कोपी व्यक्तिगत आसंजन घटनाओं और संबंधित आणविक बलों को मापने के लिए अनुपयुक्त हैं, जो कम समय के पैमाने और उच्च संवेदनशीलता की आवश्यकता के कारण हैं। यहां, हम आसंजन पदचिह्न परख के हमारे नवीनतम कार्यान्वयन का वर्णन करने के लिए पी-selectin छवि: PSGL-1 आणविक स्तर पर रोलिंग आसंजन में बातचीत. यह विधि प्रतिदीप्ति पटरियों के रूप में आणविक आसंजन घटनाओं के स्थायी इतिहास का उत्पादन करने के लिए अपरिवर्तनीय डीएनए-आधारित तनाव गेज टेथर का उपयोग करती है। इन पटरियों को दो तरीकों से चित्रित किया जा सकता है: (1) दृश्य के एक बड़े क्षेत्र का उत्पादन करने के लिए हजारों विवर्तन-सीमित छवियों को एक साथ सिलाई करना, लंबाई में हजारों माइक्रोन पर प्रत्येक रोलिंग सेल के आसंजन पदचिह्न के निष्कर्षण को सक्षम करना, (2) डीएनए-पेंट का प्रदर्शन देखने के एक छोटे से क्षेत्र के भीतर प्रतिदीप्ति पटरियों की सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों का पुनर्निर्माण करने के लिए। इस अध्ययन में, आसंजन पदचिह्न परख का उपयोग एचएल -60 कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए किया गया था जो विभिन्न कतरनी तनावों पर रोलिंग करते हैं। ऐसा करने में, हम पी-सेलेक्टिन के स्थानिक वितरण की छवि बनाने में सक्षम थे: पीएसजीएल -1 इंटरैक्शन और प्रतिदीप्ति तीव्रता के माध्यम से उनके आणविक बलों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करें। इस प्रकार, यह विधि आणविक स्तर पर रोलिंग आसंजन में शामिल विभिन्न सेल-सतह इंटरैक्शन की मात्रात्मक जांच के लिए आधार प्रदान करती है।

ऊपर प्रोटोकॉल आसंजन पदचिह्न परख की प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन करता है। सामान्य प्रयोग वर्कफ़्लो को चित्र 1 में दर्शाया गया है, प्रवाह कक्ष असेंबली (चित्रा 1A) से सतह कार्यात्?...

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Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

इस प्रोटोकॉल तेजी से सेल रोलिंग आसंजन के दौरान आसंजन घटनाओं की छवि के लिए आसंजन पदचिह्न परख प्रदर्शन करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं प्रस्तुत करता है।

आसंजन पदचिह्न परख द्वारा सेल रोलिंग में इमेजिंग आणविक आसंजन

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

यह प्रोटोकॉल आणविक बल और सेल रोलिंग व्यवहार के बीच संबंध स्थापित करने में मदद करता है, इसके अलावा आणविक स्तर पर स्थानिक रूप से मानचित्र और रोलिंग आसंजन को मापने की अनुमति देता है। यह तकनीक वास्तविक सेल रोलिंग के दौरान व्यक्तिगत आसंजन घटनाओं का अध्ययन करने की अनुमति देती है जिससे हमें सीधे शारीरिक प्रासंगिक आणविक आसंजन बल को मापने की अनुमति मिलती है। प्रत्येक चरण में उचित एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय का उपयोग करके सतह की तैयारी उच्च गुणवत्ता वाली सतह कार्यात्मकता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।Bioconjugations और उचित परिस्थितियों की गुणवत्ता भी महत्वपूर्ण हैं। दृश्य प्रदर्शन शोधकर्ताओं को इस प्रोटोकॉल को दोहराने में मदद करने के लिए महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, प्रवाह कक्ष असेंबली और पोस्ट-प्रोसेसिंग छवियों जैसे चरणों को एक दृश्य प्रदर्शन से बहुत लाभ होगा।एक रेजर ब्लेड के साथ डबल-साइडेड टेप के दोनों किनारों पर एपॉक्सी की एक छोटी राशि को पतला फैलाकर शुरू करें। एक लेजर का उपयोग करके, चार चैनल बनाने के लिए एपॉक्सी-लेपित टेप में कटौती करें। एक चार छेद स्लाइड और खूंटी coverslip के बीच epoxy टेप sandwiching द्वारा प्रवाह चिप बनाएँ.एक पिपेट टिप का उपयोग करके, एक अच्छी मुहर बनाने के लिए चैनलों की लंबाई के साथ कोमल दबाव लागू करें, फिर कम से कम एक घंटे के लिए एपॉक्सी का इलाज करें। चिप को संरेखित करें ताकि प्रत्येक चैनल का उद्घाटन एडाप्टर के केंद्रों पर स्थित हो। फिर चिप के शीर्ष पर दो पारदर्शी ऐक्रेलिक स्पेसर रखें।ब्लॉक के बीच में फर्म दबाव लागू करें और प्रत्येक स्पेसर के सिरों पर पेंच करें। ब्रैकेट के दूसरी तरफ थ्रेडेड छेद में इनलेट्स पेंच और पारदर्शी ऐक्रेलिक ब्लॉक के माध्यम से सीलिंग स्थिति की निगरानी। रिसाव के लिए जाँच करने के लिए कक्ष में धोने बफर के 200 माइक्रोलीटर प्रवाह।यदि चैनल में बुलबुले बनते हैं, तो आक्रामक रूप से बुलबुले को हटाने के लिए वॉश बफर के अतिरिक्त 200 माइक्रोलीटर को धक्का दें। गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को रोकने के लिए प्रवाह कक्ष में बीएसए के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें और आर्द्रता कक्ष में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, प्रवाह कक्ष में ट्वीन 20 पर 40 माइक्रोलीटर जोड़ें और फिर से गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।फिर सभी passivation एजेंटों को हटाने के लिए धोने बफर के 200 माइक्रोलीटर के साथ चैनल को धोएं। कक्ष सतह functionalization के लिए, प्रवाह कक्ष के लिए Streptavidin के 40 microliters जोड़ें और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट, तो धोने बफर के 200 microliters के साथ कक्ष धोना। अब, प्रवाह कक्ष में संकरित प्रोटीन जी-टीजीटी के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।धोने के बफर के साथ धोने के बाद, प्रोटीन जी-टीजीटी शीर्ष स्ट्रैंड के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें और सतह पर किसी भी unhybridized TGT नीचे स्ट्रैंड को पूरा करने के लिए 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और फिर वॉश बफर के साथ धोएं। अंत में, प्रवाह कक्ष में पी-सेलेक्टिन-एफसी के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें और धोने के बफर के साथ धोने से पहले 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। रोलिंग बफर के साथ एक पांच मिलीलीटर ग्लास सिरिंज भरें और सिरिंज के किनारों को टैप करें और बुलबुले को बाहर निकालने और धक्का दें क्योंकि वे टिप की ओर तैरते हैं।पॉलीथीन टयूबिंग के 200 मिलीमीटर टुकड़े में एक बाँझ सुई डालने के बाद, सुई को कांच की सिरिंज से कनेक्ट करें। सिरिंज पंप पर सिरिंज को ठीक करें और सिरिंज पंप को झुकाएं जैसे कि प्लंजर पक्ष चैनल में प्रवेश करने से हवा के बुलबुले को रोकने के लिए ऊंचा है। प्रवाह कक्ष इनलेट में ट्यूब के अंत को सम्मिलित करें।आउटलेट में पॉलीथीन टयूबिंग के एक और 200 मिलीमीटर टुकड़े के एक छोर को डालें और दूसरे छोर को एक अपशिष्ट बीकर में डुबोएं। कोशिकाओं को गोली मारने के लिए सेल निलंबन नमूने और सेंट्रीफ्यूज के एक से दो मिलीलीटर लें। मध्यम निकालें और धीरे रोलिंग बफर के 500 microliters में कोशिकाओं resuspend.ध्यान से इनलेट्स और आउटलेट से टयूबिंग डिस्कनेक्ट करें और प्रवाह कक्ष में सेल निलंबन के 40 माइक्रोलीटर पिपेट करें। ट्यूबिंग को फिर से कनेक्ट करें जैसा कि पहले से सुनिश्चित किया गया है कि बुलबुले प्रवाह चैनल में पेश नहीं किए गए हैं। वांछित प्रवाह दरों पर सिरिंज पंप शुरू करके सेल रोलिंग प्रयोग शुरू करें।एक 10X उद्देश्य के साथ एक अंधेरे क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सेल रोलिंग का निरीक्षण करें। एक बार प्रयोग पूरा हो जाने के बाद, सतह सेल मुक्त होने तक 100 मिलीलीटर प्रति घंटे पर रोलिंग बफर को इनफ्यूज करके चैनल से कोशिकाओं को हटा दें। डीएनए-पेंट द्वारा स्थानीय पटरियों को इमेजिंग करने के लिए, चैनल के लिए डीएनए-पेंट बफर में तैयार डीएनए-पेंट इमेजर स्ट्रैंड के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें।पाठ पांडुलिपि में उल्लिखित शर्तों का उपयोग करके कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी करें। स्थानीयकृत और सुपर रिज़ॉल्यूशन छवियों को रेंडर. स्थायी लेबलिंग द्वारा लंबी पटरियों इमेजिंग के लिए, स्थायी इमेजर स्ट्रैंड जोड़ें और T50M5 बफर में 120 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करें।फिर वॉश बफर के 200 माइक्रोलीटर को इनफ्यूज करके चैनल को धोएं। पृष्ठभूमि कैमरा शोर प्राप्त करने के लिए उत्तेजना लेजर बंद के साथ एक छवि रिकॉर्ड करें। टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी द्वारा ग्रिड पैटर्न में एक बड़े क्षेत्र की छवि।50 छवियों द्वारा 400 के क्षेत्र को स्कैन करने के लिए माइक्रोस्कोप को प्रोग्राम करें और कच्चे डेटा को व्यक्तिगत टिप फ़ाइलों में विभाजित करें जिनमें से प्रत्येक में अधिकतम 10, 000 छवियां शामिल हैं। रोशनी प्रोफ़ाइल का उपयोग कर सभी छवियों को समतल करें और छवियों को सिलाई करने के लिए MIST प्लगइन का उपयोग करें। प्रोटीन जी ssDNA bioconjugation लक्षण वर्णन के लिए परिणाम से पता चला है कि लगभग एक एसएसडीएनए के लिए प्रोटीन जी के एक अनुपात के लिए है जहां प्रोटीन जी Maleimide ssDNA और imidazole क्षालन बफर स्पेक्ट्रा ओर्थोगोनल आधार से bioconjugation उत्पाद स्पेक्ट्रम के लिए फिटिंग के लिए.मूल पृष्ठ का उपयोग बायोकंजिगेशन की पुष्टि करने के लिए किया गया था, जिसमें मोनोमेरिक प्रोटीन जी बैंड के साथ मिलकर उज्ज्वल हरे रंग के बैंड दिखाए गए थे जो सफल संयुग्मन और अच्छी उपज का संकेत देते थे। एक एकल मोड फाइबर से शुरू किया गया टीआईआरएफ रोशनी प्रोफ़ाइल आमतौर पर किनारों के चारों ओर दृश्य और डिमर के क्षेत्र के बीच में उज्ज्वल होता है। असमान रोशनी के लिए क्षतिपूर्ति करने और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए छवियों को समतल करने के लिए, रोशनी प्रोफ़ाइल को हजारों व्यक्तिगत फ्रेम के औसत से निर्धारित किया गया था।चपटी छवियों को कच्चे और रोशनी प्रोफाइल दोनों से कैमरा शोर को घटाकर और फिर रोशनी प्रोफ़ाइल द्वारा सामान्य करके उत्पादित किया गया था। कच्चे सिलाई ने असुधारित छवियों के अनुरूप स्पष्ट आवधिक पैटर्न दिखाए, जबकि चपटी छवियों से सिले गए दृश्य के एक ही क्षेत्र ने एक सपाट पृष्ठभूमि का उत्पादन किया। एक रैंप अप फ्लो प्रोफाइल का उपयोग कतरनी तनाव की सीमा को निर्धारित करने के लिए किया गया था जिसके परिणामस्वरूप सेल रोलिंग और उपज प्रतिदीप्ति ट्रैक होते हैं जिसके तहत एक विशिष्ट एकल-सेल आसंजन पदचिह्न देखा जा सकता है।अपर्याप्त विपरीत, अत्यधिक ट्रैक घनत्व, इष्टतम ट्रैक घनत्व और इसके विपरीत, और विवर्तन सीमित और डीएनए-पेंट इमेजिंग के साथ फ्लोरोसेंट पटरियों के सबऑप्टिमल और इष्टतम परिणाम दिखाए गए हैं। 60 मिनट से अधिक का इनक्यूबेशन समय सतह कार्यात्मकता सुनिश्चित करता है और उचित कक्ष निर्माण बुलबुले के पारित होने से रोकता है जो कार्यात्मक सतह को नुकसान पहुंचाते हैं। यह प्रक्रिया रोलिंग आसंजन में शामिल आणविक बल के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए लागू होती है और शोधकर्ताओं को विभिन्न सेल प्रकारों के रोलिंग व्यवहार को समझने की अनुमति देती है।यह तकनीक शोधकर्ताओं को तेजी से आसंजन की घटनाओं के बारे में नए सवालों का पता लगाने की अनुमति देती है जिससे एकल अणु और मेचानोबायोलॉजी अनुसंधान की आगे की प्रगति होती है।

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

आसंजन और एस cerevisiae में अग्रवाल आक्रमण के लिए परख

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

आर्गेनाइज़र और Xenopus laevis भ्रूण से पशु ध्रुव Explants और एक कोशिका आसंजन परख की सभा के विच्छेदन

Title Cell Encapsulation by Droplets

शीर्षक बूंदों द्वारा सेल इनकैप्सुलेशन

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

एक व्यवहार के लिए हल्की तीव्रता में परिवर्तन के लिए Zebrafish की जवाबदेही उपाय परख

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

प्लेटलेट आसंजन और फ्लो तहत एकत्रीकरण Microfluidic फ्लो कक्ष का उपयोग

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

जहाँ रहते इमेजिंग सेल आकार बदलें ड्रोसोफिला भ्रूण

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

सीए की भूमिका का आकलन के लिए इमेजिंग परख लाइव<sup&gt; 2 +</supताकना के गठन विष घावों की मरम्मत में&gt; और Sphingomyelinase

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के Vivo 4 आयामी ट्रैकिंग में

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

चूहे में एरोबिक व्यायाम से भोजी को सक्रिय

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

यांत्रिक तनाव के जवाब में सेल सतह आसंजन Remodeling का विश्लेषण चुंबकीय मोतियों का उपयोग

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...