Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), dal New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), dalla Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) e dall'University of British Columbia Eminence Fund.

1. Marcatura e ibridazione degli oligonucleotidi
<ol><li>Riduzione dei legami disolfuro della proteina G<ol>
<li>Sciogliere 10 mg di Proteina G (ProtG) in 1 mL di acqua ultrapura. NOTA: La proteina G qui è modificata con un singolo residuo di cisteina al C-terminus e un tag di poli-istidina N-terminus.</li>
		<li>Scambio tampone ≥20 μL di ProtG (10 mg/mL) in 1x PBS (pH 7,2) con una colonna P6.</li>
		<li>Misurare la concentrazione proteica dopo lo scambio tampone. NOTA: Concentrazione tipica ...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. 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T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

Il test dell'impronta di adesione consente la visualizzazione degli eventi di adesione molecolare tra PSGL-1 e P-selectina durante l'adesione al rotolamento cellulare. Questo processo viene avviato mediante cattura mediata da P-selectina seguita da rotolamento sotto sforzo di taglio fluidico. I potenziali problemi durante l'esperimento di solito riguardano un cattivo rotolamento delle cellule o tracce fluorescenti mancanti anche quando le cellule rotolano bene. Questi problemi sono spesso il risultato di controlli di qua...

La cascata di adesione a rotolamento descrive come le cellule circolanti si legano e rotolano lungo la parete dei vasi sanguigni1. Il rotolamento passivo è mediato principalmente dalle selectine, una delle principali classi di molecole di adesione cellulare (CAM)1. Sotto il flusso di taglio del sangue, i leucociti che esprimono il ligando-1 della glicoproteina P-selectina (PSGL-1) formano legami altamente transitori con la P-selectina, che possono essere espressi sulla superficie delle cellule endoteliali infiammate. Questo processo è fondamentale affinché i leucociti migrino verso un sito di infiammazione2. Inoltre, PSGL-1 è anche un recettore meccanosensibile in grado di innescare la successiva fase di adesione ferma della cascata di adesione rotolante al momento del suo impegno con P-selectina3.
Le mutazioni genetiche che influenzano la funzione CAM possono influenzare gravemente il sistema immunitario, come nella malattia rara del deficit di adesione leucocitaria (LAD), dove il malfunzionamento delle molecole di adesione che mediano il rolling porta a individui gravemente immunocompromessi4,5,6. Inoltre, è stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti migrano seguendo un processo di rotolamento simile, portando a metastasi7,8. Tuttavia, poiché il rotolamento cellulare è veloce e dinamico, i metodi convenzionali di meccanobiologia sperimentale non sono adatti per studiare le interazioni molecolari durante il rotolamento cellulare. Mentre i metodi di manipolazione a singola cellula e singola molecola come la microscopia a forza atomica e la pinzetta ottica sono stati in grado di studiare le interazioni molecolari come l'interazione forza-dipendente di P-selectina con PSGL-1 a livello di singola molecola9, non sono adatti per studiare eventi di adesione dal vivo durante il rotolamento cellulare. Inoltre, l'interazione caratterizzata in vitro non può rispondere direttamente alla domanda sull'adesione molecolare in vivo. Ad esempio, quale intervallo di tensione molecolare è biologicamente rilevante quando le cellule funzionano nel loro ambiente nativo? Metodi computazionali come la simulazione della dinamica adesiva10 o il semplice modello a stato stazionario11 hanno catturato alcuni dettagli molecolari e il modo in cui influenzano il comportamento di rotolamento, ma dipendono fortemente dall'accuratezza dei parametri e delle ipotesi di modellazione. Altre tecniche come la microscopia a forza di trazione possono rilevare le forze durante la migrazione cellulare, ma non forniscono una risoluzione spaziale sufficiente o informazioni quantitative sulla tensione molecolare. Nessuna di queste tecniche può fornire osservazioni sperimentali dirette delle dinamiche temporali, della distribuzione spaziale e dell'eterogeneità di grandezza delle forze molecolari, che si riferiscono direttamente alla funzione e al comportamento delle cellule nel loro ambiente nativo.
Pertanto, l'implementazione di un sensore di forza molecolare in grado di misurare con precisione le interazioni selectin-mediate è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dell'adesione al rotolamento. Qui descriviamo il protocollo per il test dell'impronta di adesione12 in cui le perle rivestite di PSGL-1 vengono laminate su una superficie che presenta cavi di tensometro funzionalizzati p-selectin (TGT)13. Questi TGT sono sensori di forza irreversibili basati sul DNA che si traducono in una storia permanente di eventi di rottura sotto forma di lettura della fluorescenza. Ciò si ottiene attraverso la rottura del TGT (dsDNA) e quindi la successiva etichettatura del TGT rotto (ssDNA) con un filamento complementare marcato fluorescentemente. Uno dei principali vantaggi di questo sistema è la sua compatibilità sia con l'imaging a diffrazione limitata che con quella a super-risoluzione. Il filamento complementare marcato fluorescentemente può essere legato in modo permanente (>12 bp) per l'imaging limitato alla diffrazione o legato transitoriamente (7-9 bp) per l'imaging a super-risoluzione attraverso DNA PAINT. Questo è un sistema ideale per studiare l'adesione al rotolamento poiché i TGT si rompono durante la laminazione attiva, ma la lettura della fluorescenza viene analizzata dopo la laminazione. I due metodi di imaging offrono inoltre all'utente una maggiore libertà di indagare sull'adesione a rotolamento. In genere, l'imaging a diffrazione limitata è utile per estrarre la forza di rottura molecolare attraverso l'intensità di fluorescenza13, mentre l'imaging a super-risoluzione consente l'analisi quantitativa della densità del recettore. Con la capacità di studiare queste proprietà dell'adesione a rotolamento, questo approccio fornisce una piattaforma promettente per comprendere il meccanismo di regolazione della forza sull'adesione molecolare delle cellule di rotolamento sotto flusso di taglio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

L'adesione a rotolamento, facilitata da interazioni mediate dalla selectina, è una motilità passiva altamente dinamica nel reclutamento di leucociti nel sito di infiammazione. Questo fenomeno si verifica nelle venule postcapillari, dove il flusso sanguigno spinge i leucociti in un movimento rotolante sulle cellule endoteliali. La laminazione stabile richiede un delicato equilibrio tra la formazione del legame di adesione e la loro dissociazione guidata meccanicamente, consentendo alla cella di rimanere attaccata alla superficie mentre rotola nella direzione del flusso. A differenza di altri processi di adesione che si verificano in ambienti relativamente statici, l'adesione di rotolamento è altamente dinamica poiché le celle di laminazione viaggiano su migliaia di micron a decine di micron al secondo. Di conseguenza, i metodi convenzionali di meccanobiologia come la microscopia della forza di trazione non sono adatti per misurare i singoli eventi di adesione e le forze molecolari associate a causa del breve lasso di tempo e dell'elevata sensibilità richiesta. Qui, descriviamo la nostra ultima implementazione del test dell'impronta di adesione per visualizzare le interazioni P-selectin: PSGL-1 nell'adesione rolling a livello molecolare. Questo metodo utilizza legami irreversibili di tensometro basati sul DNA per produrre una storia permanente di eventi di adesione molecolare sotto forma di tracce di fluorescenza. Queste tracce possono essere fotografate in due modi: (1) cucire insieme migliaia di immagini limitate alla diffrazione per produrre un ampio campo visivo, consentendo l'estrazione dell'impronta di adesione di ogni cellula di rotolamento su migliaia di micron di lunghezza, (2) eseguire DNA-PAINT per ricostruire immagini a super-risoluzione delle tracce di fluorescenza all'interno di un piccolo campo visivo. In questo studio, il test dell'impronta di adesione è stato utilizzato per studiare le cellule HL-60 che rotolano a diverse sollecitazioni di taglio. In tal modo, siamo stati in grado di visualizzare la distribuzione spaziale dell'interazione P-selectina: PSGL-1 e ottenere informazioni sulle loro forze molecolari attraverso l'intensità della fluorescenza. Pertanto, questo metodo fornisce le basi per l'indagine quantitativa delle varie interazioni cellula-superficie coinvolte nell'adesione a rotolamento a livello molecolare.

Il protocollo di cui sopra descrive la procedura sperimentale del test dell'impronta di adesione. Il flusso di lavoro generale dell'esperimento è illustrato nella Figura 1, dall'assemblaggio della camera di flusso (Figura 1A) alla funzionalizzazione della superficie (Figura 1B) e alle fasi di esperimento e imaging (Figura 1C).
La Figura 2 è un ...

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Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Questo protocollo presenta le procedure sperimentali per eseguire il test dell'impronta di adesione per visualizzare gli eventi di adesione durante l'adesione a laminazione rapida delle cellule.

Imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Questo protocollo aiuta a stabilire la connessione tra forza molecolare e comportamento di rotolamento cellulare oltre a consentire di mappare e quantificare spazialmente l'adesione al rotolamento a livello molecolare. Questa tecnica permette di studiare i singoli eventi di adesione durante il rotolamento cellulare effettivo permettendoci di misurare direttamente la forza di adesione molecolare fisiologicamente rilevante. La preparazione della superficie utilizzando la concentrazione e il tempo di incubazione appropriati in ogni fase è fondamentale per ottenere una funzionalizzazione superficiale di alta qualità.Anche la qualità delle bioconiugazioni e le condizioni adeguate sono cruciali. La dimostrazione visiva è fondamentale per aiutare i ricercatori a replicare questo protocollo. In particolare, le fasi come l'assemblaggio della camera di flusso e la post-elaborazione delle immagini trarranno grande beneficio da una dimostrazione visiva.Inizia stendendo sottilmente una piccola quantità di resina epossidica su entrambi i lati del nastro biadesivo con una lama di rasoio. Utilizzando un laser, tagliare il nastro rivestito con resina epossidica per creare quattro canali. Create il chip di flusso inserendo il nastro epossidico tra una slitta a quattro fori e una slitta di copertura PEG.Utilizzando una punta della pipetta, applicare una leggera pressione lungo la lunghezza dei canali per creare una buona tenuta, quindi polimerizzare la resina epossidica per un minimo di un'ora. Allineare il chip in modo che l'apertura di ciascun canale sia posizionata al centro dell'adattatore. Quindi posizionare due distanziali acrilici trasparenti sulla parte superiore del chip.Applicare una pressione decisa al centro del blocco e avvitare alle estremità di ciascun distanziatore. Avvitare gli ingressi nei fori filettati sull'altro lato della staffa e monitorare le condizioni di tenuta attraverso il blocco acrilico trasparente. Flusso 200 microlitri di tampone di lavaggio nella camera per verificare la presenza di perdite.Se si formano bolle nel canale, spingere aggressivamente altri 200 microlitri di tampone di lavaggio per rimuovere le bolle. Aggiungere 40 microlitri di BSA alla camera di flusso per evitare legami non specifici e incubare per 10 minuti nella camera di umidità. Dopo l'incubazione, aggiungere 40 microlitri a Tween 20 alla camera di flusso e di nuovo incubare per 10 minuti per ridurre ulteriormente il legame non specifico.Quindi lavare il canale con 200 microlitri di tampone di lavaggio per rimuovere tutti gli agenti di passivazione. Per la funzionalizzazione della superficie della camera, aggiungere 40 microlitri di Streptavidin alla camera di flusso e incubare per 20 minuti, quindi lavare la camera con 200 microlitri di tampone di lavaggio. Ora, aggiungi 40 microlitri di proteina ibridata G-TGT alla camera di flusso e incuba per 20 minuti.Dopo il lavaggio con tampone di lavaggio, aggiungere 40 microlitri di proteina G-TGT top strand e incubare per 20 minuti per completare qualsiasi filamento inferiore TGT non ibridato sulla superficie e quindi lavare con tampone di lavaggio. Infine, aggiungere 40 microlitri di P-selectin-Fc alla camera di flusso e incubare per 60 minuti prima del lavaggio con tampone di lavaggio. Riempire una siringa di vetro da cinque millilitri con il tampone di rotolamento e picchiettare i lati della siringa per rimuovere e spingere fuori le bolle mentre galleggiano verso la punta.Dopo aver inserito un ago sterile in un pezzo di tubo di polietilene da 200 millimetri, collegare l'ago alla siringa di vetro. Fissare la siringa sulla pompa della siringa e inclinare la pompa della siringa in modo che il lato dello stantuffo sia sollevato per evitare che le bolle d'aria entrino nel canale. Inserire l'estremità del tubo nell'ingresso della camera di flusso.Inserire un'estremità di un altro pezzo da 200 millimetri del tubo di polietilene nell'uscita e immergere l'altra estremità in un becher di scarto. Prelevare da uno a due millilitri del campione di sospensione cellulare e centrifugare per pellettare le celle. Rimuovere il mezzo e risospese delicatamente le celle in 500 microlitri del tampone di rotolamento.Scollegare con cura il tubo dalle prese e l'uscita e la pipetta 40 microlitri della sospensione cellulare nella camera di flusso. Ricollegare il tubo come descritto in precedenza assicurandosi che le bolle non vengano introdotte nel canale di flusso. Iniziare l'esperimento di laminazione cellulare avviando la pompa della siringa alle portate desiderate.Osserva il rotolamento cellulare usando un microscopio a campo oscuro con un obiettivo 10X. Una volta completato l'esperimento, rimuovere le celle dal canale infondendo il tampone di rotolamento a 100 millilitri all'ora fino a quando la superficie non è libera da celle. Per l'imaging delle tracce locali tramite DNA-PAINT, aggiungere al canale 40 microlitri di filamento imager DNA-PAINT preparato nel buffer DNA-PAINT.Eseguire la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale utilizzando le condizioni menzionate nel manoscritto di testo. Localizza ed esegui il rendering delle immagini a super risoluzione. Per l'imaging delle tracce lunghe mediante etichettatura permanente, aggiungere il filamento imager permanente e incubare per 120 secondi nel buffer T50M5.Quindi lavare il canale infondendo 200 microlitri di tampone di lavaggio. Registrare un'immagine con il laser di eccitazione spento per ottenere il rumore di fondo della telecamera. Immagine di una vasta area in un modello a griglia mediante microscopia TIRF.Programmare il microscopio per scansionare l'area di 400 per 50 immagini e dividere i dati grezzi in singoli file TIP contenenti ciascuno un massimo di 10.000 immagini utilizzando il programma ImageJ. Appiattisci tutte le immagini utilizzando il profilo di illuminazione e utilizza il plugin MIST per cucire le immagini. Il risultato per la caratterizzazione della bioconiugazione della proteina G ssDNA ha mostrato un rapporto quasi uno a uno tra proteina G e ssDNA in cui la proteina G Maleimide ssDNA e gli spettri tampone di eluizione imidazolica dalla base ortogonale per adattarsi allo spettro di prodotti di bioconiugazione.La PAGE nativa è stata utilizzata per confermare la bioconiugazione che mostra le bande verde brillante che coincidono con la banda G della proteina monomerica che indica un successo della coniugazione e una buona resa. Il profilo di illuminazione TIRF introdotto da una fibra monomodale è generalmente più luminoso al centro del campo visivo e dimmer attorno ai bordi. Per compensare l'illuminazione irregolare e appiattire le immagini per l'analisi quantitativa, il profilo di illuminazione è stato determinato facendo una media di migliaia di singoli fotogrammi.Le immagini appiattite sono state prodotte sottraendo il rumore della fotocamera sia dai profili raw che da quelli di illuminazione e quindi normalizzandosi dal profilo di illuminazione. Le cuciture grezze mostravano chiari modelli periodici corrispondenti alle immagini non corrette, mentre lo stesso campo visivo cucito da immagini appiattite produceva uno sfondo piatto. È stato utilizzato un profilo di flusso ramp up per determinare l'intervallo di sforzo di taglio con conseguente rotolamento delle celle e tracce di fluorescenza di resa sotto le quali è stato possibile vedere una tipica impronta di adesione a cella singola.Vengono mostrati risultati non ottimali e ottimali di tracce fluorescenti con contrasto insufficiente, densità di traccia eccessiva, densità e contrasto di traccia ottimali e diffrazione limitata e imaging DNA-PAINT. Il tempo di incubazione superiore a 60 minuti garantisce la funzionalizzazione della superficie e la corretta costruzione della camera impedisce il passaggio di bolle che danneggiano la superficie funzionalizzata. Questa procedura è applicabile per l'analisi quantitativa della forza molecolare coinvolta nell'adesione al rotolamento e consente ai ricercatori di comprendere il comportamento di rotolamento dei diversi tipi di cellule.Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare nuove domande riguardanti gli eventi di adesione rapida che portano a un ulteriore progresso della ricerca sulla singola molecola e sulla meccanobiologia.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Test di adesione ed invasione di Agar in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Ricerca

Biologia

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titolo Incapsulamento cella di goccioline

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

L&#39;adesione e aggregazione piastrinica in condizioni di flusso utilizzando celle di flusso Microfluidic

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Vivere Imaging test per la valutazione dei ruoli di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E sfingomielinasi nella riparazione di Pore-formano ferite Tossina

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

Attivazione di autofagia per esercizio aerobico nei topi

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Analizzando cellulare superficie di adesione ritocca in risposta alla tensione meccanica utilizzando biglie magnetiche

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...