Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

이 작품은 캐나다 혁신 재단 (CFI 35492), 캐나다 디스커버리 그랜트의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (RGPIN-2017-04407), 연구 기금의 뉴 프론티어 (NFRFE-2018-00969), 건강 연구를위한 마이클 스미스 재단 (SCH-2020-0559), 및 브리티시 컬럼비아 대학의 대학에 의해 지원되었다.

1. 올리고뉴클레오티드 라벨링 및 혼성화
<ol><li>단백질 G 이황화물 결합 감소<ol>
<li>1mL의 초순수에 10 mg의 단백질 G(ProtG)를 녹입니다. 참고: 여기에 단백질 G는 C-terminus및 N-종자 폴리 히스티딘 꼬리표에 있는 단 하나 시스테인 잔류물로 변형됩니다.</li>
		<li>완충 교환≥20 μL 의 ProtG (10 mg/mL)를 P6 컬럼이있는 1 x PBS (pH 7.2)로 합니다.</li>
		<li>완충교환 후 단백질 농도를 측정한다. 참고...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

접착 발자국 분석은 세포 압연 접착 시 PSGL-1과 P-selectin 사이의 분자 접착 이벤트를 시각화할 수 있습니다. 이 과정은 P-selectin 매개 캡처에 의해 시작되며 유체 전단 응력하에서 압연됩니다. 실험 도중 잠재적인 문제점은 일반적으로 세포가 잘 굴러도 가난한 세포 압연 또는 누락된 형광 선트랙을 관련시킵니다. 이러한 문제는 문제 해결 테이블(표 1)에 나열된 프로토콜의 중요한 단계?...

롤링 접착 캐스케이드는 순환 세포가 혈관 벽을 따라 밧줄을 타고 굴리는 방법을 설명합니다1. 수동 압연은 주로 셀룰러 접착 분자 (CAM)1의 주요 클래스인 셀렉틴에 의해 매개됩니다. 혈액의 전단 흐름하에서, P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)을 발현하는 백혈구는 염증이 있는 내피 세포의 표면에 발현될 수 있는 P-selectin과 매우 일시적인 결합을 형성한다. 이 과정은 백혈구가 염증의 사이트로 이동하는 것이 중요합니다2. 또한, PSGL-1은 P-selectin3와의 교전시 압연 접착의 후속 회사 접착 단계를 발동할 수 있는 메카노감감충수용체이다.
CAM 기능에 영향을 미치는 유전 돌연변이는 백혈구 접착 결핍 (LAD)의 희귀 질환과 같은 면역 체계에 가혹하게 영향을 미칠 수 있으며, 압연을 중재하는 접착 분자의 오작동이 심각하게 면역 손상 된 개인4,5,6로 이어집니다. 또한, 순환 종양 세포는 유사한 압연 과정에 따라 이동하여 전이7,8로 이어지는 것으로 나타났다. 그러나 세포 압연은 빠르고 역동적이기 때문에 기존의 실험 적인 메카노생물학 방법은 세포 압연 중 분자 상호 작용을 연구하기에 적합하지 않습니다. 원자력 현미경 및 광학 트위저와 같은 단일 세포 및 단일 분자 조작 방법은 단일 분자 레벨9에서 PSGL-1과 P-selectin의 힘에 의존하는 상호 작용과 같은 분자 상호 작용을 연구할 수 있었지만, 세포 압연 중 살아있는 접착 이벤트를 조사하기에 적합하지 않습니다. 추가적으로, 시험관 내 특징의 상호 작용은 생체 내의 분자 접착에 관하여 질문에 직접 대답할 수 없습니다. 예를 들면, 세포가 그들의 네이티브 환경에서 작동할 때 어떤 분자 장력 범위는 생물학으로 관련있습니까? 접착제 역학 시뮬레이션10 또는 간단한 정상 상태 model11과 같은 계산 방법은 특정 분자 세부 사항과 롤링 거동에 미치는 영향을 캡처했지만 모델링 매개 변수 및 가정의 정확도에 크게 의존합니다. 견인력 현미경과 같은 그밖 기술은 세포 이동 도중 힘을 검출할 수 있습니다 그러나 분자 장력에 충분한 공간 해상도 또는 정량적인 정보를 제공하지 않습니다. 이러한 기술 중 어느 것도 자신의 네이티브 환경에서 세포 기능 및 행동과 직접 관련이 분자 력의 측두역학, 공간 분포 및 크기 이질성의 직접적인 실험 적 관찰을 제공 할 수 없습니다.
따라서 선택 매개 상호 작용을 정확하게 측정할 수 있는 분자력 센서를 구현하는 것은 압연 접착에 대한 이해를 향상시키는 데 매우 중요합니다. 여기서는 PSGL-1 코팅 구슬이 p-selectin 기능화 장력 게이지 테더(TGT)13을 제시하는 표면에 압연되는 접착 발자국 분석12프로토콜을 설명합니다. 이 TGT는 형광 판독의 형태로 파열 사건의 영구적 인 역사를 초래 돌이킬 수없는 DNA 기반 힘 센서입니다. 이는 TGT(dsDNA)의 파열과 형광으로 표기된 보완 가닥으로 파열된 TGT(ssDNA)의 후속 라벨링을 통해 달성된다. 이 시스템의 한 가지 주요 장점은 회절 제한 및 초해상도 이미징과의 호환성입니다. 형광으로 표지된 보완 적 가닥은 DNA PAINT를 통한 초분해능 이미징을 위해 회절 제한 이미징 또는 과도 바인딩(7-9bp)에 영구적으로 > 결합될 수 있다. 이것은 TG가 활성 압연 도중 파열되기 때문에 압연 접착을 연구하기 위한 이상적인 시스템입니다, 그러나 형광 판독은 압연 후 분석됩니다. 두 가지 이미징 방법은 또한 사용자에게 압연 접착력을 조사할 수 있는 더 많은 자유를 제공합니다. 전형적으로, 회절 제한 화상 진찰은 형광 강도를 통해 분자 파열 력을 추출하는 데 유용하지만, 초해상도 이미징은 수용체 밀도의 정량적 분석을 허용한다. 압연 접착의 이러한 특성을 조사하는 기능으로, 이 접근법은 전단 흐름 하에서 압연 세포의 분자 접착에 대한 강제 조절 메커니즘을 이해하기 위한 유망한 플랫폼을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

셀렉틴 매개 상호 작용에 의해 촉진되는 압연 접착은 염증 부위에 백혈구를 모집하는 데 매우 역동적이고 수동적인 운동성입니다. 이 현상은 혈액 흐름이 내피 세포에 압연 운동에 백혈구를 밀어 하는 포스트 모세관 정맥에서 발생합니다. 안정적인 롤링은 접착 결합 형성과 기계적으로 구동되는 해리 사이의 섬세한 균형을 필요로 하며, 이는 셀이 흐름 방향으로 굴러가면서 표면에 부착된 상태를 유지할 수 있도록 합니다. 상대적으로 정적 환경에서 발생하는 다른 접착 공정과 달리 압연 세포가 초당 수십 미크론에서 수천 미크론을 이동함에 따라 압연 접착력이 매우 역동적입니다. 따라서, 견인력 현미경검사법과 같은 종래의 메카노생물학 방법은 짧은 시간 스케일 및 고감도로 인해 개별 접착 이벤트 및 관련 분자력을 측정하기에 적합하지 않다. 여기서는 P-selectin: PSGL-1 상호작용을 분자 수준에서 롤링 접착을 이미지화하기 위한 접착 발자국 분석의 최신 구현을 설명합니다. 이 방법은 돌이킬 수 없는 DNA 기반 장력 게이지 테더를 사용하여 형광 트랙의 형태로 분자 접착 이벤트의 영구 역사를 생성합니다. 이 트랙은 두 가지 방법으로 이미지화 될 수있다 : (1) 큰 시야를 생성하기 위해 회절 제한 이미지의 수천을 함께 스티치, 길이의 수천 미크론을 통해 각 롤링 셀의 접착 발자국의 추출을 가능하게, (2) DNA-PAINT를 수행하여 작은 시야 내에서 형광 트랙의 초해상도 이미지를 재구성. 이 연구에서는, 접착 발자국 분석은 다른 전단 응력에서 압연하는 HL-60 세포를 연구하기 위하여 이용되었습니다. 이 과정에서 우리는 P-셀렉틴의 공간 분포를 이미지화할 수 있었습니다: PSGL-1 상호 작용및 형광 강도를 통해 그들의 분자 력에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다. 따라서, 이러한 방법은 분자 수준에서 압연 접착에 관여하는 다양한 세포 표면 상호작용의 정량적 조사를 위한 기초를 제공한다.

위의 프로토콜은 접착 발자국 분석기의 실험 적 절차를 설명합니다. 일반적인 실험 워크플로우는 도 1, 유량 챔버 어셈블리(도 1A)에서 표면 기능화(도 1B) 및 실험 및 이미징 단계(도 1C)에 도시되어 있다.
도 2 는 ProtG-ssDNA 생체 경련 특성화에 대한 대표적인 결과입니...

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Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

이 프로토콜은 분자 력과 세포 압연 거동 사이의 연결을 확립하는 데 도움이 되며, 공간적으로 매핑하고 분자 수준에서 압연 접착력을 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 우리가 생리 관련 분자 접착력을 직접 측정할 수 있도록 실제 세포 압연 도중 개별 접착 이벤트를 연구할 수 있습니다. 각 단계에서 적절한 농도 및 배양 시간을 이용한 표면 제제는 고품질 표면 기능화를 달성하는 데 매우 중요합니다.생체 경련과 적절한 조건의 품질도 중요합니다. 시각적 데모는 연구원이 이 프로토콜을 복제하는 데 매우 중요합니다. 특히, 유량 챔버 어셈블리 및 후처리 이미지와 같은 단계는 시각적 데모에서 큰 이점을 얻을 것이다.먼저 면도날로 양면 테이프의 양쪽에 소량의 에폭시를 얇게 퍼뜨리는 것으로 시작합니다. 레이저를 사용하여 에폭시 코팅 테이프를 잘라 4개의 채널을 만듭니다. 4홀 슬라이드와 PEG 커버슬립 사이에 에폭시 테이프를 끼여 유동 칩을 만듭니다.파이펫 팁을 사용하여 채널 의 길이에 따라 부드러운 압력을 가하여 좋은 씰을 만든 다음 에폭시를 최소 1 시간 동안 치료하십시오. 칩을 정렬하여 각 채널의 개구부가 어댑터의 중심에 배치되도록 합니다. 그런 다음 두 개의 투명한 아크릴 스페이서를 칩 위에 놓습니다.블록 의 중간에 단단한 압력을 적용하고 각 스페이서의 끝에 나사. 입구를 브래킷 의 반대편에 있는 나사 구멍에 나사로 넣고 투명 아크릴 블록을 통해 밀봉 상태를 모니터링합니다. 누출을 확인하기 위해 챔버에 세척 버퍼 200 마이크로 리터를 플로우합니다.거품이 채널에 형성되면, 적극적으로 거품을 제거하기 위해 세척 버퍼의 추가 200 마이크로 리터를 밀어. 비특이적 결합을 방지하고 습도 챔버에서 10 분 동안 배양하기 위해 흐름 챔버에 BSA의 40 마이크로 리터를 추가합니다. 인큐베이션 후, Tween 20에서 40 마이크로리터를 유량 챔버에 추가하고 10분 동안 다시 배양하여 비특이적 결합을 더욱 줄입니다.그런 다음 모든 통과제를 제거하기 위해 200 마이크로 리터의 세척 버퍼로 채널을 세척합니다. 챔버 표면 기능화를 위해, 스테레타비딘의 40 마이크로 리터를 유량 챔버에 추가하고 20 분 동안 배양 한 다음 200 마이크로 리터의 세척 버퍼로 챔버를 세척하십시오. 이제 40 마이크로리터의 혼성 단백질 G-TGT를 유량 챔버에 추가하고 20분 동안 배양합니다.세척 버퍼로 세척한 후, 40 마이크로리터의 단백질 G-TGT 상단 가닥을 추가하고 20분 동안 배양하여 표면에 비혼TGT 바닥 가닥을 완성한 다음 세척 버퍼로 세척합니다. 마지막으로, P-selectin-Fc 의 40 마이크로리터를 유량 챔버에 넣고 세척 버퍼로 세척하기 전에 60 분 동안 배양하십시오. 롤링 버퍼로 5 밀리리터 유리 주사기를 채우고 주사기의 측면을 탭하여 벗겨내고 끝을 향해 떠있는 거품을 밀어 내립니다.멸균 바늘을 폴리에틸렌 튜브 200mm 조각에 삽입한 후 바늘을 유리 주사기에 연결합니다. 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 플런저 측이 상승하여 기포가 채널에 유입되는 것을 방지하기 위해 주사기 펌프를 기울입니다. 튜브의 끝을 유량 챔버 입구에 삽입합니다.폴리에틸렌 튜브의 또 다른 200밀리미터 조각의 한쪽 끝을 콘센트에 넣고 다른 쪽 끝을 폐기물 비커에 담급다. 세포 현탁액 샘플과 원심분리기의 1~2밀리리터를 복용하여 세포를 펠릿합니다. 배지를 제거하고 롤링 버퍼의 500 마이크로리터에서 셀을 부드럽게 다시 분리합니다.조심스럽게 유입구와 출구및 파이펫 40 마이크로리터의 튜브를 유량 챔버로 분리한다. 이전에 설명된 대로 튜브를 다시 연결하여 거품이 흐름 채널에 도입되지 않도록 합니다. 원하는 유량에서 주사기 펌프를 시작하여 셀 롤링 실험을 시작합니다.10X 목표를 가진 암조 현미경을 사용하여 세포 압연을 관찰하십시오. 실험이 완료되면 표면이 셀이 없는 때까지 시간당 100 밀리리터의 롤링 버퍼를 주입하여 채널에서 셀을 제거합니다. DNA-PAINT에 의한 로컬 트랙을 이미징하려면 DNA-PAINT 버퍼로 제조된 DNA-PAINT 이미저 가닥 40마이크로리터를 채널에 추가합니다.텍스트 원고에 언급 된 조건을 사용하여 총 내부 반사 형광 현미경 검사를 수행합니다. 슈퍼 해상도 이미지를 현지화하고 렌더링합니다. 영구 라벨링을 통해 긴 트랙을 이미징하려면 영구 이미저 가닥을 추가하고 T50M5 버퍼에서 120초 동안 배양합니다.그런 다음 200 마이크로리터의 세척 버퍼를 주입하여 채널을 세척합니다. 배경 카메라 소음을 얻기 위해 흥분 레이저끄기로 이미지를 기록합니다. TIRF 현미경 검사법에 의해 그리드 패턴의 넓은 영역을 이미지합니다.현미경을 프로그래밍하여 400x 50 개의 이미지를 스캔하고 ImageJ 프로그램을 사용하여 최대 10, 000 이미지를 포함하는 개별 TIP 파일로 원시 데이터를 분할합니다. 조명 프로파일을 사용하여 모든 이미지를 평평하게 하고 MIST 플러그인을 사용하여 이미지를 스티치합니다. 단백질 G ssDNA 바이오 컨쥬게이션 특성화의 결과는 거의 하나의 단백질 G대 ssDNA 단백질을 나타내었으며, 여기서 단백질 G 말레니미드 ssDNA 및 이미다졸 용출 완충스펙트럼은 생체 경련 제품 스펙트럼에 맞추기 위한 직교 기초로부터이다.네이티브 PAGE는 성공적인 결합과 좋은 수율을 나타내는 단황 단백질 G 밴드와 일치하는 밝은 녹색 밴드를 보여주는 바이오 컨쥬게이션을 확인하는 데 사용되었다. 단일 모드 섬유에서 도입된 TIRF 조명 프로파일은 일반적으로 시야 중간에 더 밝고 가장자리 주위의 조광체입니다. 고르지 않은 조명을 보정하고 정량 적 분석을 위해 이미지를 평평하게하기 위해 조명 프로파일은 수천 개의 개별 프레임을 평균화하여 결정되었습니다.평평한 이미지는 원시 프로파일과 조명 프로파일 모두에서 카메라 노이즈를 빼고 조명 프로파일에 의해 정상화하여 생성되었습니다. 원시 스티치는 수정되지 않은 이미지에 대응하는 명확한 주기적인 패턴을 보였으며 평평한 이미지에서 바느질된 동일한 시야가 평평한 배경을 생성했습니다. 램프 업 유동 프로파일은 전단 응력의 범위를 결정하여 세포 압연 및 항복 형광 트랙을 결정하는 데 사용되었으며, 이 중 일반적인 단세포 접착 발자국이 볼 수 있었습니다.대비가 부족한 형광트랙의 최적이고 최적의 결과, 과도한 트랙 밀도, 최적의 트랙 밀도 및 대비, 및 회절 제한 및 DNA-PAINT 이미징이 표시됩니다. 60분 이상의 인큐베이션 시간은 표면 기능화를 보장하고 적절한 챔버 구조는 기능성 표면을 손상시키는 기포의 통행을 방지합니다. 이 절차는 압연 접착에 관여하는 분자력의 정량적 분석에 적용 가능하며 연구원이 다른 세포 유형의 압연 거동을 이해할 수 있게 합니다.이 기술은 연구원이 단 하나 분자 및 mechanobiology 연구의 추가 발전으로 이끌어 내는 빠른 접착 사건에 관하여 새로운 질문을 탐구하는 것을 허용합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

S. cerevisiae의의 접착 및 아가르 침략을위한 분석

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

연구

생물학

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

주최자 및 동물 폴 Explants Xenopus laevis의 태아로부터 세포 접착 분석의 총회의 해부

Title Cell Encapsulation by Droplets

흩뿌려진의 제목 셀 캡슐화

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

CA의 역할을 평가하기위한 영상 분석을 라이브<sup&gt; 2 +</sup기공 형성 독소 상처의 수리에&gt;와 Sphingomyelinase

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

마우스에 유산소 운동에 의해 자식 작용을 활성화

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...