Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

이 작품은 캐나다 혁신 재단 (CFI 35492), 캐나다 디스커버리 그랜트의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (RGPIN-2017-04407), 연구 기금의 뉴 프론티어 (NFRFE-2018-00969), 건강 연구를위한 마이클 스미스 재단 (SCH-2020-0559), 및 브리티시 컬럼비아 대학의 대학에 의해 지원되었다.

1. 올리고뉴클레오티드 라벨링 및 혼성화
<ol><li>단백질 G 이황화물 결합 감소<ol>
<li>1mL의 초순수에 10 mg의 단백질 G(ProtG)를 녹입니다. 참고: 여기에 단백질 G는 C-terminus및 N-종자 폴리 히스티딘 꼬리표에 있는 단 하나 시스테인 잔류물로 변형됩니다.</li>
		<li>완충 교환≥20 μL 의 ProtG (10 mg/mL)를 P6 컬럼이있는 1 x PBS (pH 7.2)로 합니다.</li>
		<li>완충교환 후 단백질 농도를 측정한다. 참고...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

접착 발자국 분석은 세포 압연 접착 시 PSGL-1과 P-selectin 사이의 분자 접착 이벤트를 시각화할 수 있습니다. 이 과정은 P-selectin 매개 캡처에 의해 시작되며 유체 전단 응력하에서 압연됩니다. 실험 도중 잠재적인 문제점은 일반적으로 세포가 잘 굴러도 가난한 세포 압연 또는 누락된 형광 선트랙을 관련시킵니다. 이러한 문제는 문제 해결 테이블(표 1)에 나열된 프로토콜의 중요한 단계?...

롤링 접착 캐스케이드는 순환 세포가 혈관 벽을 따라 밧줄을 타고 굴리는 방법을 설명합니다1. 수동 압연은 주로 셀룰러 접착 분자 (CAM)1의 주요 클래스인 셀렉틴에 의해 매개됩니다. 혈액의 전단 흐름하에서, P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)을 발현하는 백혈구는 염증이 있는 내피 세포의 표면에 발현될 수 있는 P-selectin과 매우 일시적인 결합을 형성한다. 이 과정은 백혈구가 염증의 사이트로 이동하는 것이 중요합니다2. 또한, PSGL-1은 P-selectin3와의 교전시 압연 접착의 후속 회사 접착 단계를 발동할 수 있는 메카노감감충수용체이다.
CAM 기능에 영향을 미치는 유전 돌연변이는 백혈구 접착 결핍 (LAD)의 희귀 질환과 같은 면역 체계에 가혹하게 영향을 미칠 수 있으며, 압연을 중재하는 접착 분자의 오작동이 심각하게 면역 손상 된 개인4,5,6로 이어집니다. 또한, 순환 종양 세포는 유사한 압연 과정에 따라 이동하여 전이7,8로 이어지는 것으로 나타났다. 그러나 세포 압연은 빠르고 역동적이기 때문에 기존의 실험 적인 메카노생물학 방법은 세포 압연 중 분자 상호 작용을 연구하기에 적합하지 않습니다. 원자력 현미경 및 광학 트위저와 같은 단일 세포 및 단일 분자 조작 방법은 단일 분자 레벨9에서 PSGL-1과 P-selectin의 힘에 의존하는 상호 작용과 같은 분자 상호 작용을 연구할 수 있었지만, 세포 압연 중 살아있는 접착 이벤트를 조사하기에 적합하지 않습니다. 추가적으로, 시험관 내 특징의 상호 작용은 생체 내의 분자 접착에 관하여 질문에 직접 대답할 수 없습니다. 예를 들면, 세포가 그들의 네이티브 환경에서 작동할 때 어떤 분자 장력 범위는 생물학으로 관련있습니까? 접착제 역학 시뮬레이션10 또는 간단한 정상 상태 model11과 같은 계산 방법은 특정 분자 세부 사항과 롤링 거동에 미치는 영향을 캡처했지만 모델링 매개 변수 및 가정의 정확도에 크게 의존합니다. 견인력 현미경과 같은 그밖 기술은 세포 이동 도중 힘을 검출할 수 있습니다 그러나 분자 장력에 충분한 공간 해상도 또는 정량적인 정보를 제공하지 않습니다. 이러한 기술 중 어느 것도 자신의 네이티브 환경에서 세포 기능 및 행동과 직접 관련이 분자 력의 측두역학, 공간 분포 및 크기 이질성의 직접적인 실험 적 관찰을 제공 할 수 없습니다.
따라서 선택 매개 상호 작용을 정확하게 측정할 수 있는 분자력 센서를 구현하는 것은 압연 접착에 대한 이해를 향상시키는 데 매우 중요합니다. 여기서는 PSGL-1 코팅 구슬이 p-selectin 기능화 장력 게이지 테더(TGT)13을 제시하는 표면에 압연되는 접착 발자국 분석12프로토콜을 설명합니다. 이 TGT는 형광 판독의 형태로 파열 사건의 영구적 인 역사를 초래 돌이킬 수없는 DNA 기반 힘 센서입니다. 이는 TGT(dsDNA)의 파열과 형광으로 표기된 보완 가닥으로 파열된 TGT(ssDNA)의 후속 라벨링을 통해 달성된다. 이 시스템의 한 가지 주요 장점은 회절 제한 및 초해상도 이미징과의 호환성입니다. 형광으로 표지된 보완 적 가닥은 DNA PAINT를 통한 초분해능 이미징을 위해 회절 제한 이미징 또는 과도 바인딩(7-9bp)에 영구적으로 > 결합될 수 있다. 이것은 TG가 활성 압연 도중 파열되기 때문에 압연 접착을 연구하기 위한 이상적인 시스템입니다, 그러나 형광 판독은 압연 후 분석됩니다. 두 가지 이미징 방법은 또한 사용자에게 압연 접착력을 조사할 수 있는 더 많은 자유를 제공합니다. 전형적으로, 회절 제한 화상 진찰은 형광 강도를 통해 분자 파열 력을 추출하는 데 유용하지만, 초해상도 이미징은 수용체 밀도의 정량적 분석을 허용한다. 압연 접착의 이러한 특성을 조사하는 기능으로, 이 접근법은 전단 흐름 하에서 압연 세포의 분자 접착에 대한 강제 조절 메커니즘을 이해하기 위한 유망한 플랫폼을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

셀렉틴 매개 상호 작용에 의해 촉진되는 압연 접착은 염증 부위에 백혈구를 모집하는 데 매우 역동적이고 수동적인 운동성입니다. 이 현상은 혈액 흐름이 내피 세포에 압연 운동에 백혈구를 밀어 하는 포스트 모세관 정맥에서 발생합니다. 안정적인 롤링은 접착 결합 형성과 기계적으로 구동되는 해리 사이의 섬세한 균형을 필요로 하며, 이는 셀이 흐름 방향으로 굴러가면서 표면에 부착된 상태를 유지할 수 있도록 합니다. 상대적으로 정적 환경에서 발생하는 다른 접착 공정과 달리 압연 세포가 초당 수십 미크론에서 수천 미크론을 이동함에 따라 압연 접착력이 매우 역동적입니다. 따라서, 견인력 현미경검사법과 같은 종래의 메카노생물학 방법은 짧은 시간 스케일 및 고감도로 인해 개별 접착 이벤트 및 관련 분자력을 측정하기에 적합하지 않다. 여기서는 P-selectin: PSGL-1 상호작용을 분자 수준에서 롤링 접착을 이미지화하기 위한 접착 발자국 분석의 최신 구현을 설명합니다. 이 방법은 돌이킬 수 없는 DNA 기반 장력 게이지 테더를 사용하여 형광 트랙의 형태로 분자 접착 이벤트의 영구 역사를 생성합니다. 이 트랙은 두 가지 방법으로 이미지화 될 수있다 : (1) 큰 시야를 생성하기 위해 회절 제한 이미지의 수천을 함께 스티치, 길이의 수천 미크론을 통해 각 롤링 셀의 접착 발자국의 추출을 가능하게, (2) DNA-PAINT를 수행하여 작은 시야 내에서 형광 트랙의 초해상도 이미지를 재구성. 이 연구에서는, 접착 발자국 분석은 다른 전단 응력에서 압연하는 HL-60 세포를 연구하기 위하여 이용되었습니다. 이 과정에서 우리는 P-셀렉틴의 공간 분포를 이미지화할 수 있었습니다: PSGL-1 상호 작용및 형광 강도를 통해 그들의 분자 력에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다. 따라서, 이러한 방법은 분자 수준에서 압연 접착에 관여하는 다양한 세포 표면 상호작용의 정량적 조사를 위한 기초를 제공한다.

위의 프로토콜은 접착 발자국 분석기의 실험 적 절차를 설명합니다. 일반적인 실험 워크플로우는 도 1, 유량 챔버 어셈블리(도 1A)에서 표면 기능화(도 1B) 및 실험 및 이미징 단계(도 1C)에 도시되어 있다.
도 2 는 ProtG-ssDNA 생체 경련 특성화에 대한 대표적인 결과입니...

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Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

이 프로토콜은 분자 력과 세포 압연 거동 사이의 연결을 확립하는 데 도움이 되며, 공간적으로 매핑하고 분자 수준에서 압연 접착력을 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 우리가 생리 관련 분자 접착력을 직접 측정할 수 있도록 실제 세포 압연 도중 개별 접착 이벤트를 연구할 수 있습니다. 각 단계에서 적절한 농도 및 배양 시간을 이용한 표면 제제는 고품질 표면 기능화를 달성하는 데 매우 중요합니다.생체 경련과 적절한 조건의 품질도 중요합니다. 시각적 데모는 연구원이 이 프로토콜을 복제하는 데 매우 중요합니다. 특히, 유량 챔버 어셈블리 및 후처리 이미지와 같은 단계는 시각적 데모에서 큰 이점을 얻을 것이다.먼저 면도날로 양면 테이프의 양쪽에 소량의 에폭시를 얇게 퍼뜨리는 것으로 시작합니다. 레이저를 사용하여 에폭시 코팅 테이프를 잘라 4개의 채널을 만듭니다. 4홀 슬라이드와 PEG 커버슬립 사이에 에폭시 테이프를 끼여 유동 칩을 만듭니다.파이펫 팁을 사용하여 채널 의 길이에 따라 부드러운 압력을 가하여 좋은 씰을 만든 다음 에폭시를 최소 1 시간 동안 치료하십시오. 칩을 정렬하여 각 채널의 개구부가 어댑터의 중심에 배치되도록 합니다. 그런 다음 두 개의 투명한 아크릴 스페이서를 칩 위에 놓습니다.블록 의 중간에 단단한 압력을 적용하고 각 스페이서의 끝에 나사. 입구를 브래킷 의 반대편에 있는 나사 구멍에 나사로 넣고 투명 아크릴 블록을 통해 밀봉 상태를 모니터링합니다. 누출을 확인하기 위해 챔버에 세척 버퍼 200 마이크로 리터를 플로우합니다.거품이 채널에 형성되면, 적극적으로 거품을 제거하기 위해 세척 버퍼의 추가 200 마이크로 리터를 밀어. 비특이적 결합을 방지하고 습도 챔버에서 10 분 동안 배양하기 위해 흐름 챔버에 BSA의 40 마이크로 리터를 추가합니다. 인큐베이션 후, Tween 20에서 40 마이크로리터를 유량 챔버에 추가하고 10분 동안 다시 배양하여 비특이적 결합을 더욱 줄입니다.그런 다음 모든 통과제를 제거하기 위해 200 마이크로 리터의 세척 버퍼로 채널을 세척합니다. 챔버 표면 기능화를 위해, 스테레타비딘의 40 마이크로 리터를 유량 챔버에 추가하고 20 분 동안 배양 한 다음 200 마이크로 리터의 세척 버퍼로 챔버를 세척하십시오. 이제 40 마이크로리터의 혼성 단백질 G-TGT를 유량 챔버에 추가하고 20분 동안 배양합니다.세척 버퍼로 세척한 후, 40 마이크로리터의 단백질 G-TGT 상단 가닥을 추가하고 20분 동안 배양하여 표면에 비혼TGT 바닥 가닥을 완성한 다음 세척 버퍼로 세척합니다. 마지막으로, P-selectin-Fc 의 40 마이크로리터를 유량 챔버에 넣고 세척 버퍼로 세척하기 전에 60 분 동안 배양하십시오. 롤링 버퍼로 5 밀리리터 유리 주사기를 채우고 주사기의 측면을 탭하여 벗겨내고 끝을 향해 떠있는 거품을 밀어 내립니다.멸균 바늘을 폴리에틸렌 튜브 200mm 조각에 삽입한 후 바늘을 유리 주사기에 연결합니다. 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 플런저 측이 상승하여 기포가 채널에 유입되는 것을 방지하기 위해 주사기 펌프를 기울입니다. 튜브의 끝을 유량 챔버 입구에 삽입합니다.폴리에틸렌 튜브의 또 다른 200밀리미터 조각의 한쪽 끝을 콘센트에 넣고 다른 쪽 끝을 폐기물 비커에 담급다. 세포 현탁액 샘플과 원심분리기의 1~2밀리리터를 복용하여 세포를 펠릿합니다. 배지를 제거하고 롤링 버퍼의 500 마이크로리터에서 셀을 부드럽게 다시 분리합니다.조심스럽게 유입구와 출구및 파이펫 40 마이크로리터의 튜브를 유량 챔버로 분리한다. 이전에 설명된 대로 튜브를 다시 연결하여 거품이 흐름 채널에 도입되지 않도록 합니다. 원하는 유량에서 주사기 펌프를 시작하여 셀 롤링 실험을 시작합니다.10X 목표를 가진 암조 현미경을 사용하여 세포 압연을 관찰하십시오. 실험이 완료되면 표면이 셀이 없는 때까지 시간당 100 밀리리터의 롤링 버퍼를 주입하여 채널에서 셀을 제거합니다. DNA-PAINT에 의한 로컬 트랙을 이미징하려면 DNA-PAINT 버퍼로 제조된 DNA-PAINT 이미저 가닥 40마이크로리터를 채널에 추가합니다.텍스트 원고에 언급 된 조건을 사용하여 총 내부 반사 형광 현미경 검사를 수행합니다. 슈퍼 해상도 이미지를 현지화하고 렌더링합니다. 영구 라벨링을 통해 긴 트랙을 이미징하려면 영구 이미저 가닥을 추가하고 T50M5 버퍼에서 120초 동안 배양합니다.그런 다음 200 마이크로리터의 세척 버퍼를 주입하여 채널을 세척합니다. 배경 카메라 소음을 얻기 위해 흥분 레이저끄기로 이미지를 기록합니다. TIRF 현미경 검사법에 의해 그리드 패턴의 넓은 영역을 이미지합니다.현미경을 프로그래밍하여 400x 50 개의 이미지를 스캔하고 ImageJ 프로그램을 사용하여 최대 10, 000 이미지를 포함하는 개별 TIP 파일로 원시 데이터를 분할합니다. 조명 프로파일을 사용하여 모든 이미지를 평평하게 하고 MIST 플러그인을 사용하여 이미지를 스티치합니다. 단백질 G ssDNA 바이오 컨쥬게이션 특성화의 결과는 거의 하나의 단백질 G대 ssDNA 단백질을 나타내었으며, 여기서 단백질 G 말레니미드 ssDNA 및 이미다졸 용출 완충스펙트럼은 생체 경련 제품 스펙트럼에 맞추기 위한 직교 기초로부터이다.네이티브 PAGE는 성공적인 결합과 좋은 수율을 나타내는 단황 단백질 G 밴드와 일치하는 밝은 녹색 밴드를 보여주는 바이오 컨쥬게이션을 확인하는 데 사용되었다. 단일 모드 섬유에서 도입된 TIRF 조명 프로파일은 일반적으로 시야 중간에 더 밝고 가장자리 주위의 조광체입니다. 고르지 않은 조명을 보정하고 정량 적 분석을 위해 이미지를 평평하게하기 위해 조명 프로파일은 수천 개의 개별 프레임을 평균화하여 결정되었습니다.평평한 이미지는 원시 프로파일과 조명 프로파일 모두에서 카메라 노이즈를 빼고 조명 프로파일에 의해 정상화하여 생성되었습니다. 원시 스티치는 수정되지 않은 이미지에 대응하는 명확한 주기적인 패턴을 보였으며 평평한 이미지에서 바느질된 동일한 시야가 평평한 배경을 생성했습니다. 램프 업 유동 프로파일은 전단 응력의 범위를 결정하여 세포 압연 및 항복 형광 트랙을 결정하는 데 사용되었으며, 이 중 일반적인 단세포 접착 발자국이 볼 수 있었습니다.대비가 부족한 형광트랙의 최적이고 최적의 결과, 과도한 트랙 밀도, 최적의 트랙 밀도 및 대비, 및 회절 제한 및 DNA-PAINT 이미징이 표시됩니다. 60분 이상의 인큐베이션 시간은 표면 기능화를 보장하고 적절한 챔버 구조는 기능성 표면을 손상시키는 기포의 통행을 방지합니다. 이 절차는 압연 접착에 관여하는 분자력의 정량적 분석에 적용 가능하며 연구원이 다른 세포 유형의 압연 거동을 이해할 수 있게 합니다.이 기술은 연구원이 단 하나 분자 및 mechanobiology 연구의 추가 발전으로 이끌어 내는 빠른 접착 사건에 관하여 새로운 질문을 탐구하는 것을 허용합니다.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

S. cerevisiae의의 접착 및 아가르 침략을위한 분석

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

연구

생물학

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

주최자 및 동물 폴 Explants Xenopus laevis의 태아로부터 세포 접착 분석의 총회의 해부

Title Cell Encapsulation by Droplets

흩뿌려진의 제목 셀 캡슐화

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

CA의 역할을 평가하기위한 영상 분석을 라이브<sup&gt; 2 +</sup기공 형성 독소 상처의 수리에&gt;와 Sphingomyelinase

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

마우스에 유산소 운동에 의해 자식 작용을 활성화

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...