Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) og University of British Columbia Eminence Fund.

1. Oligonukleotid merking og hybridisering
<ol><li>Reduksjon av protein G disulfidbindinger<ol>
<li>Løs opp 10 mg Protein G (ProtG) i 1 ml ultrarent vann. MERK: Protein G her er modifisert med en enkelt cysteinrester ved C-terminus og en N-terminus poly-histidin tag.</li>
		<li>Bufferutveksling ≥20 μL ProtG (10 mg/ml) til 1x PBS (pH 7,2) med en P6-kolonne.</li>
		<li>Mål proteinkonsentrasjonen etter bufferutveksling. MERK: Typisk konsentrasjon på 7-8 mg/ml.</li>
		<li>Forbered 120 mM Tris(2...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

Adhesjonsfotavtrykksanalysen muliggjør visualisering av molekylære vedheftshendelser mellom PSGL-1 og P-selectin under cellerulling. Denne prosessen er initiert av P-selectin-mediert fangst etterfulgt av rullende under fluidisk skjær stress. Potensielle problemer under eksperimentet innebærer vanligvis dårlig cellerulling eller manglende fluorescerende spor selv når cellene ruller godt. Disse problemene skyldes ofte kvalitetskontroller ved de kritiske trinnene i protokollen, som oppført i feilsøkingstabellen (<st...

Den rullende vedheftkaskaden beskriver hvordan sirkulerende celler tether til og ruller langs blodkarveggen1. Passiv rulling formidles primært av selectins, en stor klasse av cellulære vedheftsmolekyler (CAMs)1. Under skjærstrømmen av blod danner leukocytter som uttrykker P-selectin glykoprotein ligand-1 (PSGL-1) svært forbigående bindinger med P-selectin, som kan uttrykkes på overflaten av betente endotelceller. Denne prosessen er kritisk for leukocytter å migrere til et sted med betennelse2. I tillegg er PSGL-1 også en mekanosensitiv reseptor som er i stand til å utløse det påfølgende faste vedheftsstadiet av den rullende vedheftkaskaden ved sitt engasjement med P-selectin3.
Genetiske mutasjoner som påvirker CAM-funksjonen kan ha stor innvirkning på immunforsvaret, for eksempel ved den sjeldne sykdommen leukocyttadhesjonsmangel (LAD), der funksjonsfeil i vedheftmolekyler som formidler rullende fører til alvorlig immunkompromitterte individer4,5,6. I tillegg har sirkulerende tumorceller vist seg å migrere etter en lignende rulleprosess, noe som fører til metastase7,8. Men fordi cellerulling er rask og dynamisk, er konvensjonelle eksperimentelle mekanobiologimetoder uegnet til å studere molekylære interaksjoner under cellerulling. Mens enkeltcellede og enkeltmolekylelle manipulasjonsmetoder som atomkraftmikroskopi og optisk pinsett var i stand til å studere molekylære interaksjoner som P-selectins kraftavhengige interaksjon med PSGL-1 på enkeltmolekylnivå9, er de uegnet til å undersøke levende vedheftshendelser under cellerulling. I tillegg kan interaksjonen karakterisert in vitro ikke svare direkte på spørsmålet om molekylær vedheft in vivo. For eksempel, hvilket molekylært spenningsområde er biologisk relevant når celler fungerer i sitt opprinnelige miljø? Beregningsmetoder som limdynamikksimulering10 eller enkel steady-state model11 har fanget visse molekylære detaljer og hvordan de påvirker rullende oppførsel, men er svært avhengige av nøyaktigheten av modelleringsparametrene og antagelsene. Andre teknikker som trekkraftmikroskopi kan oppdage krefter under cellemigrering, men gir ikke tilstrekkelig romlig oppløsning eller kvantitativ informasjon om molekylær spenning. Ingen av disse teknikkene kan gi direkte eksperimentelle observasjoner av den tidsmessige dynamikken, romlig fordeling og størrelsen heterogenitet av molekylære krefter, som direkte relaterer seg til cellefunksjon og oppførsel i sitt opprinnelige miljø.
Derfor er implementering av en molekylær kraftsensor som er i stand til nøyaktig måling av selectin-medierte interaksjoner avgjørende for å forbedre vår forståelse av rullende vedheft. Her beskriver vi protokollen for adhesjonsfotavtrykket assay12 der PSGL-1 belagte perler rulles på en overflate som presenterer p-selectin funksjonaliserte spenningsmålerte tthers (TGTs)13. Disse TGTene er irreversible DNA-baserte kraftsensorer som resulterer i en permanent historie med bruddhendelser i form av fluorescensavlesning. Dette oppnås gjennom rupturing av TGT (dsDNA) og deretter etterfølgende merking av ruptured TGT (ssDNA) med en fluorescerende merket komplementær tråd. En stor fordel med dette systemet er kompatibiliteten med både diffraksjonsbegrenset og superoppløsningsavbildning. Den fluorescerende merkede komplementære tråden kan enten være permanent bundet (>12 bp) for diffraksjonsbegrenset avbildning eller forbigående bundet (7-9 bp) for bildebehandling med superoppløsning gjennom DNA PAINT. Dette er et ideelt system for å studere rullende vedheft da TGT-ene brister under aktiv rulling, men fluorescensavlesningen analyseres etter rulling. De to avbildningsmetodene gir også brukeren mer frihet til å undersøke rullende vedheft. Vanligvis er diffraksjonsbegrenset avbildning nyttig for å trekke ut molekylær bruddkraft gjennom fluorescensintensitet13, mens superoppløsningsavbildning gir kvantitativ analyse av reseptortetthet. Med evnen til å undersøke disse egenskapene til rullende vedheft, gir denne tilnærmingen en lovende plattform for å forstå kraftreguleringsmekanismen på molekylær vedheft av rullende celler under skjærstrøm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

Rullende vedheft, tilrettelagt av selectin-medierte interaksjoner, er en svært dynamisk, passiv motilitet i å rekruttere leukocytter til betennelsesstedet. Dette fenomenet forekommer i postkapillære venuler, hvor blodstrømmen skyver leukocytter i en rullende bevegelse på endotelcellene. Stabil rulling krever en delikat balanse mellom vedheftsbindingsdannelse og deres mekanisk drevne dissosiasjon, slik at cellen forblir festet til overflaten mens den ruller i strømningsretningen. I motsetning til andre vedheftsprosesser som forekommer i relativt statiske miljøer, er rullende vedheft svært dynamisk når rullecellene beveger seg over tusenvis av mikroner ved titalls mikron per sekund. Følgelig er konvensjonelle mekanobiologimetoder som trekkraftmikroskopi uegnet til å måle de enkelte vedheftshendelsene og de tilknyttede molekylære kreftene på grunn av den korte tidsskalaen og høy følsomhet som kreves. Her beskriver vi vår siste implementering av adhesjonsfotavtrykkanalysen for å avbilde P-selectin: PSGL-1-interaksjoner i rullende vedheft på molekylært nivå. Denne metoden benytter irreversible DNA-baserte spenningsmålere for å produsere en permanent historie med molekylære vedheftshendelser i form av fluorescensspor. Disse sporene kan avbildet på to måter: (1) sy sammen tusenvis av diffraksjonsbegrensede bilder for å produsere et stort synsfelt, noe som muliggjør utvinning av vedheftsfotavtrykk for hver rullende celle over tusenvis av mikroner i lengde, (2) utfører DNA-PAINT for å rekonstruere superoppløselige bilder av fluorescenssporene innenfor et lite synsfelt. I denne studien ble adhesjonsfotavtrykksanalysen brukt til å studere HL-60-celler som rullet på forskjellige skjærspenninger. Ved å gjøre det var vi i stand til å se for oss den romlige fordelingen av P-selectin: PSGL-1-interaksjonen og få innsikt i deres molekylære krefter gjennom fluorescensintensitet. Dermed gir denne metoden grunnlaget for den kvantitative undersøkelsen av de ulike celleoverflateinteraksjonene som er involvert i rullende vedheft på molekylært nivå.

Protokollen ovenfor beskriver den eksperimentelle prosedyren for adhesjonsfotavtrykkanalysen. Den generelle eksperimentarbeidsflyten er illustrert i figur 1, fra strømningskammerenheten (figur 1A) til overflatefunksjonaliseringen (figur 1B) og eksperiment- og bildetrinn (figur 1C).
Figur 2 er et representativt resultat for protG-ssDNA biokonjuge...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Denne protokollen presenterer eksperimentelle prosedyrer for å utføre vedheft fotavtrykk analysen for å avbilde vedheft hendelser under rask celle rullende vedheft.

Bildemolekylær vedheft i cellerulling ved adhesjonsfotavtrykkanalyse

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Denne protokollen bidrar til å etablere sammenhengen mellom molekylær kraft og cellerullingsatferd i tillegg til å tillate romlig kart og kvantifisere rullende vedheft på molekylært nivå. Denne teknikken gjør det mulig å studere individuelle vedheftshendelser under selve cellerullingen, slik at vi kan måle den fysiologiske relevante molekylære vedheftskraften direkte. Overflateforberedelse ved hjelp av riktig konsentrasjons- og inkubasjonstid i hvert trinn er avgjørende for å oppnå overflatefunksjonalisering av høy kvalitet.Kvaliteten på biokonjugasjoner og riktige forhold er også avgjørende. Visuell demonstrasjon er avgjørende for å hjelpe forskere med å gjenskape denne protokollen. Spesielt vil trinnene som flytkammermontering og etterbehandlingsbilder ha stor nytte av en visuell demonstrasjon.Begynn med å spre en liten mengde epoksy på begge sider av det dobbeltsidige båndet med et barberblad. Bruk en laser til å kutte det epoksybelagte båndet for å lage fire kanaler. Lag strømningsbrikken ved å smøre epoksytapen mellom en firehulls skyve og PEG-deksler.Bruk en pipettespiss, bruk forsiktig trykk langs lengden på kanalene for å skape en god forsegling, og herd deretter epoksyen i minst en time. Juster brikken slik at åpningen på hver kanal plasseres midt på adapteren. Plasser deretter to gjennomsiktige akryl avstandsstykker på toppen av brikken.Påfør fast trykk midt på blokken og skru i enden av hver avstandsstykke. Skru innløpene inn i de gjengede hullene på den andre siden av braketten og overvåk tetningsforholdet gjennom den gjennomsiktige akrylblokken. Strømning 200 mikroliter vaskebuffer inn i kammeret for å se etter lekkasje.Hvis det dannes bobler i kanalen, skyver du aggressivt ytterligere 200 mikroliter vaskebuffer for å fjerne boblene. Tilsett 40 mikroliter BSA i strømningskammeret for å forhindre ikke-spesifikk binding og inkubere i 10 minutter i fuktighetskammeret. Etter inkubasjon, tilsett 40 mikroliter ved Tween 20 til strømningskammeret og inkuber igjen i 10 minutter for å ytterligere redusere den uspesifiserte bindingen.Vask deretter kanalen med 200 mikroliter vaskebuffer for å fjerne alle passivasjonsmidler. For kammeroverflatefunksjonalisering, tilsett 40 mikroliter Streptavidin til strømningskammeret og inkuber i 20 minutter, vask deretter kammeret med 200 mikroliter vaskebuffer. Tilsett nå 40 mikroliter hybridisert protein G-TGT i strømningskammeret og inkuber i 20 minutter.Etter vask med vaskebuffer, tilsett 40 mikroliter protein G-TGT toppstreng og inkuber i 20 minutter for å fullføre en ukybridert TGT bunnstreng på overflaten og vask deretter med vaskebuffer. Til slutt legger du til 40 mikroliter P-selectin-Fc i strømningskammeret og inkuberer i 60 minutter før vask med vaskebuffer. Fyll en fem milliliter glasssprøyte med rullebufferen og trykk på sidene av sprøyten for å løsne og skyve boblene ut mens de flyter mot spissen.Etter å ha satt inn en steril nål i et 200 millimeter stykke polyetylenrør, koble nålen til glasssprøyten. Fest sprøyten på sprøytepumpen og vipp sprøytepumpen slik at stempelsiden er forhøyet for å forhindre at luftbobler kommer inn i kanalen. Sett enden av røret inn i strømningskammerets innløp.Sett den ene enden av et annet 200 millimeter stykke polyetylenrør inn i utløpet og senk den andre enden i et avfallsbeger. Ta en til to milliliter av cellefjæringsprøven og sentrifugen for å pellet cellene. Fjern mediet og resuspender cellene forsiktig i 500 mikroliter av rullebufferen.Koble slangen forsiktig fra innløpene og utløpet og pipetten 40 mikroliter av cellefjæringen inn i strømningskammeret. Koble til slangen igjen som beskrevet tidligere, slik at bobler ikke blir introdusert i strømningskanalen. Start cellerullingseksperimentet ved å starte sprøytepumpen ved ønsket strømningshastighet.Observer cellerulling ved hjelp av et mørkt feltmikroskop med et 10X mål. Når eksperimentet er fullført, fjerner du cellene fra kanalen ved å infundere rullebufferen ved 100 milliliter per time til overflaten er cellefri. For avbildning av de lokale sporene med DNA-PAINT, tilsett 40 mikroliter DNA-PAINT imager strand fremstilt i DNA-PAINT buffer til kanalen.Utfør total intern refleksjon fluorescensmikroskopi ved hjelp av forholdene som er nevnt i tekstmanuskriptet. Lokaliser og gjengi superoppløsningsbildene. For å forestille seg de lange sporene ved permanent merking, legg til den permanente imagerstrengen og inkuber i 120 sekunder i T50M5-bufferen.Vask deretter kanalen ved å infundere 200 mikroliter vaskebuffer. Ta opp et bilde med eksitasjonslaseren av for å få bakgrunnskamerastøy. Bilde et stort område i et rutenett mønster av TIRF mikroskopi.Programmer mikroskopet til å skanne over området på 400 x 50 bilder og dele rådataene i individuelle TIP-filer som hver inneholder maksimalt 10 000 bilder ved hjelp av ImageJ-programmet. Slå sammen alle bildene ved hjelp av belysningsprofilen og bruk MIST-plugin-modulen til å sy bildene. Resultatet for proteinet G ssDNA biokonjugering karakterisering viste at en nesten en er til ett forhold mellom protein G og ssDNA der proteinet G Maleimide ssDNA og imidazol elution buffer spektra fra ortogonalt grunnlag for montering til biokonjugering produktspekteret.Native PAGE ble brukt til å bekrefte biokonjugasjonen som viser de lyse grønne båndene som sammenfaller med det monomeriske proteinet G-båndet som indikerer vellykket konjugering og godt utbytte. TIRF-belysningsprofilen introdusert fra en enkeltmodusfiber er generelt lysere midt i synsfeltet og dimmer rundt kantene. For å kompensere for ujevn belysning og slå sammen bildene for kvantitativ analyse, ble belysningsprofilen bestemt ved å beregne gjennomsnittet av tusenvis av individuelle rammer.Sammenslåtte bilder ble produsert ved å trekke kamerastøyen fra både rå- og belysningsprofiler og deretter normalisere av belysningsprofilen. Rå søm viste klare periodiske mønstre som tilsvarer de ukorrekte bildene, mens det samme synsfeltet sydd sammen fra sammenslåtte bilder ga en flat bakgrunn. En rampe opp strømningsprofil ble brukt til å bestemme omfanget av skjærspenning som resulterte i cellerulling og gi fluorescensspor der et typisk encellet vedheftsfotavtrykk kunne sees.Suboptimale og optimale resultater av fluorescerende spor med utilstrekkelig kontrast, overdreven sportetthet, optimal sportetthet og kontrast, og diffraksjonsbegrenset og DNA-PAINT-avbildning vises. inkubasjonstid på mer enn 60 minutter sikrer overflatefunksjonalisering og riktig kammerkonstruksjon forhindrer passasje av bobler som skader funksjonalisert overflate. Denne prosedyren gjelder for kvantitativ analyse av molekylær kraft involvert i rullende vedheft og lar forskere forstå den rullende oppførselen til de forskjellige celletypene.Denne teknikken gjør det mulig for forskere å utforske nye spørsmål om raske vedheftshendelser som fører til videreutvikling av enkeltmolekyl- og mekanobiologiforskning.

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Title Cell Encapsulation by Droplets

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Lev Imaging analysen for vurdering av roller av Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Og Sphingomyelinase i Reparasjon av poredannende Gift Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Aktivering Autophagy av Aerobic Exercise i Mus

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analysere Cell Surface Adhesjon Ombygging i Response til Mekanisk Tension Bruke magnetiske kuler

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...