Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Эта работа была поддержана Канадским фондом инноваций (CFI 35492), Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), Фондом новых рубежей в исследованиях (NFRFE-2018-00969), Фондом Майкла Смита для исследований в области здравоохранения (SCH-2020-0559) и Фондом возвышения Университета Британской Колумбии.

1. Маркировка и гибридизация олигонуклеотидов
<ol><li>Восстановление дисульфидных связей белка G<ol>
<li>Растворите 10 мг белка G (ProtG) в 1 мл сверхчистой воды. ПРИМЕЧАНИЕ: Белок G здесь модифицирован одним остатком цистеина на С-конце и N-концевой полигистидовой меткой.</li>
		<li>Буферный ...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

Анализ адгезионного следа позволяет визуализировать события молекулярной адгезии между PSGL-1 и P-селектином во время клеточной скользящей адгезии. Этот процесс инициируется P-селектин-опосредованным захватом с последующей прокаткой под текучим напряжением сдвига. Потенциальные пробл?...

Каскад скользящей адгезии описывает, как циркулирующие клетки привязываются к стенке кровеносного сосуда и катятся вдоль нее1. Пассивная прокатка в основном опосредована селектинами, основным классом молекул клеточной адгезии (CAMs)1. Под сдвиговым потоком крови лейкоциты, экспрессирующие Р-селектин гликопротеин лиганд-1 (PSGL-1), образуют высокопреходящие связи с Р-селектином, которые могут экспрессироваться на поверхности воспаленных эндотелиальных клеток. Этот процесс имеет решающее значение для того, чтобы лейкоциты мигрировали в место воспаления2. Кроме того, PSGL-1 также является механочувствительным рецептором, способным запускать последующую стадию твердой адгезии каскада скользящей адгезии при его взаимодействии с P-селектином3.
Генетические мутации, влияющие на функцию CAM, могут серьезно повлиять на иммунную систему, например, при редком заболевании дефицита адгезии лейкоцитов (LAD), где нарушение адгезии молекул, опосредующих прокатку, приводит к сильному ослаблению иммунитета лиц4,5,6. Кроме того, было показано, что циркулирующие опухолевые клетки мигрируют после аналогичного процесса прокатки, что приводит к метастазированию7,8. Однако, поскольку клеточная прокатка является быстрой и динамичной, обычные экспериментальные методы механобиологии непригодны для изучения молекулярных взаимодействий во время клеточной прокатки. В то время как одноклеточные и одномолекулярные методы манипулирования, такие как атомно-силовая микроскопия и оптический пинцет, смогли изучить молекулярные взаимодействия, такие как силово-зависимое взаимодействие P-селектина с PSGL-1 на уровне одной молекулы9, они непригодны для исследования событий живой адгезии во время клеточного качения. Кроме того, взаимодействие, характеризуемое in vitro, не может напрямую ответить на вопрос о молекулярной адгезии in vivo. Например, какой диапазон молекулярного напряжения является биологически значимым, когда клетки функционируют в своей родной среде? Вычислительные методы, такие как моделирование адгезионной динамики10 или простая стационарная модель11, охватывают определенные молекулярные детали и то, как они влияют на поведение качения, но сильно зависят от точности параметров моделирования и предположений. Другие методы, такие как микроскопия силы тяги, могут обнаруживать силы во время миграции клеток, но не обеспечивают достаточного пространственного разрешения или количественной информации о молекулярном напряжении. Ни один из этих методов не может обеспечить прямые экспериментальные наблюдения за временной динамикой, пространственным распределением и неоднородностью величин молекулярных сил, которые напрямую связаны с функцией и поведением клеток в их родной среде.
Поэтому внедрение датчика молекулярной силы, способного точно измерять селектин-опосредованные взаимодействия, имеет решающее значение для улучшения нашего понимания адгезии при качении. Здесь мы описываем протокол анализа адгезионного следа12, где шарики с покрытием PSGL-1 катаются на поверхности, представляющей п-селектин функционализированные тросы датчика напряжения (TGTs)13. Эти ТГТ являются необратимыми датчиками силы на основе ДНК, которые приводят к постоянной истории событий разрыва в виде считывания флуоресценции. Это достигается путем разрыва TGT (dsDNA) и последующей маркировки разорванной TGT (ssDNA) флуоресцентно меченой дополнительной нитью. Одним из основных преимуществ этой системы является ее совместимость как с дифракционными ограничениями, так и с изображениями со сверхвысоким разрешением. Флуоресцентно меченая комплементарная нить может быть либо постоянно связанной (>12 bp) для дифракционно-ограниченной визуализации, либо временно связанной (7-9 bp) для визуализации сверхвысокого разрешения через DNA PAINT. Это идеальная система для изучения адгезии при качении, поскольку ТГТ разрываются во время активной прокатки, но показания флуоресценции анализируются после прокатки. Два метода визуализации также предоставляют пользователю больше свободы для исследования адгезии при качении. Как правило, дифракционно-ограниченная визуализация полезна для извлечения силы молекулярного разрыва через интенсивность флуоресценции13, тогда как визуализация со сверхвысоким разрешением позволяет проводить количественный анализ плотности рецепторов. Благодаря возможности исследования этих свойств адгезии качения этот подход обеспечивает перспективную платформу для понимания механизма силовой регуляции молекулярной адгезии клеток качения при сдвиговом потоке.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

Скользящая адгезия, облегчаемая селектин-опосредованными взаимодействиями, представляет собой высокодинамичную, пассивную подвижность при наборе лейкоцитов к месту воспаления. Это явление происходит в посткапиллярных венулах, где кровоток толкает лейкоциты в скользящем движении по эндотелиальным клеткам. Стабильная прокатка требует тонкого баланса между образованием адгезионных связей и их механически управляемой диссоциацией, что позволяет ячейке оставаться прикрепленной к поверхности во время прокатки в направлении потока. В отличие от других процессов адгезии, происходящих в относительно статических средах, адгезия качения очень динамична, поскольку клетки качения перемещаются на тысячи микрон со скоростью десятки микрон в секунду. Следовательно, обычные методы механобиологии, такие как микроскопия силы тяги, непригодны для измерения отдельных событий адгезии и связанных с ними молекулярных сил из-за короткой временной шкалы и требуемой высокой чувствительности. Здесь мы описываем нашу последнюю реализацию анализа адгезионного следа для изображения P-селектина: взаимодействия PSGL-1 в адгезии качения на молекулярном уровне. Этот метод использует необратимые тросы натяжения на основе ДНК для получения постоянной истории событий молекулярной адгезии в виде флуоресцентных дорожек. Эти дорожки могут быть изображены двумя способами: (1) сшивание тысяч изображений с дифракционным ограничением для создания большого поля зрения, что позволяет извлекать адгезионный след каждой скользящей клетки длиной более тысяч микрон, (2) выполнение DNA-PAINT для реконструкции изображений со сверхвысоким разрешением флуоресцентных дорожек в небольшом поле зрения. В этом исследовании анализ адгезионного следа использовался для изучения клеток HL-60, катящихся при различных напряжениях сдвига. При этом мы смогли изобразить пространственное распределение взаимодействия P-селектина: PSGL-1 и получить представление об их молекулярных силах через интенсивность флуоресценции. Таким образом, этот метод обеспечивает основу для количественного исследования различных взаимодействий между клеткой и поверхностью, участвующих в адгезии качения на молекулярном уровне.

В приведенном выше протоколе описывается экспериментальная процедура анализа адгезионного следа. Общий рабочий процесс эксперимента проиллюстрирован на рисунке 1, от сборки проточной камеры (рисунок 1A) до функционализации поверхности (рису...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

В этом протоколе представлены экспериментальные процедуры для выполнения анализа адгезионного следа для изображения событий адгезии во время быстрой клеточной скользящей адгезии.

Визуализация молекулярной адгезии в клеточной прокатке с помощью анализа адгезионного следа

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Этот протокол помогает установить связь между молекулярной силой и поведением клетки при качении, а также позволяет пространственно отображать и количественно оценивать адгезию качения на молекулярном уровне. Этот метод позволяет изучать отдельные события адгезии во время фактического скольжения клеток, что позволяет нам непосредственно измерять физиологическую силу молекулярной адгезии. Подготовка поверхности с использованием соответствующей концентрации и времени инкубации на каждом этапе имеет решающее значение для достижения высококачественной функционализации поверхности.Качество биоконъюгации и надлежащие условия также имеют решающее значение. Визуальная демонстрация имеет решающее значение, чтобы помочь исследователям воспроизвести этот протокол. В частности, такие этапы, как сборка проточной камеры и постобработка изображений, значительно выиграют от визуальной демонстрации.Начните с тонкого распределения небольшого количества эпоксидной смолы по обеим сторонам двусторонней ленты лезвием бритвы. С помощью лазера вырежьте ленту с эпоксидным покрытием для создания четырех каналов. Создайте проточную стружку, зажав эпоксидную ленту между затвором с четырьмя отверстиями и крышкой PEG.Используя наконечник пипетки, примените мягкое давление по длине каналов, чтобы создать хорошее уплотнение, затем отверждайте эпоксидную смолу в течение как минимум одного часа. Выровняйте чип так, чтобы открытие каждого канала располагалось в центрах адаптера. Затем поместите две прозрачные акриловые прокладки поверх чипа.Приложите сильное давление в середине блока и прикрутите винт на концах каждой распорки. Вкрутите входные отверстия в резьбовые отверстия с другой стороны кронштейна и следите за состоянием уплотнения через прозрачный акриловый блок. Пропустите 200 микролитров промывочного буфера в камеру для проверки утечки.Если в канале образуются пузырьки, агрессивно протолкните дополнительные 200 микролитров промывочного буфера, чтобы удалить пузырьки. Добавьте 40 микролитров BSA в проточную камеру для предотвращения неспецифического связывания и инкубируйте в течение 10 минут в камере влажности. После инкубации добавьте 40 микролитров в Tween 20 в проточную камеру и снова инкубируйте в течение 10 минут, чтобы еще больше уменьшить неспецифическое связывание.Затем промыть канал 200 микролитрами промывочного буфера, чтобы удалить все пассивационные агенты. Для функционализации поверхности камеры добавьте 40 микролитров Стрептавидина в проточную камеру и инкубируйте в течение 20 минут, затем промывайте камеру 200 микролитрами промывочного буфера. Теперь добавьте 40 микролитров гибридизированного белка G-TGT в проточную камеру и инкубируйте в течение 20 минут.После промывки с помощью буфера для стирки добавьте 40 микролитров верхней нити белка G-TGT и инкубируйте в течение 20 минут, чтобы завершить любую негибридированную нижнюю прядь TGT на поверхности, а затем промыть буфером для стирки. Наконец, добавьте 40 микролитров P-selectin-Fc в проточную камеру и инкубируйте в течение 60 минут перед промывкой с помощью промывочного буфера. Наполните пятимиллилитровой стеклянный шприц скользящим буфером и постучите по бокам шприца, чтобы выбить и вытолкнуть пузырьки, когда они плывут к кончику.После введения стерильной иглы в 200-миллиметровый кусок полиэтиленовой трубки подключите иглу к стеклянному шприцу. Закрепите шприц на шприцевом насосе и наклоните шприцевой насос так, чтобы сторона плунжера была приподнята, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха в канал. Вставьте конец трубки во входное отверстие проточной камеры.Вставьте один конец другого 200-миллиметрового куска полиэтиленовой трубки в выпускное отверстие и погрузите другой конец в стакан для отходов. Возьмите один-два миллилитра образца клеточной суспензии и центрифугу, чтобы гранулировать клетки. Извлеките среду и аккуратно повторно суспендируйте ячейки в 500 микролитрах буфера качения.Осторожно отсоедините трубку от входных отверстий и выходного отверстия и пипетки 40 микролитров клеточной суспензии в проточной камере. Повторно подключите трубку, как описано ранее, гарантируя, что пузырьки не будут введены в канал потока. Начните эксперимент с клеточной прокаткой, запустив шприцевой насос с желаемой скоростью потока.Наблюдайте за перемещением клеток с помощью микроскопа темного поля с объективом 10X. Как только эксперимент будет завершен, удалите клетки из канала, вливая буфер прокатки со скоростью 100 миллилитров в час, пока поверхность не станет свободной от клеток. Для визуализации локальных следов с помощью DNA-PAINT добавьте в канал 40 микролитров цепи тепловизора DNA-PAINT, приготовленной в буфере DNA-PAINT.Выполнить флуоресцентную микроскопию полного внутреннего отражения с использованием условий, указанных в тексте рукописи. Локализуйте и визуализируйте изображения с сверхвысоким разрешением. Для визуализации длинных дорожек с помощью постоянной маркировки добавьте постоянную нить тепловизора и инкубируйте в течение 120 секунд в буфере T50M5.Затем промыть канал, влив 200 микролитров промывочного буфера. Запишите изображение с выключенным лазером возбуждения, чтобы получить фоновый шум камеры. Изображение большой площади в виде сетки с помощью микроскопии TIRF.Запрограммируйте микроскоп на сканирование на площади 400 на 50 изображений и разделение необработанных данных на отдельные файлы TIP, каждый из которых содержит максимум 10 000 изображений с помощью программы ImageJ. Сгладьте все изображения с помощью профиля освещения и используйте плагин MIST для сшивания изображений. Результат для характеристики биоконъюгации белка G ssDNA показал, что почти одно отношение белка G к ssDNA, где спектры буфера элюирования белка G малеимида и имидазола из ортогональной основы для подгонки к спектру продуктов биоконъюгации.Нативный PAGE был использован для подтверждения биоконъюгации, показывающей ярко-зеленые полосы, совпадающие с мономерной полосой белка G, что указывает на успешную конъюгацию и хороший выход. Профиль освещения TIRF, введенный из одномодового волокна, как правило, ярче в середине поля зрения и тусклее по краям. Чтобы компенсировать неравномерное освещение и сгладить изображения для количественного анализа, профиль освещения определяли путем усреднения тысяч отдельных кадров.Сглаженные изображения были получены путем вычитания шума камеры из профилей необработанного и освещения, а затем нормализации по профилю освещения. Необработанное сшивание показало четкие периодические узоры, соответствующие неисправленным изображениям, в то время как то же поле зрения, сшитое из сглаженных изображений, создавало плоский фон. Профиль нарастающего потока использовался для определения диапазона напряжения сдвига, приводящего к раскатке клеток и флуоресцентным дорожкам, под которыми можно было увидеть типичный след адгезии с одной ячейкой.Показаны неоптимальные и оптимальные результаты флуоресцентных треков с недостаточной контрастностью, чрезмерной плотностью трека, оптимальной плотностью и контрастностью треков, а также дифракционной ограниченной и ДНК-PAINT визуализацией. время инкубации более 60 минут обеспечивает функционализацию поверхности, а правильная конструкция камеры предотвращает прохождение пузырьков, которые повреждают функционализированную поверхность. Эта процедура применима для количественного анализа молекулярной силы, участвующей в адгезии качения, и позволяет исследователям понять поведение качения различных типов клеток.Этот метод позволяет исследователям исследовать новые вопросы, касающиеся событий быстрой адгезии, ведущих к дальнейшему продвижению исследований одной молекулы и механобиологии.

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Анализ для адгезии и агар Вторжение в CEREVISIAE С.

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Препарирование Организатор и эксплантов животных Полюс от Xenopus laevis Эмбрионы и Ассамблеи Пробирной клеточной адгезии

Title Cell Encapsulation by Droplets

Название сотовый Инкапсуляция воздушно-капельным путем

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

Поведенческие Пробирной для измерения Отзывчивость данио рерио на изменения в интенсивности света

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Адгезии тромбоцитов и статистические Под потоком использованием микрожидкостных Клетки потока

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Живая съемка Пробирной для оценки роли Са<sup&gt; 2 +</sup&gt; И сфингомиелиназы в Ремонт порообразующих токсинного ран

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Активация аутофагии аэробикой у мышей

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Анализ клеточной поверхности адгезии Ремоделирование в ответ на механическое напряжение с помощью магнитных шариков

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...