Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Canadiense de Innovación (CFI 35492), natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) y el University of British Columbia Eminence Fund.

1. Etiquetado e hibridación de oligonucleótidos
<ol><li>Reducción de los enlaces disulfuro de proteína G<ol>
<li>Disolver 10 mg de Proteína G (ProtG) en 1 ml de agua ultrapura. NOTA: La proteína G aquí se modifica con un solo residuo de cisteína en el extremo C y una etiqueta de polihistidina N-terminal.</li>
		<li>Intercambio de búfer ≥20 μL de ProtG (10 mg/mL) en 1x PBS (pH 7.2) con una columna P6.</li>
		<li>Mida la concentración de proteína después del intercambio tampón. NOTA...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. 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Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. 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T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

El ensayo de huella de adhesión permite la visualización de los eventos de adhesión molecular entre PSGL-1 y P-selectina durante la adhesión de rodadura celular. Este proceso se inicia mediante la captura mediada por P-selectina seguida de laminación bajo tensión de cizallamiento fluídico. Los problemas potenciales durante el experimento generalmente involucran un rodado celular deficiente o pistas fluorescentes faltantes, incluso cuando las células ruedan bien. Estos problemas a menudo son el resultado de contro...

La cascada de adhesión rodante describe cómo las células circulantes se atan y ruedan a lo largo de la pared de los vasos sanguíneos1. El laminado pasivo está mediado principalmente por selectinas, una clase importante de moléculas de adhesión celular (CAM)1. Bajo el flujo de cizallamiento de la sangre, los leucocitos que expresan el ligando de glicoproteína P-selectina-1 (PSGL-1) forman enlaces altamente transitorios con P-selectina, que pueden expresarse en la superficie de las células endoteliales inflamadas. Este proceso es crítico para que los leucocitos migren a un sitio de inflamación2. Además, PSGL-1 es también un receptor mecanosensible capaz de desencadenar la etapa de adhesión firme posterior de la cascada de adhesión rodante tras su compromiso con P-selectina3.
Las mutaciones genéticas que afectan a la función CAM pueden afectar gravemente al sistema inmunitario, como en la rara enfermedad de deficiencia de adhesión leucocitaria (LAD), donde el mal funcionamiento de las moléculas de adhesión que median el rodar conduce a individuos gravemente inmunocomprometidos4,5,6. Además, se ha demostrado que las células tumorales circulantes migran siguiendo un proceso de rodadura similar, lo que lleva a metástasis7,8. Sin embargo, debido a que el laminado celular es rápido y dinámico, los métodos experimentales convencionales de mecanobiología no son adecuados para estudiar las interacciones moleculares durante el laminado celular. Si bien los métodos de manipulación de una sola célula y una sola molécula, como la microscopía de fuerza atómica y la pinza óptica, pudieron estudiar interacciones moleculares como la interacción dependiente de la fuerza de P-selectina con PSGL-1 a nivel de molécula única9, no son adecuados para investigar eventos de adhesión en vivo durante el rodaje celular. Además, la interacción caracterizada in vitro no puede responder directamente a la pregunta sobre la adhesión molecular in vivo. Por ejemplo, ¿qué rango de tensión molecular es biológicamente relevante cuando las células funcionan en su entorno nativo? Los métodos computacionales como la simulación de dinámica adhesiva10 o el modelo simple de estado estacionario11 han capturado ciertos detalles moleculares y cómo influyen en el comportamiento de rodadura, pero dependen en gran medida de la precisión de los parámetros y suposiciones de modelado. Otras técnicas como la microscopía de fuerza de tracción pueden detectar fuerzas durante la migración celular, pero no proporcionan suficiente resolución espacial o información cuantitativa sobre la tensión molecular. Ninguna de estas técnicas puede proporcionar observaciones experimentales directas de la dinámica temporal, la distribución espacial y la heterogeneidad de magnitud de las fuerzas moleculares, que se relacionan directamente con la función y el comportamiento celular en su entorno nativo.
Por lo tanto, la implementación de un sensor de fuerza molecular capaz de medir con precisión las interacciones mediadas por selectina es crucial para mejorar nuestra comprensión de la adhesión rodante. Aquí, describimos el protocolo para el ensayo de huella de adhesión12 donde las perlas recubiertas de PSGL-1 se enrollan sobre una superficie presentando ataduras de medidor de tensión funcionalizadas con p-selectina (TGT)13. Estos TGT son sensores de fuerza irreversibles basados en ADN que dan como resultado una historia permanente de eventos de ruptura en forma de lectura de fluorescencia. Esto se logra a través de la ruptura del TGT (dsDNA) y luego el posterior etiquetado del TGT roto (ssDNA) con una hebra complementaria marcada fluorescentemente. Una de las principales ventajas de este sistema es su compatibilidad con imágenes de difracción limitada y de superresolución. La hebra complementaria marcada fluorescentemente puede estar unida permanentemente (>12 pb) para imágenes limitadas por difracción o enlazada transitoriamente (7-9 pb) para imágenes de superresolución a través de DNA PAINT. Este es un sistema ideal para estudiar la adherencia a la rodadura ya que los TGT se rompen durante el laminado activo, pero la lectura de fluorescencia se analiza después del laminado. Los dos métodos de imagen también proporcionan al usuario más libertad para investigar la adherencia rodante. Por lo general, las imágenes limitadas por difracción son útiles para extraer la fuerza de ruptura molecular a través de la intensidad de la fluorescencia13, mientras que las imágenes de superresolución permiten el análisis cuantitativo de la densidad del receptor. Con la capacidad de investigar estas propiedades de la adhesión rodante, este enfoque proporciona una plataforma prometedora para comprender el mecanismo de regulación de la fuerza en la adhesión molecular de las células rodantes bajo flujo de cizallamiento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

La adhesión rodante, facilitada por interacciones mediadas por selectina, es una motilidad pasiva altamente dinámica en el reclutamiento de leucocitos en el sitio de la inflamación. Este fenómeno ocurre en las vénulas postcapilares, donde el flujo sanguíneo empuja a los leucocitos en un movimiento rodante sobre las células endoteliales. El laminado estable requiere un delicado equilibrio entre la formación de enlaces de adhesión y su disociación impulsada mecánicamente, lo que permite que la celda permanezca unida a la superficie mientras rueda en la dirección del flujo. A diferencia de otros procesos de adhesión que ocurren en entornos relativamente estáticos, la adhesión de rodadura es altamente dinámica ya que las células de rodadura viajan a través de miles de micras a decenas de micras por segundo. En consecuencia, los métodos de mecanobiología convencionales, como la microscopía de fuerza de tracción, no son adecuados para medir los eventos de adhesión individuales y las fuerzas moleculares asociadas debido a la corta escala de tiempo y la alta sensibilidad requerida. Aquí, describimos nuestra última implementación del ensayo de huella de adhesión para obtener imágenes de las interacciones P-selectina: PSGL-1 en la adhesión rodante a nivel molecular. Este método utiliza amarres de medición de tensión irreversibles basados en ADN para producir una historia permanente de eventos de adhesión molecular en forma de pistas de fluorescencia. Estas pistas se pueden visualizar de dos maneras: (1) uniendo miles de imágenes limitadas por difracción para producir un gran campo de visión, lo que permite la extracción de la huella de adhesión de cada célula rodante sobre miles de micras de longitud, (2) realizando DNA-PAINT para reconstruir imágenes de superresolución de las pistas de fluorescencia dentro de un pequeño campo de visión. En este estudio, el ensayo de huella de adhesión se utilizó para estudiar las células HL-60 rodando a diferentes tensiones de cizallamiento. Al hacerlo, pudimos obtener imágenes de la distribución espacial de la interacción P-selectina: PSGL-1 y obtener información sobre sus fuerzas moleculares a través de la intensidad de la fluorescencia. Por lo tanto, este método proporciona la base para la investigación cuantitativa de las diversas interacciones célula-superficie involucradas en la adhesión rodante a nivel molecular.

El protocolo anterior describe el procedimiento experimental del ensayo de huella de adhesión. El flujo de trabajo general del experimento se ilustra en la Figura 1, desde el conjunto de la cámara de flujo (Figura 1A) hasta la funcionalización de la superficie (Figura 1B) y los pasos de experimento e imagen (Figura 1C).
La Figura 2 es un resul...

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Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Este protocolo presenta los procedimientos experimentales para realizar el ensayo de huella de adhesión para obtener imágenes de los eventos de adhesión durante la adhesión rápida de rodadura celular.

Imágenes de adhesión molecular en laminación celular mediante ensayo de huella de adhesión

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Este protocolo ayuda a establecer la conexión entre la fuerza molecular y el comportamiento de rodadura celular, además de permitir mapear espacialmente y cuantificar la adhesión de rodadura a nivel molecular. Esta técnica permite estudiar eventos de adhesión individuales durante el rodadura celular real, lo que nos permite medir directamente la fuerza de adhesión molecular fisiológica relevante. La preparación de la superficie utilizando la concentración adecuada y el tiempo de incubación en cada paso es crucial para lograr una funcionalización de la superficie de alta calidad.La calidad de las bioconjugaciones y las condiciones adecuadas también son cruciales. La demostración visual es fundamental para ayudar a los investigadores a replicar este protocolo. En particular, los pasos como el ensamblaje de la cámara de flujo y el postprocesamiento de imágenes se beneficiarán enormemente de una demostración visual.Comience extendiendo finamente una pequeña cantidad de epoxi en ambos lados de la cinta de doble cara con una cuchilla de afeitar. Usando un láser, corte la cinta recubierta de epoxi para crear cuatro canales. Cree el chip de flujo intercalando la cinta epoxi entre una diapositiva de cuatro orificios y una cubierta PEG.Usando una punta de pipeta, aplique una presión suave a lo largo de los canales para crear un buen sello, luego cure el epoxi durante un mínimo de una hora. Alinee el chip de modo que la apertura de cada canal se coloque en los centros del adaptador. Luego coloque dos espaciadores acrílicos transparentes en la parte superior del chip.Aplique una presión firme en el centro del bloque y atornille en los extremos de cada espaciador. Atornille las entradas en los orificios roscados del otro lado del soporte y controle la condición de sellado a través del bloque de acrílico transparente. Fluya 200 microlitros de tampón de lavado en la cámara para verificar si hay fugas.Si se forman burbujas en el canal, empuje agresivamente 200 microlitros adicionales de tampón de lavado para eliminar las burbujas. Agregue 40 microlitros de BSA a la cámara de flujo para evitar la unión inespecífica e incube durante 10 minutos en la cámara de humedad. Después de la incubación, agregue 40 microlitros a Tween 20 a la cámara de flujo y vuelva a incubar durante 10 minutos para reducir aún más la unión inespecífica.Luego lave el canal con 200 microlitros de tampón de lavado para eliminar todos los agentes de pasivación. Para la funcionalización de la superficie de la cámara, agregue 40 microlitros de streptavidin a la cámara de flujo e incube durante 20 minutos, luego lave la cámara con 200 microlitros de tampón de lavado. Ahora, agregue 40 microlitros de proteína hibridada G-TGT a la cámara de flujo e incube durante 20 minutos.Después de lavar con el tampón de lavado, agregue 40 microlitros de la hebra superior de proteína G-TGT e incube durante 20 minutos para completar cualquier hebra inferior de TGT no hibridada en la superficie y luego lave con tampón de lavado. Finalmente, agregue 40 microlitros de P-selectin-Fc a la cámara de flujo e incube durante 60 minutos antes de lavar con tampón de lavado. Llene una jeringa de vidrio de cinco mililitros con el amortiguador rodante y golpee los lados de la jeringa para desalojar y empujar las burbujas hacia afuera a medida que flotan hacia la punta.Después de insertar una aguja estéril en una pieza de 200 milímetros de tubo de polietileno, conecte la aguja a la jeringa de vidrio. Fije la jeringa en la bomba de la jeringa e incline la bomba de la jeringa de tal manera que el lado del émbolo esté elevado para evitar que las burbujas de aire entren en el canal. Inserte el extremo del tubo en la entrada de la cámara de flujo.Inserte un extremo de otra pieza de 200 milímetros del tubo de polietileno en la salida y sumerja el otro extremo en un vaso de precipitados de desecho. Tome de uno a dos mililitros de la muestra de suspensión celular y centrífuga para granular las células. Retire el medio y vuelva a suspender suavemente las células en 500 microlitros del tampón rodante.Desconecte cuidadosamente el tubo de las entradas y la salida y pipetee 40 microlitros de la suspensión celular en la cámara de flujo. Vuelva a conectar el tubo como se describió anteriormente, asegurándose de que no se introduzcan burbujas en el canal de flujo. Comience el experimento de rodadura de celdas iniciando la bomba de jeringa a los caudales deseados.Observe el balanceo celular usando un microscopio de campo oscuro con un objetivo 10X. Una vez que se complete el experimento, retire las células del canal infundiendo el búfer rodante a 100 mililitros por hora hasta que la superficie esté libre de células. Para obtener imágenes de las pistas locales mediante DNA-PAINT, agregue 40 microlitros de hebra de generador de imágenes DNA-PAINT preparada en tampón DNA-PAINT al canal.Realizar microscopía de fluorescencia de reflexión interna total utilizando las condiciones mencionadas en el texto manuscrito. Localice y renderice las imágenes de superresolución. Para obtener imágenes de las pistas largas mediante etiquetado permanente, agregue la hebra de generador de imágenes permanente e incube durante 120 segundos en el búfer T50M5.Luego lave el canal infundiendo 200 microlitros de tampón de lavado. Grabe una imagen con el láser de excitación desactivado para obtener el ruido de fondo de la cámara. Imagen de un área grande en un patrón de cuadrícula mediante microscopía TIRF.Programe el microscopio para escanear sobre el área de 400 por 50 imágenes y divida los datos sin procesar en archivos TIP individuales, cada uno con un máximo de 10, 000 imágenes utilizando el programa ImageJ. Aplana todas las imágenes usando el perfil de iluminación y usa el plugin MIST para unir las imágenes. El resultado para la caracterización de la bioconjugación de la proteína G ssDNA mostró una proporción de casi uno es a uno de la proteína G a ssDNA donde la proteína G Maleimida ssDNA y los espectros tampón de elución de imidazol de la base ortogonal para ajustarse al espectro de productos de bioconjugación.Se utilizó PAGE nativo para confirmar la bioconjugación que muestra las bandas de color verde brillante que coinciden con la banda G de la proteína monomérica que indica una conjugación exitosa y un buen rendimiento. El perfil de iluminación TIRF introducido a partir de una fibra monomodo es generalmente más brillante en el centro del campo de visión y más tenue alrededor de los bordes. Para compensar la iluminación desigual y aplanar las imágenes para el análisis cuantitativo, el perfil de iluminación se determinó promediando miles de fotogramas individuales.Las imágenes aplanadas se produjeron restando el ruido de la cámara de los perfiles raw y de iluminación y luego normalizándose por el perfil de iluminación. Las costuras en bruto mostraron patrones periódicos claros correspondientes a las imágenes no corregidas, mientras que el mismo campo de visión cosido a partir de imágenes aplanadas produjo un fondo plano. Se utilizó un perfil de flujo de rampa hacia arriba para determinar el rango de tensión de cizallamiento que resultó en el laminado celular y el rendimiento de pistas de fluorescencia bajo las cuales se podía ver una huella de adhesión típica de una sola célula.Se muestran resultados subóptimos y óptimos de pistas fluorescentes con contraste insuficiente, densidad de pista excesiva, densidad y contraste óptimos de la pista, y imágenes de difracción limitada y DNA-PAINT. El tiempo de incubación superior a 60 minutos asegura la funcionalización de la superficie y la construcción adecuada de la cámara evita el paso de burbujas que dañan la superficie funcionalizada. Este procedimiento es aplicable para el análisis cuantitativo de la fuerza molecular involucrada en la adhesión a la rodadura y permite a los investigadores comprender el comportamiento de rodadura de los diferentes tipos de células.Esta técnica permite a los investigadores explorar nuevas preguntas sobre los eventos de adhesión rápida que conducen a un mayor avance de la investigación de moléculas individuales y mecanobiología.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Ensayo de adhesión y la invasión de agar en S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Investigación

Biología

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular

Title Cell Encapsulation by Droplets

Título encapsulación celular a través de gotitas

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un ensayo de conducta para medir la capacidad de respuesta de pez cebra a cambios en la intensidad de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Adhesión y agregación plaquetaria bajo flujo con células de microfluidos de flujo

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina Heridas

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

La activación de la autofagia mediante ejercicio aeróbico en ratones

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

El análisis de la superficie celular Adhesión Remodeling en respuesta a la tensión mecánica usando perlas magnéticas

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...