Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Canadiense de Innovación (CFI 35492), natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) y el University of British Columbia Eminence Fund.

1. Etiquetado e hibridación de oligonucleótidos
<ol><li>Reducción de los enlaces disulfuro de proteína G<ol>
<li>Disolver 10 mg de Proteína G (ProtG) en 1 ml de agua ultrapura. NOTA: La proteína G aquí se modifica con un solo residuo de cisteína en el extremo C y una etiqueta de polihistidina N-terminal.</li>
		<li>Intercambio de búfer ≥20 μL de ProtG (10 mg/mL) en 1x PBS (pH 7.2) con una columna P6.</li>
		<li>Mida la concentración de proteína después del intercambio tampón. NOTA...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

El ensayo de huella de adhesión permite la visualización de los eventos de adhesión molecular entre PSGL-1 y P-selectina durante la adhesión de rodadura celular. Este proceso se inicia mediante la captura mediada por P-selectina seguida de laminación bajo tensión de cizallamiento fluídico. Los problemas potenciales durante el experimento generalmente involucran un rodado celular deficiente o pistas fluorescentes faltantes, incluso cuando las células ruedan bien. Estos problemas a menudo son el resultado de contro...

La cascada de adhesión rodante describe cómo las células circulantes se atan y ruedan a lo largo de la pared de los vasos sanguíneos1. El laminado pasivo está mediado principalmente por selectinas, una clase importante de moléculas de adhesión celular (CAM)1. Bajo el flujo de cizallamiento de la sangre, los leucocitos que expresan el ligando de glicoproteína P-selectina-1 (PSGL-1) forman enlaces altamente transitorios con P-selectina, que pueden expresarse en la superficie de las células endoteliales inflamadas. Este proceso es crítico para que los leucocitos migren a un sitio de inflamación2. Además, PSGL-1 es también un receptor mecanosensible capaz de desencadenar la etapa de adhesión firme posterior de la cascada de adhesión rodante tras su compromiso con P-selectina3.
Las mutaciones genéticas que afectan a la función CAM pueden afectar gravemente al sistema inmunitario, como en la rara enfermedad de deficiencia de adhesión leucocitaria (LAD), donde el mal funcionamiento de las moléculas de adhesión que median el rodar conduce a individuos gravemente inmunocomprometidos4,5,6. Además, se ha demostrado que las células tumorales circulantes migran siguiendo un proceso de rodadura similar, lo que lleva a metástasis7,8. Sin embargo, debido a que el laminado celular es rápido y dinámico, los métodos experimentales convencionales de mecanobiología no son adecuados para estudiar las interacciones moleculares durante el laminado celular. Si bien los métodos de manipulación de una sola célula y una sola molécula, como la microscopía de fuerza atómica y la pinza óptica, pudieron estudiar interacciones moleculares como la interacción dependiente de la fuerza de P-selectina con PSGL-1 a nivel de molécula única9, no son adecuados para investigar eventos de adhesión en vivo durante el rodaje celular. Además, la interacción caracterizada in vitro no puede responder directamente a la pregunta sobre la adhesión molecular in vivo. Por ejemplo, ¿qué rango de tensión molecular es biológicamente relevante cuando las células funcionan en su entorno nativo? Los métodos computacionales como la simulación de dinámica adhesiva10 o el modelo simple de estado estacionario11 han capturado ciertos detalles moleculares y cómo influyen en el comportamiento de rodadura, pero dependen en gran medida de la precisión de los parámetros y suposiciones de modelado. Otras técnicas como la microscopía de fuerza de tracción pueden detectar fuerzas durante la migración celular, pero no proporcionan suficiente resolución espacial o información cuantitativa sobre la tensión molecular. Ninguna de estas técnicas puede proporcionar observaciones experimentales directas de la dinámica temporal, la distribución espacial y la heterogeneidad de magnitud de las fuerzas moleculares, que se relacionan directamente con la función y el comportamiento celular en su entorno nativo.
Por lo tanto, la implementación de un sensor de fuerza molecular capaz de medir con precisión las interacciones mediadas por selectina es crucial para mejorar nuestra comprensión de la adhesión rodante. Aquí, describimos el protocolo para el ensayo de huella de adhesión12 donde las perlas recubiertas de PSGL-1 se enrollan sobre una superficie presentando ataduras de medidor de tensión funcionalizadas con p-selectina (TGT)13. Estos TGT son sensores de fuerza irreversibles basados en ADN que dan como resultado una historia permanente de eventos de ruptura en forma de lectura de fluorescencia. Esto se logra a través de la ruptura del TGT (dsDNA) y luego el posterior etiquetado del TGT roto (ssDNA) con una hebra complementaria marcada fluorescentemente. Una de las principales ventajas de este sistema es su compatibilidad con imágenes de difracción limitada y de superresolución. La hebra complementaria marcada fluorescentemente puede estar unida permanentemente (>12 pb) para imágenes limitadas por difracción o enlazada transitoriamente (7-9 pb) para imágenes de superresolución a través de DNA PAINT. Este es un sistema ideal para estudiar la adherencia a la rodadura ya que los TGT se rompen durante el laminado activo, pero la lectura de fluorescencia se analiza después del laminado. Los dos métodos de imagen también proporcionan al usuario más libertad para investigar la adherencia rodante. Por lo general, las imágenes limitadas por difracción son útiles para extraer la fuerza de ruptura molecular a través de la intensidad de la fluorescencia13, mientras que las imágenes de superresolución permiten el análisis cuantitativo de la densidad del receptor. Con la capacidad de investigar estas propiedades de la adhesión rodante, este enfoque proporciona una plataforma prometedora para comprender el mecanismo de regulación de la fuerza en la adhesión molecular de las células rodantes bajo flujo de cizallamiento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

La adhesión rodante, facilitada por interacciones mediadas por selectina, es una motilidad pasiva altamente dinámica en el reclutamiento de leucocitos en el sitio de la inflamación. Este fenómeno ocurre en las vénulas postcapilares, donde el flujo sanguíneo empuja a los leucocitos en un movimiento rodante sobre las células endoteliales. El laminado estable requiere un delicado equilibrio entre la formación de enlaces de adhesión y su disociación impulsada mecánicamente, lo que permite que la celda permanezca unida a la superficie mientras rueda en la dirección del flujo. A diferencia de otros procesos de adhesión que ocurren en entornos relativamente estáticos, la adhesión de rodadura es altamente dinámica ya que las células de rodadura viajan a través de miles de micras a decenas de micras por segundo. En consecuencia, los métodos de mecanobiología convencionales, como la microscopía de fuerza de tracción, no son adecuados para medir los eventos de adhesión individuales y las fuerzas moleculares asociadas debido a la corta escala de tiempo y la alta sensibilidad requerida. Aquí, describimos nuestra última implementación del ensayo de huella de adhesión para obtener imágenes de las interacciones P-selectina: PSGL-1 en la adhesión rodante a nivel molecular. Este método utiliza amarres de medición de tensión irreversibles basados en ADN para producir una historia permanente de eventos de adhesión molecular en forma de pistas de fluorescencia. Estas pistas se pueden visualizar de dos maneras: (1) uniendo miles de imágenes limitadas por difracción para producir un gran campo de visión, lo que permite la extracción de la huella de adhesión de cada célula rodante sobre miles de micras de longitud, (2) realizando DNA-PAINT para reconstruir imágenes de superresolución de las pistas de fluorescencia dentro de un pequeño campo de visión. En este estudio, el ensayo de huella de adhesión se utilizó para estudiar las células HL-60 rodando a diferentes tensiones de cizallamiento. Al hacerlo, pudimos obtener imágenes de la distribución espacial de la interacción P-selectina: PSGL-1 y obtener información sobre sus fuerzas moleculares a través de la intensidad de la fluorescencia. Por lo tanto, este método proporciona la base para la investigación cuantitativa de las diversas interacciones célula-superficie involucradas en la adhesión rodante a nivel molecular.

El protocolo anterior describe el procedimiento experimental del ensayo de huella de adhesión. El flujo de trabajo general del experimento se ilustra en la Figura 1, desde el conjunto de la cámara de flujo (Figura 1A) hasta la funcionalización de la superficie (Figura 1B) y los pasos de experimento e imagen (Figura 1C).
La Figura 2 es un resul...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Este protocolo presenta los procedimientos experimentales para realizar el ensayo de huella de adhesión para obtener imágenes de los eventos de adhesión durante la adhesión rápida de rodadura celular.

Imágenes de adhesión molecular en laminación celular mediante ensayo de huella de adhesión

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Este protocolo ayuda a establecer la conexión entre la fuerza molecular y el comportamiento de rodadura celular, además de permitir mapear espacialmente y cuantificar la adhesión de rodadura a nivel molecular. Esta técnica permite estudiar eventos de adhesión individuales durante el rodadura celular real, lo que nos permite medir directamente la fuerza de adhesión molecular fisiológica relevante. La preparación de la superficie utilizando la concentración adecuada y el tiempo de incubación en cada paso es crucial para lograr una funcionalización de la superficie de alta calidad.La calidad de las bioconjugaciones y las condiciones adecuadas también son cruciales. La demostración visual es fundamental para ayudar a los investigadores a replicar este protocolo. En particular, los pasos como el ensamblaje de la cámara de flujo y el postprocesamiento de imágenes se beneficiarán enormemente de una demostración visual.Comience extendiendo finamente una pequeña cantidad de epoxi en ambos lados de la cinta de doble cara con una cuchilla de afeitar. Usando un láser, corte la cinta recubierta de epoxi para crear cuatro canales. Cree el chip de flujo intercalando la cinta epoxi entre una diapositiva de cuatro orificios y una cubierta PEG.Usando una punta de pipeta, aplique una presión suave a lo largo de los canales para crear un buen sello, luego cure el epoxi durante un mínimo de una hora. Alinee el chip de modo que la apertura de cada canal se coloque en los centros del adaptador. Luego coloque dos espaciadores acrílicos transparentes en la parte superior del chip.Aplique una presión firme en el centro del bloque y atornille en los extremos de cada espaciador. Atornille las entradas en los orificios roscados del otro lado del soporte y controle la condición de sellado a través del bloque de acrílico transparente. Fluya 200 microlitros de tampón de lavado en la cámara para verificar si hay fugas.Si se forman burbujas en el canal, empuje agresivamente 200 microlitros adicionales de tampón de lavado para eliminar las burbujas. Agregue 40 microlitros de BSA a la cámara de flujo para evitar la unión inespecífica e incube durante 10 minutos en la cámara de humedad. Después de la incubación, agregue 40 microlitros a Tween 20 a la cámara de flujo y vuelva a incubar durante 10 minutos para reducir aún más la unión inespecífica.Luego lave el canal con 200 microlitros de tampón de lavado para eliminar todos los agentes de pasivación. Para la funcionalización de la superficie de la cámara, agregue 40 microlitros de streptavidin a la cámara de flujo e incube durante 20 minutos, luego lave la cámara con 200 microlitros de tampón de lavado. Ahora, agregue 40 microlitros de proteína hibridada G-TGT a la cámara de flujo e incube durante 20 minutos.Después de lavar con el tampón de lavado, agregue 40 microlitros de la hebra superior de proteína G-TGT e incube durante 20 minutos para completar cualquier hebra inferior de TGT no hibridada en la superficie y luego lave con tampón de lavado. Finalmente, agregue 40 microlitros de P-selectin-Fc a la cámara de flujo e incube durante 60 minutos antes de lavar con tampón de lavado. Llene una jeringa de vidrio de cinco mililitros con el amortiguador rodante y golpee los lados de la jeringa para desalojar y empujar las burbujas hacia afuera a medida que flotan hacia la punta.Después de insertar una aguja estéril en una pieza de 200 milímetros de tubo de polietileno, conecte la aguja a la jeringa de vidrio. Fije la jeringa en la bomba de la jeringa e incline la bomba de la jeringa de tal manera que el lado del émbolo esté elevado para evitar que las burbujas de aire entren en el canal. Inserte el extremo del tubo en la entrada de la cámara de flujo.Inserte un extremo de otra pieza de 200 milímetros del tubo de polietileno en la salida y sumerja el otro extremo en un vaso de precipitados de desecho. Tome de uno a dos mililitros de la muestra de suspensión celular y centrífuga para granular las células. Retire el medio y vuelva a suspender suavemente las células en 500 microlitros del tampón rodante.Desconecte cuidadosamente el tubo de las entradas y la salida y pipetee 40 microlitros de la suspensión celular en la cámara de flujo. Vuelva a conectar el tubo como se describió anteriormente, asegurándose de que no se introduzcan burbujas en el canal de flujo. Comience el experimento de rodadura de celdas iniciando la bomba de jeringa a los caudales deseados.Observe el balanceo celular usando un microscopio de campo oscuro con un objetivo 10X. Una vez que se complete el experimento, retire las células del canal infundiendo el búfer rodante a 100 mililitros por hora hasta que la superficie esté libre de células. Para obtener imágenes de las pistas locales mediante DNA-PAINT, agregue 40 microlitros de hebra de generador de imágenes DNA-PAINT preparada en tampón DNA-PAINT al canal.Realizar microscopía de fluorescencia de reflexión interna total utilizando las condiciones mencionadas en el texto manuscrito. Localice y renderice las imágenes de superresolución. Para obtener imágenes de las pistas largas mediante etiquetado permanente, agregue la hebra de generador de imágenes permanente e incube durante 120 segundos en el búfer T50M5.Luego lave el canal infundiendo 200 microlitros de tampón de lavado. Grabe una imagen con el láser de excitación desactivado para obtener el ruido de fondo de la cámara. Imagen de un área grande en un patrón de cuadrícula mediante microscopía TIRF.Programe el microscopio para escanear sobre el área de 400 por 50 imágenes y divida los datos sin procesar en archivos TIP individuales, cada uno con un máximo de 10, 000 imágenes utilizando el programa ImageJ. Aplana todas las imágenes usando el perfil de iluminación y usa el plugin MIST para unir las imágenes. El resultado para la caracterización de la bioconjugación de la proteína G ssDNA mostró una proporción de casi uno es a uno de la proteína G a ssDNA donde la proteína G Maleimida ssDNA y los espectros tampón de elución de imidazol de la base ortogonal para ajustarse al espectro de productos de bioconjugación.Se utilizó PAGE nativo para confirmar la bioconjugación que muestra las bandas de color verde brillante que coinciden con la banda G de la proteína monomérica que indica una conjugación exitosa y un buen rendimiento. El perfil de iluminación TIRF introducido a partir de una fibra monomodo es generalmente más brillante en el centro del campo de visión y más tenue alrededor de los bordes. Para compensar la iluminación desigual y aplanar las imágenes para el análisis cuantitativo, el perfil de iluminación se determinó promediando miles de fotogramas individuales.Las imágenes aplanadas se produjeron restando el ruido de la cámara de los perfiles raw y de iluminación y luego normalizándose por el perfil de iluminación. Las costuras en bruto mostraron patrones periódicos claros correspondientes a las imágenes no corregidas, mientras que el mismo campo de visión cosido a partir de imágenes aplanadas produjo un fondo plano. Se utilizó un perfil de flujo de rampa hacia arriba para determinar el rango de tensión de cizallamiento que resultó en el laminado celular y el rendimiento de pistas de fluorescencia bajo las cuales se podía ver una huella de adhesión típica de una sola célula.Se muestran resultados subóptimos y óptimos de pistas fluorescentes con contraste insuficiente, densidad de pista excesiva, densidad y contraste óptimos de la pista, y imágenes de difracción limitada y DNA-PAINT. El tiempo de incubación superior a 60 minutos asegura la funcionalización de la superficie y la construcción adecuada de la cámara evita el paso de burbujas que dañan la superficie funcionalizada. Este procedimiento es aplicable para el análisis cuantitativo de la fuerza molecular involucrada en la adhesión a la rodadura y permite a los investigadores comprender el comportamiento de rodadura de los diferentes tipos de células.Esta técnica permite a los investigadores explorar nuevas preguntas sobre los eventos de adhesión rápida que conducen a un mayor avance de la investigación de moléculas individuales y mecanobiología.

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Ensayo de adhesión y la invasión de agar en S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Investigación

Biología

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular

Title Cell Encapsulation by Droplets

Título encapsulación celular a través de gotitas

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

Un ensayo de conducta para medir la capacidad de respuesta de pez cebra a cambios en la intensidad de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Adhesión y agregación plaquetaria bajo flujo con células de microfluidos de flujo

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina Heridas

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

La activación de la autofagia mediante ejercicio aeróbico en ratones

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

El análisis de la superficie celular Adhesión Remodeling en respuesta a la tensión mecánica usando perlas magnéticas

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...