Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) och University of British Columbia Eminence Fund.

1. Oligonukleotidmärkning och hybridisering
<ol><li>Minskning av protein G disulfidbindningar<ol>
<li>Lös upp 10 mg protein G (ProtG) i 1 ml ultrapurvatten. OBS: Protein G här modifieras med en enda cysteinrester vid C-ändstationen och en N-terminus poly-histidine tagg.</li>
		<li>Buffertutbyte ≥20 μL ProtG (10 mg/ml) till 1x PBS (pH 7.2) med en P6-kolumn.</li>
		<li>Mät proteinkoncentrationen efter buffertutbyte. OBS: Typisk koncentration på 7-8 mg/ml.</li>
		<li>Förbered 120 mM Tris(2...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

Vidhäftningsavtrycksanalysen möjliggör visualisering av de molekylära vidhäftningshändelserna mellan PSGL-1 och P-selectin under cellvals vidhäftning. Denna process initieras av P-selectin-medierad fångst följt av rullande under fluidic skjuvning stress. Potentiella problem under experimentet innebär vanligtvis dålig cellrullning eller saknade fluorescerande spår även när celler rullar bra. Dessa problem beror ofta på kvalitetskontroller i de kritiska stegen i protokollet, enligt listan i felsökningstabel...

Den rullande vidhäftningskaskaden beskriver hur cirkulerande celler tjudrar till och rullar längs blodkärlsväggen1. Passiv rullning förmedlas främst av selectins, en stor klass av cellulära vidhäftning molekyler (CAMs)1. Under skjuvningsflödet av blod bildar leukocyter som uttrycker P-selectin glykoprotein ligand-1 (PSGL-1) mycket övergående bindningar med P-selectin, som kan uttryckas på ytan av inflammerade endotelceller. Denna process är avgörande för att leukocyter migrerar till en inflammationsplats2. Dessutom är PSGL-1 också en mekanosensitiv receptor som kan utlösa det efterföljande fasta vidhäftningsstadiet i den rullande vidhäftningskaskaden vid dess engagemang med P-selectin3.
Genetiska mutationer som påverkar CAM-funktionen kan allvarligt påverka immunsystemet, såsom i den sällsynta sjukdomen av leukocyt vidhäftning brist (LAD), där fel på vidhäftning molekyler som medlar rullande leder till allvarligt immunkomprometterade individer4,5,6. Dessutom har cirkulerande tumörceller visat sig migrera efter en liknande rullande process, vilket leder till metastasering7,8. Men eftersom cellrullning är snabb och dynamisk, är konventionella experimentella mekanobiologimetoder olämpliga för att studera molekylära interaktioner under cellrullning. Medan encelliga och enmolekyliga manipuleringsmetoder som atomkraftmikroskopi och optisk pincett kunde studera molekylära interaktioner som P-selectins kraftberoende interaktion med PSGL-1 på enmolekylsnivå9, är de olämpliga för att undersöka levande vidhäftningshändelser under cellrullning. Dessutom kan interaktionen som kännetecknas in vitro inte direkt svara på frågan om molekylär vidhäftning in vivo. Till exempel, vilket molekylärt spänningsområde är biologiskt relevant när celler fungerar i sin ursprungliga miljö? Beräkningsmetoder som limdynamiksimulering10 eller enkel steady-state model11 har fångat vissa molekylära detaljer och hur de påverkar det rullande beteendet men är mycket beroende av noggrannheten hos modelleringsparametrarna och antagandena. Andra tekniker som dragkraftmikroskopi kan detektera krafter under cellmigration men ger inte tillräcklig rumslig upplösning eller kvantitativ information om molekylär spänning. Ingen av dessa tekniker kan ge direkta experimentella observationer av temporal dynamik, rumslig fördelning och magnitud heterogenitet av molekylära krafter, som direkt relaterar till cell funktion och beteende i deras ursprungliga miljö.
Därför är implementering av en molekylär kraftsensor som exakt kan mäta utvalda interaktioner avgörande för att förbättra vår förståelse av rullande vidhäftning. Här beskriver vi protokollet för vidhäftningsavtrycksanalys12 där PSGL-1-belagda pärlor rullas på en yta som presenterar p-selectin funktionaliserade spänningsmätare tjudrar (TGTs)13. Dessa TGTs är irreversibla DNA-baserade kraftsensorer som resulterar i en permanent historia av sprängning händelser i form av fluorescens avläsning. Detta uppnås genom att TGT (dsDNA) sprack och sedan efterföljande märkning av den brusten TGT (ssDNA) med en fluorescerande märkt kompletterande sträng. En stor fördel med detta system är dess kompatibilitet med både diffraktionsbegränsad och superupplösningsavbildning. Den fluorescerande märkta kompletterande delen kan antingen vara permanent bunden (>12 bp) för diffraktionsbegränsad avbildning eller övergående bunden (7-9 bp) för superupplösningsavbildning genom DNA PAINT. Detta är ett idealiskt system för att studera rullande vidhäftning eftersom TGTs bryts under aktiv rullning, men fluorescens avläsningen analyseras efter rullning. De två bildbehandlingsmetoderna ger också användaren större frihet att undersöka rullande vidhäftning. Vanligtvis är diffraktionsbegränsad avbildning användbar för att extrahera molekylär sprängkraft genom fluorescensintensitet13, medan superupplösningsavbildning möjliggör kvantitativ analys av receptordensitet. Med förmågan att undersöka dessa egenskaper hos rullande vidhäftning ger detta tillvägagångssätt en lovande plattform för att förstå kraftregleringsmekanismen för molekylär vidhäftning av rullande celler under skjuvflöde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

Rullande vidhäftning, underlättad av selectin-medierade interaktioner, är en mycket dynamisk, passiv motilitet i rekrytering av leukocyter till inflammationsplatsen. Detta fenomen förekommer i postkapillär venule, där blodflödet skjuter leukocyter i en rullande rörelse på endotelcellerna. Stabil rullning kräver en delikat balans mellan vidhäftningsbindningsbildning och deras mekaniskt drivna dissociation, vilket gör att cellen kan förbli fastsatt på ytan medan den rullar i flödesriktningen. Till skillnad från andra vidhäftningsprocesser som förekommer i relativt statiska miljöer är rullande vidhäftning mycket dynamiskt eftersom de rullande cellerna färdas över tusentals mikron med tiotals mikron per sekund. Följaktligen är konventionella mekanobiologi metoder såsom dragkraft mikroskopi olämpliga för att mäta de enskilda vidhäftningshändelserna och de associerade molekylära krafterna på grund av den korta tidsskala och hög känslighet som krävs. Här beskriver vi vår senaste implementering av vidhäftningsavtrycksanalysen för att avbilda P-selectin: PSGL-1 interaktioner i rullande vidhäftning på molekylär nivå. Denna metod använder irreversibla DNA-baserade spänningsmätare tjudrar för att producera en permanent historia av molekylära vidhäftningshändelser i form av fluorescensspår. Dessa spår kan avbildas på två sätt: (1) sy ihop tusentals diffraktionsbegränsade bilder för att producera ett stort synfält, vilket möjliggör extraktion av vidhäftningsavtryck för varje rullande cell över tusentals mikron i längd, (2) utför DNA-PAINT för att rekonstruera superupplösningsbilder av fluorescensspåren inom ett litet synfält. I denna studie användes vidhäftningsavtrycksanalysen för att studera HL-60 celler som rullar vid olika skjuvspänningar. På så sätt kunde vi avbilda den rumsliga fördelningen av P-selectin: PSGL-1 interaktion och få insikt i deras molekylära krafter genom fluorescensintensitet. Således ger denna metod grunden för den kvantitativa undersökningen av de olika cell-ytan interaktioner som är involverade i rullande vidhäftning på molekylär nivå.

Protokollet ovan beskriver det experimentella förfarandet för vidhäftning fotavtrycksanalysen. Det allmänna experimentarbetsflödet illustreras i figur 1, från flödeskammarens sammansättning (figur 1A) till ytfunktionalisering (figur 1B) och experiment- och bildsteg (figur 1C).
Figur 2 är ett representativt resultat för biokonjugationska...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Detta protokoll presenterar de experimentella förfarandena för att utföra vidhäftning fotavtryck analys för att avbilda vidhäftning händelser under snabb cell rullande vidhäftning.

Imaging Molekylär vidhäftning i cellrullning av vidhäftning fotavtryck analys

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Detta protokoll hjälper till att upprätta sambandet mellan molekylär kraft och cellvalsbeteende förutom att rumsligt kartlägga och kvantifiera rullande vidhäftning på molekylär nivå. Denna teknik gör det möjligt att studera individuella vidhäftning händelser under den faktiska cellrullningen så att vi kan mäta den fysiologiska relevanta molekylära vidhäftningskraften direkt. Ytberedning med lämplig koncentrations- och inkubationstid i varje steg är avgörande för att uppnå högkvalitativ ytfunktionalisering.Kvaliteten på biokonjugationerna och de rätta förhållandena är också avgörande. Visuell demonstration är avgörande för att hjälpa forskare att replikera detta protokoll. I synnerhet kommer stegen som flödeskammare och efterbehandling av bilder att dra stor nytta av en visuell demonstration.Börja med att tunt sprida en liten mängd epoxi på båda sidor av den dubbelsidiga tejpen med ett rakblad. Skär med hjälp av en laser det epoxibelagda bandet för att skapa fyra kanaler. Skapa flödeschipet genom att smöra epoxitejpen mellan en fyrahålsrutschbana och PEG-täckslip.Använd en pipettspets och tryck försiktigt längs kanalernas längd för att skapa en bra tätning och härda sedan epoxiet i minst en timme. Rikta in spånan så att öppningen på varje kanal placeras i adapterns mittpunkter. Placera sedan två genomskinliga akryldistanser ovanpå chipet.Applicera fast tryck i mitten av blocket och skruva i ändarna på varje distans. Skruva fast inloppen i de gängade hålen på andra sidan fästet och övervaka tätningsförhållandet genom det genomskinliga akrylblocket. Flöda 200 mikroliter tvättbuffert in i kammaren för att kontrollera läckage.Om bubblor bildas i kanalen, tryck aggressivt ytterligare 200 mikroliter tvättbuffert för att ta bort bubblorna. Tillsätt 40 mikroliter BSA i flödeskammaren för att förhindra ospecificerad bindning och inkubera i 10 minuter i fuktighetskammaren. Efter inkubation tillsätt 40 mikroliter vid interpolering 20 i flödeskammaren och inkubera igen i 10 minuter för att ytterligare minska den ospecificerade bindningen.Tvätta sedan kanalen med 200 mikroliter tvättbuffert för att ta bort alla passiviseringsmedel. För kammarens ytfunktionalisering, tillsätt 40 mikroliter Streptavidin till flödeskammaren och inkubera i 20 minuter och tvätta sedan kammaren med 200 mikroliter tvättbuffert. Tillsätt nu 40 mikroliter av hybridiserat protein G-TGT till flödeskammaren och inkubera i 20 minuter.Efter tvätt med tvättbuffert, tillsätt 40 mikroliter protein G-TGT toppsträng och inkubera i 20 minuter för att slutföra eventuella ohybridiserade TGT bottensträngar på ytan och tvätta sedan med tvättbuffert. Tillsätt slutligen 40 mikroliter P-selectin-Fc i flödeskammaren och inkubera i 60 minuter innan du tvättar med tvättbuffert. Fyll en fem milliliter glasspruta med den rullande bufferten och knacka på sidorna av sprutan för att lossa och tryck ut bubblorna när de flyter mot spetsen.Efter att ha satt in en steril nål i en 200 millimeters bit polyetenrör, anslut nålen till glasspruten. Fäst sprutan på sprutpumpen och luta sprutpumpen så att kolvens sida är förhöjd för att förhindra att luftbubblor kommer in i kanalen. För in rörets ände i flödeskammarens inlopp.Sätt in ena änden av en annan 200 millimeters bit av polyetenslangen i utloppet och sänk ner den andra änden i en avfalls bägare. Ta en till två milliliter av cellupphängningsprovet och centrifugera för att pelletera cellerna. Ta bort mediet och återanvänd cellerna försiktigt i 500 mikroliter av den rullande bufferten.Koppla försiktigt bort slangen från inloppen och utloppet och pipetten 40 mikroliter av cellupphängningen i flödeskammaren. Återanslut slangen som beskrivits tidigare och se till att bubblor inte förs in i flödeskanalen. Påbörja cellrullningsexperimentet genom att starta sprutpumpen vid önskade flödeshastigheter.Observera cellrullning med hjälp av ett mörkt fältmikroskop med ett 10X-mål. När experimentet är klart tar du bort cellerna från kanalen genom att ingjuta den rullande bufferten med 100 milliliter per timme tills ytan är cellfri. För att avbilda de lokala spåren med DNA-PAINT, tillsätt 40 mikroliter DNA-PAINT-bildsträng som beretts i DNA-PAINT-buffert till kanalen.Utför total intern reflektion fluorescensmikroskopi med hjälp av de villkor som nämns i textmanuskriptet. Lokalisera och återge superupplösningsbilderna. För att avbilda de långa spåren genom permanent märkning, lägg till den permanenta bildsträngen och inkubera i 120 sekunder i T50M5-buffert.Tvätta sedan kanalen genom att ingjuta 200 mikroliter tvättbuffert. Spela in en bild med excitationslasern avstängd för att få bakgrundskamerabrus. Föreställ dig ett stort område i ett rutnätsmönster av TIRF-mikroskopi.Programmera mikroskopet för att skanna över området 400 med 50 bilder och dela upp rådata i enskilda TIP-filer som var och en innehåller högst 10 000 bilder med ImageJ-programmet. Platta till alla bilder med belysningsprofilen och använd MIST-plugin för att sy bilderna. Resultatet för proteinet G ssDNA biokonjugation karakterisering visade en nästan en är till ett förhållande av protein G till ssDNA där proteinet G Maleimide ssDNA och imidazol elution buffertspektra från ortogonala grunden för anpassning till biokonjugation produktspektrumet.Native PAGE användes för att bekräfta biokonjugationen som visar de ljusgröna banden som sammanfaller med det monomeriska proteinet G-bandet som indikerar framgångsrik konjugation och bra utbyte. TIRF-belysningsprofilen som introduceras från en enlägesfiber är i allmänhet ljusare i mitten av synfältet och dimmer runt kanterna. För att kompensera för den ojämna belysningen och platta till bilderna för kvantitativ analys bestämdes belysningsprofilen av i genomsnitt tusentals enskilda ramar.Tillplattade bilder producerades genom att dra av kamerabruset från både rå- och belysningsprofiler och sedan normaliseras av belysningsprofilen. Råa sömmar visade tydliga periodiska mönster som motsvarar de okorrigerade bilderna, medan samma synfält sys från tillplattade bilder producerade en platt bakgrund. En ramp upp flöde profil användes för att bestämma intervallet av skjuvning stress vilket resulterar i cell rullande och avkastning fluorescens spår under vilken en typisk en-cells vidhäftning fotavtryck kunde ses.Suboptimala och optimala resultat av fluorescerande spår med otillräcklig kontrast, överdriven spårtäthet, optimal spårtäthet och kontrast och diffraktion begränsad och DNA-PAINT imaging visas. inkubationstid på mer än 60 minuter säkerställer ytfunktionalisering och korrekt kammarkonstruktion förhindrar passage av bubblor som skadar funktionaliserad yta. Denna procedur är tillämplig för kvantitativ analys av molekylär kraft involverad i rullande vidhäftning och gör det möjligt för forskare att förstå det rullande beteendet hos de olika celltyperna.Denna teknik gör det möjligt för forskare att utforska nya frågor om snabba vidhäftningshändelser som leder till ytterligare framsteg av enstaka molekyler och mekanobiologiforskning.

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Analys för vidhäftningsförmåga och agar Invasion i S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Dissekering av Organizer och Animal explants Pole från Xenopus laevis Embryon och församlingen i en cell Adhesion analys

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel Cell Inkapsling av Droppar

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

Ett beteende analys för att mäta lyhördhet Zebrafish till förändringar i ljusintensiteter

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Trombocyter vidhäftningsförmåga och sammanläggning enligt flödet med Mikroflödessystem Flow celler

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging analys för bedömning av roller Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Och sfingomyelinas i Reparation av por-bildande Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Aktivera Autophagy av aerob träning hos möss

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analysera cellytan Adhesion Remodeling som svar på mekaniska spänningar med användning av magnetiska pärlor

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...