Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Bu çalışma Kanada İnovasyon Vakfı (CFI 35492), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Sağlık Araştırmaları Vakfı (SCH-2020-0559) ve British Columbia Üniversitesi Saygınlık Fonu tarafından desteklendi.

1. Oligonükleotid etiketleme ve hibridizasyon
<ol><li>Protein G disülfid bağlarının azaltılması<ol>
<li>10 mg Protein G'yi (ProtG) 1 mL ultra saf suda çözün. NOT: Buradaki Protein G, C-terminusta tek bir sistein kalıntısı ve N-terminus poli-histidin etiketi ile modifiye edilir.</li>
		<li>Tampon değişimi ≥20 μL ProtG (10 mg/mL) ile P6 sütunu ile 1x PBS (pH 7.2) içine.</li>
		<li>Tampon değişiminden sonra protein konsantrasyonunu ölçün. NOT: Tipik konsantrasyon 7-8 mg/mL.<...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

Yapışma ayak izi tahlili, hücre yuvarlama yapışması sırasında PSGL-1 ve P-selectin arasındaki moleküler yapışma olaylarının görselleştirilmesini sağlar. Bu işlem P-selectin aracılı yakalama ve ardından akışkan kesme stresi altında yuvarlanma ile başlatılır. Deney sırasındaki potansiyel sorunlar genellikle hücreler iyi yuvarlandığında bile zayıf hücre yuvarlanmasını veya floresan izlerinin eksik olduğunu içerir. Bu sorunlar genellikle sorun giderme tablosunda listelendiği gibi proto...

Yuvarlanan yapışma kaskadı, dolaşımdaki hücrelerin kan damarı duvarına nasıl bağlı olduğunu ve yuvarlanmasını açıklar1. Pasif haddeleme öncelikle hücresel yapışma moleküllerinin (CAM)1 ana sınıfı olan selectinler tarafından aracılık edilir. Kanın kesme akışı altında, P-selectin glikoprotein ligand-1'i (PSGL-1) ifade eden lökositler, iltihaplı endotel hücrelerinin yüzeyinde ifade edilebilecek P-selectin ile oldukça geçici bağlar oluşturur. Bu işlem lökositlerin iltihaplanma bölgesine göç etmesi için kritik öneme sahiptir2. Buna ek olarak, PSGL-1 aynı zamanda P-selectin3 ile etkileşimi üzerine yuvarlanan yapışma basamaklamanın sonraki sıkı yapışma aşamasını tetikleyebilen bir mekanosensitive reseptördür.
CAM fonksiyonunu etkileyen genetik mutasyonlar, lökosit yapışma eksikliğinin (LAD) nadir görülen hastalığı gibi bağışıklık sistemini ciddi şekilde etkileyebilir, burada yuvarlanmaya aracılık eden yapışma moleküllerinin arızalanması ciddi şekilde bağışıklık sistemi baskılanmış bireylere yol açar4,5,6. Ek olarak, dolaşımdaki tümör hücrelerinin benzer bir yuvarlanma sürecini takiben göç ettiği ve metastaz7,8'e yol açtığına gösterilmiştir. Bununla birlikte, hücre haddeleme hızlı ve dinamik olduğundan, geleneksel deneysel mekanobiyoloji yöntemleri hücre yuvarlanması sırasında moleküler etkileşimleri incelemek için uygun değildir. Atomik kuvvet mikroskopisi ve optik cımbız gibi tek hücreli ve tek moleküllü manipülasyon yöntemleri, P-selectin'in PSGL-1 ile tek molekül seviyesinde kuvvete bağımlı etkileşimi9 gibi moleküler etkileşimleri inceleyebilebilirken, hücre yuvarlanması sırasında canlı yapışma olaylarını araştırmak için uygun değildir. Ek olarak, in vitro karakterize etkileşim, moleküler yapışma in vivo hakkındaki soruyu doğrudan cevaplayamaz. Örneğin, hücreler kendi ortamlarında çalışırken hangi moleküler gerilim aralığı biyolojik olarak ilgilidir? Yapışkan dinamiği simülasyonu10 veya basit sabit durum modeli11 gibi hesaplama yöntemleri, belirli moleküler ayrıntıları ve yuvarlanma davranışını nasıl etkilediklerini yakalamış, ancak modelleme parametrelerinin ve varsayımlarının doğruluğuna son derece bağlıdır. Çekme kuvveti mikroskopisi gibi diğer teknikler hücre göçü sırasında kuvvetleri tespit edebilir, ancak moleküler gerilim hakkında yeterli mekansal çözünürlük veya nicel bilgi sağlamaz. Bu tekniklerin hiçbiri, kendi ortamlarındaki hücre fonksiyonu ve davranışıyla doğrudan ilişkili olan moleküler kuvvetlerin zamansal dinamikleri, mekansal dağılımı ve büyüklük heterojenliği hakkında doğrudan deneysel gözlemler sağlayamaz.
Bu nedenle, selep aracılı etkileşimleri doğru bir şekilde ölçebilen bir moleküler kuvvet sensörü uygulamak, yuvarlanma yapışma anlayışımızı geliştirmek için çok önemlidir. Burada, PSGL-1 kaplamalı boncukların p-selectin fonksiyonelleştirilmiş gerilim ölçer tethers (TGTs)13 sunan bir yüzeye yuvarlandığı yapışkan ayak izi tahlil12 protokolünü açıklıyoruz. Bu TGT'ler, floresan okuma şeklinde kalıcı yırtılma olaylarının geçmişine neden olan geri dönüşü olmayan DNA tabanlı kuvvet sensörleridir. Bu, TGT'nin (dsDNA) yırtılması ve daha sonra yırtılan TGT'nin (ssDNA) floresan etiketli tamamlayıcı iplikçikle etiketlenerek elde edilir. Bu sistemin en büyük avantajlarından biri, hem kırınım sınırlı hem de süper çözünürlüklü görüntüleme ile uyumluluğudur. Floresan etiketli tamamlayıcı iplikçik, kırınım sınırlı görüntüleme için kalıcı olarak (>12 bp) veya DNA PAINT aracılığıyla süper çözünürlüklü görüntüleme için geçici olarak bağlanabilir (7-9 bp). Bu, TGT'ler aktif haddeleme sırasında yırtıldığı için yuvarlanma yapışıklıklarını incelemek için ideal bir sistemdir, ancak floresan okuma yuvarlanma sonrası analiz edilir. İki görüntüleme yöntemi ayrıca kullanıcıya yuvarlanan yapışıklıkları araştırmak için daha fazla özgürlük sağlar. Tipik olarak, kırınım sınırlı görüntüleme floresan yoğunluğu üzerinden moleküler yırtılma kuvveti çıkarmak için yararlıdır13, süper çözünürlüklü görüntüleme ise reseptör yoğunluğunun nicel analizine izin verir. Haddeleme yapışmasının bu özelliklerini araştırma yeteneği ile bu yaklaşım, yuvarlanan hücrelerin kesme akışı altında moleküler yapışması üzerindeki kuvvet düzenleme mekanizmasını anlamak için umut verici bir platform sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

Selelin aracılı etkileşimlerle kolaylaştırılan yuvarlanan yapışıklık, lökositlerin iltihaplanma bölgesine alınmasında son derece dinamik, pasif bir hareketliliktir. Bu fenomen, kan akışının endotel hücreleri üzerinde yuvarlanan bir hareketle lökositleri ittiği postkapsiller venülelerde ortaya çıkar. Kararlı haddeleme, yapışma bağı oluşumu ile mekanik olarak tahrik edilen ayrışmaları arasında hassas bir denge gerektirir ve hücrenin akış yönünde yuvarlanırken yüzeye bağlı kalmasını sağlar. Nispeten statik ortamlarda meydana gelen diğer yapışma işlemlerinin aksine, yuvarlanan hücreler saniyede onlarca mikronda binlerce mikronun üzerinde hareket ettiği için yuvarlanan yapışma son derece dinamiktir. Sonuç olarak, çekiş kuvveti mikroskopisi gibi geleneksel mekanobiyoloji yöntemleri, gerekli kısa zaman ölçeği ve yüksek hassasiyet nedeniyle bireysel yapışma olaylarını ve ilişkili moleküler kuvvetleri ölçmek için uygun değildir. Burada, P-selectin: PSGL-1 etkileşimlerini moleküler düzeyde yuvarlanma yapışmasında görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testinin en son uygulamasını açıklıyoruz. Bu yöntem, floresan izleri şeklinde moleküler yapışma olaylarının kalıcı bir geçmişini üretmek için geri dönüşü olmayan DNA tabanlı gerilim ölçer tethers kullanır. Bu izler iki şekilde görüntülenebilir: (1) geniş bir görüş alanı oluşturmak için kırınım sınırlı binlerce görüntüyü bir araya getirmek, her yuvarlanan hücrenin binlerce mikron uzunluğundaki yapışma ayak izinin çıkarılmasını sağlamak, (2) floresan izlerinin süper çözünürlüklü görüntülerini küçük bir görüş alanı içinde yeniden oluşturmak için DNA-PAINT gerçekleştirmek. Bu çalışmada, farklı kesme gerilmelerinde yuvarlanan HL-60 hücrelerini incelemek için yapışkan ayak izi tahlili kullanılmıştır. Bunu yaparken, P-selectin: PSGL-1 etkileşiminin mekansal dağılımını görüntüleyebildik ve floresan yoğunluğu ile moleküler güçleri hakkında fikir edindik. Bu nedenle, bu yöntem moleküler düzeyde yuvarlanan yapışmada yer alan çeşitli hücre-yüzey etkileşimlerinin nicel olarak araştırılması için zemin hazırlar.

Yukarıdaki protokol, yapışkan ayak izi testinin deneysel prosedürünü açıklar. Genel deney iş akışı Şekil 1'de, akış odası montajından (Şekil 1A) yüzey fonksiyonelleştirmesine (Şekil 1B) ve deney ve görüntüleme adımlarına (Şekil 1C) kadar gösterilmiştir.
Şekil 2 , ProtG-ssDNA biyokonjugasyon karakterizasyonu için tem...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Bu protokol, moleküler düzeyde yuvarlanan yapışma ve uzamsal haritalama ve ölçmeye izin vermenin yanı sıra moleküler kuvvet ve hücre yuvarlanma davranışı arasındaki bağlantıyı kurmaya yardımcı olur. Bu teknik, gerçek hücre yuvarlanması sırasında bireysel yapışma olaylarını incelememizi sağlayarak fizyolojik ilgili moleküler yapışma kuvvetini doğrudan ölçmemizi sağlar. Her adımda uygun konsantrasyon ve kuluçka süresini kullanarak yüzey hazırlığı, yüksek kaliteli yüzey fonksiyonelleştirmesi elde etmek için çok önemlidir.Biyokonjugasyonların kalitesi ve uygun koşullar da çok önemlidir. Görsel gösterim, araştırmacıların bu protokolü çoğaltmasına yardımcı olmak için kritik öneme sahiptir. Özellikle, akış odası montajı ve işlem sonrası görüntüler gibi adımlar görsel bir gösteriden büyük fayda sağlayacaktır.Çift taraflı bandın her iki tarafına jiletle az miktarda epoksi serperek başlayın. Lazer kullanarak, dört kanal oluşturmak için epoksi kaplı bandı kesin. Epoksi bandı dört delikli bir slayt ve PEG kapak kapağı arasına sıkıştırarak akış çipini oluşturun.Pipet ucu kullanarak, iyi bir conta oluşturmak için kanalların uzunluğu boyunca hafif basınç uygulayın, ardından epoksiyi en az bir saat boyunca iyileştirin. Çipi, her kanalın açılması adaptörün merkezlerine yer olacak şekilde hizalayın. Ardından çipin üzerine iki şeffaf akrilik ara parça yerleştirin.Bloğun ortasına sıkı basınç uygulayın ve her ara çubuğun uçlarını vidalayın. Girişleri braketin diğer tarafındaki dişli deliklere vidaleyin ve şeffaf akrilik blok aracılığıyla sızdırmazlık durumunu izleyin. Sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için hazneye 200 mikrolitre yıkama tamponu akışı.Kanalda kabarcıklar oluşursa, kabarcıkları çıkarmak için agresif bir şekilde 200 mikrolitrelik ek bir yıkama tamponu itin. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için akış odasına 40 mikrolitre BSA ekleyin ve nem odasında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, akış odasına Tween 20'de 40 mikrolitre ekleyin ve spesifik olmayan bağlamayı daha da azaltmak için 10 dakika boyunca tekrar kuluçkaya yatırın.Ardından, tüm pasivasyon maddelerini çıkarmak için kanalı 200 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın. Oda yüzeyi fonksiyonelleştirme için, akış odasına 40 mikrolitre Streptavidin ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın, ardından odayı 200 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın. Şimdi, akış odasına 40 mikrolitre melezlenmiş protein G-TGT ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın.Yıkama tamponu ile yıkadıktan sonra, 40 mikrolitre protein G-TGT üst iplikçik ekleyin ve yüzeydeki herhangi bir yibridize edilmemiş TGT alt telini tamamlamak için 20 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından yıkama tamponu ile yıkayın. Son olarak, akış odasına 40 mikrolitre P-selectin-Fc ekleyin ve yıkama tamponu ile yıkamadan önce 60 dakika kuluçkaya yatırın. Beş mililitrelik bir cam şırınnayı yuvarlanan tamponla doldurun ve şırınnanın kenarlarına dokunarak dışarı çıkın ve kabarcıkları ulaya doğru yüzerken dışarı itin.200 milimetrelik bir polietilen boru parçasına steril bir iğne yerleştirdikten sonra, iğneyi cam şırıngaya bağlayın. Şırınd'ı şırındıcı pompaya sabitleyin ve şırınna pompasını, hava kabarcıklarının kanala girmesini önlemek için piston tarafı yükselecek şekilde eğin. Tüpün ucını akış odası girişine yerleştirin.Polietilen borunun 200 milimetrelik başka bir parçasının bir ucunu prize yerleştirin ve diğer ucunu atık bir kabın içine batırın. Hücreleri peletmek için hücre süspansiyon örneğinden bir ila iki mililitre alın ve santrifüj alın. Ortamı çıkarın ve hücreleri yuvarlanan tamponun 500 mikrolitresinde hafifçe yeniden biriktirin.Boruyu girişlerden ve hücre süspansiyonunun 40 mikrolitresini akış odasına çıkış ve pipetten dikkatlice çıkarın. Kabarcıkların akış kanalına sokulmamasını sağlamak için boruyu daha önce açıklandığı gibi yeniden bağlayın. Şırınd pompasını istediğiniz akış hızlarında başlatarak hücre haddeleme deneyine başlayın.10X hedefi olan karanlık alan mikroskobu kullanarak hücre yuvarlanma gözlemleyin. Deneme tamamlandıktan sonra, yüzey hücre serbest kalana kadar yuvarlanan arabelleği saatte 100 mililitrede aşılayarak hücreleri kanaldan çıkarın. Yerel parçaları DNA-PAINT ile görüntülemek için kanala DNA-PAINT tamponunda hazırlanmış 40 mikrolitre DNA-PAINT görüntüleyiç teli ekleyin.Metin el yazmasında belirtilen koşulları kullanarak toplam iç yansıma floresan mikroskopisi gerçekleştirin. Süper çözünürlüklü görüntüleri yerelleştirin ve işleyin. Uzun parçaları kalıcı etiketleme ile görüntülemek için kalıcı görüntüleyicİ telini ekleyin ve T50M5 tamponunda 120 saniye kuluçkaya yatırın.Daha sonra 200 mikrolitre yıkama tamponu aşılayarak kanalı yıkayın. Arka plan kamerası gürültüsü elde etmek için heyecan lazeri kapalıyken bir görüntü kaydedin. TIRF mikroskopisi ile ızgara deseninde geniş bir alanı görüntüleyin.Mikroskobu 400'e 50 görüntü alanını taramak ve raw verileri ImageJ programını kullanarak her biri en fazla 10.000 görüntü içeren tek tek TIP dosyalarına bölmek için programlayın. Aydınlatma profilini kullanarak tüm görüntüleri düzleştirin ve görüntüleri dikmek için MIST eklentisini kullanın. Protein G ssDNA biyokonjugasyon karakterizasyonu için sonuç, G Maleimide ssDNA ve imidazol elution tampon spektrumunun biyokonjugasyon ürün spektrumuna uyum sağlamak için ortogonal temelden geldiği protein G'nin ssDNA'ya bir oranına yakın olduğunu göstermiştir.Native PAGE, başarılı konjugasyon ve iyi verim gösteren monomerik protein G bandına denk gelen parlak yeşil bantları gösteren biyokonjugasyonu doğrulamak için kullanıldı. Tek modlu fiberden sunulan TIRF aydınlatma profili genellikle görüş alanının ortasında daha parlaktır ve kenarların etrafında karartıcıdır. Düzensiz aydınlatmayı telafi etmek ve nicel analiz için görüntüleri düzleştirmek için aydınlatma profili, ortalama binlerce ayrı çerçeve ile belirlendi.Düzleştirilmiş görüntüler, kamera gürültüsünün hem ham hem de aydınlatma profillerinden çıkarılması ve daha sonra aydınlatma profili ile normalleştirilmesiyle üretildi. Ham dikiş, düzeltilmemiş görüntülere karşılık gelen net periyodik desenler gösterirken, düzleştirilmiş görüntülerden dikilen aynı görüş alanı düz bir arka plan oluşturdu. Hücre yuvarlanması ve tipik bir tek hücreli yapışıklık ayak izinin görülebileceği floresan izleri ile sonuçlanan kesme stresi aralığını belirlemek için bir rampa yukarı akış profili kullanılmıştır.Yetersiz kontrast, aşırı iz yoğunluğu, optimum iz yoğunluğu ve kontrastı ile kırınım sınırlı ve DNA-PAINT görüntüleme ile floresan izlerin yetersiz ve optimum sonuçları gösterilmiştir. 60 dakikadan uzun kuluçka süresi, yüzey fonksiyonelleştirmesini sağlar ve uygun oda yapısı fonksiyonel yüzeye zarar veren kabarcıkların geçişini önler. Bu prosedür, yuvarlanan yapışmada rol oynayan moleküler kuvvetin nicel analizi için geçerlidir ve araştırmacıların farklı hücre tiplerinin yuvarlanma davranışını anlamalarını sağlar.Bu teknik, araştırmacıların tek molekül ve mekanobiyoloji araştırmalarının daha da ilerlemesine yol açan hızlı yapışma olaylarıyla ilgili yeni soruları keşfetmelerini sağlar.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

S. cerevisiae yapışma ve Agar Invasion için Testi

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Biyoloji

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Organizatör ve Hayvan Kutbu eksplantlar Xenopus laevis Embriyolar ve Hücre Yapışma Testi Meclisi diseksiyonu

Title Cell Encapsulation by Droplets

Droplets tarafından Başlığı Hücre Kapsülleme

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

Farelerde Aerobik Egzersiz ile Autophagy etkinleştirme

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...