Name: imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Bu çalışma Kanada İnovasyon Vakfı (CFI 35492), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Sağlık Araştırmaları Vakfı (SCH-2020-0559) ve British Columbia Üniversitesi Saygınlık Fonu tarafından desteklendi.

1. Oligonükleotid etiketleme ve hibridizasyon
<ol><li>Protein G disülfid bağlarının azaltılması<ol>
<li>10 mg Protein G'yi (ProtG) 1 mL ultra saf suda çözün. NOT: Buradaki Protein G, C-terminusta tek bir sistein kalıntısı ve N-terminus poli-histidin etiketi ile modifiye edilir.</li>
		<li>Tampon değişimi ≥20 μL ProtG (10 mg/mL) ile P6 sütunu ile 1x PBS (pH 7.2) içine.</li>
		<li>Tampon değişiminden sonra protein konsantrasyonunu ölçün. NOT: Tipik konsantrasyon 7-8 mg/mL.<...

<ol>
	<li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+cell+adhesion.">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li><li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease.">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li><li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li><li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiencies.">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li><li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade:+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation.">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li><li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling/adhesion+and+metastasis.">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li><li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules.">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li><li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+dynamics.">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution.">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li><li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting.">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).</li><li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting.">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li><li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prepare+reproducible,+homogeneous,+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica.">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li><li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li><li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST:+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization.">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors.">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction.">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li><li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway.">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).</li><li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A:+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device.">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li><li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors.">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li><li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+molecular+tension-classifications,+interpretations+and+limitations+of+force+sensors.">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).</li></ol>

Yapışma ayak izi tahlili, hücre yuvarlama yapışması sırasında PSGL-1 ve P-selectin arasındaki moleküler yapışma olaylarının görselleştirilmesini sağlar. Bu işlem P-selectin aracılı yakalama ve ardından akışkan kesme stresi altında yuvarlanma ile başlatılır. Deney sırasındaki potansiyel sorunlar genellikle hücreler iyi yuvarlandığında bile zayıf hücre yuvarlanmasını veya floresan izlerinin eksik olduğunu içerir. Bu sorunlar genellikle sorun giderme tablosunda listelendiği gibi proto...

Yuvarlanan yapışma kaskadı, dolaşımdaki hücrelerin kan damarı duvarına nasıl bağlı olduğunu ve yuvarlanmasını açıklar1. Pasif haddeleme öncelikle hücresel yapışma moleküllerinin (CAM)1 ana sınıfı olan selectinler tarafından aracılık edilir. Kanın kesme akışı altında, P-selectin glikoprotein ligand-1'i (PSGL-1) ifade eden lökositler, iltihaplı endotel hücrelerinin yüzeyinde ifade edilebilecek P-selectin ile oldukça geçici bağlar oluşturur. Bu işlem lökositlerin iltihaplanma bölgesine göç etmesi için kritik öneme sahiptir2. Buna ek olarak, PSGL-1 aynı zamanda P-selectin3 ile etkileşimi üzerine yuvarlanan yapışma basamaklamanın sonraki sıkı yapışma aşamasını tetikleyebilen bir mekanosensitive reseptördür.
CAM fonksiyonunu etkileyen genetik mutasyonlar, lökosit yapışma eksikliğinin (LAD) nadir görülen hastalığı gibi bağışıklık sistemini ciddi şekilde etkileyebilir, burada yuvarlanmaya aracılık eden yapışma moleküllerinin arızalanması ciddi şekilde bağışıklık sistemi baskılanmış bireylere yol açar4,5,6. Ek olarak, dolaşımdaki tümör hücrelerinin benzer bir yuvarlanma sürecini takiben göç ettiği ve metastaz7,8'e yol açtığına gösterilmiştir. Bununla birlikte, hücre haddeleme hızlı ve dinamik olduğundan, geleneksel deneysel mekanobiyoloji yöntemleri hücre yuvarlanması sırasında moleküler etkileşimleri incelemek için uygun değildir. Atomik kuvvet mikroskopisi ve optik cımbız gibi tek hücreli ve tek moleküllü manipülasyon yöntemleri, P-selectin'in PSGL-1 ile tek molekül seviyesinde kuvvete bağımlı etkileşimi9 gibi moleküler etkileşimleri inceleyebilebilirken, hücre yuvarlanması sırasında canlı yapışma olaylarını araştırmak için uygun değildir. Ek olarak, in vitro karakterize etkileşim, moleküler yapışma in vivo hakkındaki soruyu doğrudan cevaplayamaz. Örneğin, hücreler kendi ortamlarında çalışırken hangi moleküler gerilim aralığı biyolojik olarak ilgilidir? Yapışkan dinamiği simülasyonu10 veya basit sabit durum modeli11 gibi hesaplama yöntemleri, belirli moleküler ayrıntıları ve yuvarlanma davranışını nasıl etkilediklerini yakalamış, ancak modelleme parametrelerinin ve varsayımlarının doğruluğuna son derece bağlıdır. Çekme kuvveti mikroskopisi gibi diğer teknikler hücre göçü sırasında kuvvetleri tespit edebilir, ancak moleküler gerilim hakkında yeterli mekansal çözünürlük veya nicel bilgi sağlamaz. Bu tekniklerin hiçbiri, kendi ortamlarındaki hücre fonksiyonu ve davranışıyla doğrudan ilişkili olan moleküler kuvvetlerin zamansal dinamikleri, mekansal dağılımı ve büyüklük heterojenliği hakkında doğrudan deneysel gözlemler sağlayamaz.
Bu nedenle, selep aracılı etkileşimleri doğru bir şekilde ölçebilen bir moleküler kuvvet sensörü uygulamak, yuvarlanma yapışma anlayışımızı geliştirmek için çok önemlidir. Burada, PSGL-1 kaplamalı boncukların p-selectin fonksiyonelleştirilmiş gerilim ölçer tethers (TGTs)13 sunan bir yüzeye yuvarlandığı yapışkan ayak izi tahlil12 protokolünü açıklıyoruz. Bu TGT'ler, floresan okuma şeklinde kalıcı yırtılma olaylarının geçmişine neden olan geri dönüşü olmayan DNA tabanlı kuvvet sensörleridir. Bu, TGT'nin (dsDNA) yırtılması ve daha sonra yırtılan TGT'nin (ssDNA) floresan etiketli tamamlayıcı iplikçikle etiketlenerek elde edilir. Bu sistemin en büyük avantajlarından biri, hem kırınım sınırlı hem de süper çözünürlüklü görüntüleme ile uyumluluğudur. Floresan etiketli tamamlayıcı iplikçik, kırınım sınırlı görüntüleme için kalıcı olarak (>12 bp) veya DNA PAINT aracılığıyla süper çözünürlüklü görüntüleme için geçici olarak bağlanabilir (7-9 bp). Bu, TGT'ler aktif haddeleme sırasında yırtıldığı için yuvarlanma yapışıklıklarını incelemek için ideal bir sistemdir, ancak floresan okuma yuvarlanma sonrası analiz edilir. İki görüntüleme yöntemi ayrıca kullanıcıya yuvarlanan yapışıklıkları araştırmak için daha fazla özgürlük sağlar. Tipik olarak, kırınım sınırlı görüntüleme floresan yoğunluğu üzerinden moleküler yırtılma kuvveti çıkarmak için yararlıdır13, süper çözünürlüklü görüntüleme ise reseptör yoğunluğunun nicel analizine izin verir. Haddeleme yapışmasının bu özelliklerini araştırma yeteneği ile bu yaklaşım, yuvarlanan hücrelerin kesme akışı altında moleküler yapışması üzerindeki kuvvet düzenleme mekanizmasını anlamak için umut verici bir platform sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-channel drill guide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-holes slide</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1101-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic spacer</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium chip holder</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>L14043</td>
			<td>CAS 1760-24-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td>Pen/Strep/Fungiezone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads, ProtG coated polystyrene</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PGP-60-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, DNA PAINT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, T50M5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Rolling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer, Wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated sulfuric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3072-2.5LG</td>
			<td>95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holding tweezers</td>
			<td>Techni-Tool</td>
			<td>758TW150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-coated drill bits</td>
			<td>Abrasive technology</td>
			<td>C5250510</td>
			<td>0.75 mm diamond drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, amine-ssDNA (top strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for DNA-PAINT</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA, imager strand for permanent labelling</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Custom oligo</td>
			<td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>237</td>
			<td>3/4 inch width, permanent double-sided tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>42001</td>
			<td>5 minute curing time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelGreen</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3094-2.5LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-026</td>
			<td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass, Staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74830-150</td>
			<td>Wheaton Staining Jar (900620)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-315Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber slide support</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed with ABS filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7690-1</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlets/outlets</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm&#160; polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32&#8221; O.D. 3/32&#8221;) into each hollow setscrew</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ni-NTA beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mailer tubes</td>
			<td>EMS</td>
			<td>EMS71406-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7326200</td>
			<td>In SSC Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-biotin</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Protein G</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab155724</td>
			<td>N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, P-selectin-Fc</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>137-PS</td>
			<td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein, Streptavidin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL1005-01-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ward&#8217;s Science</td>
			<td>470302-444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81520</td>
			<td>Syringes with PTFE luer lock, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305115</td>
			<td>Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4502-500GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Adaptor</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>Formulation 3350, I.D. 1/32&#8221;; O.D. 3/32&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Polyethylene</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging molecular adhesion in cell rolling by adhesion footprint assay

Selelin aracılı etkileşimlerle kolaylaştırılan yuvarlanan yapışıklık, lökositlerin iltihaplanma bölgesine alınmasında son derece dinamik, pasif bir hareketliliktir. Bu fenomen, kan akışının endotel hücreleri üzerinde yuvarlanan bir hareketle lökositleri ittiği postkapsiller venülelerde ortaya çıkar. Kararlı haddeleme, yapışma bağı oluşumu ile mekanik olarak tahrik edilen ayrışmaları arasında hassas bir denge gerektirir ve hücrenin akış yönünde yuvarlanırken yüzeye bağlı kalmasını sağlar. Nispeten statik ortamlarda meydana gelen diğer yapışma işlemlerinin aksine, yuvarlanan hücreler saniyede onlarca mikronda binlerce mikronun üzerinde hareket ettiği için yuvarlanan yapışma son derece dinamiktir. Sonuç olarak, çekiş kuvveti mikroskopisi gibi geleneksel mekanobiyoloji yöntemleri, gerekli kısa zaman ölçeği ve yüksek hassasiyet nedeniyle bireysel yapışma olaylarını ve ilişkili moleküler kuvvetleri ölçmek için uygun değildir. Burada, P-selectin: PSGL-1 etkileşimlerini moleküler düzeyde yuvarlanma yapışmasında görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testinin en son uygulamasını açıklıyoruz. Bu yöntem, floresan izleri şeklinde moleküler yapışma olaylarının kalıcı bir geçmişini üretmek için geri dönüşü olmayan DNA tabanlı gerilim ölçer tethers kullanır. Bu izler iki şekilde görüntülenebilir: (1) geniş bir görüş alanı oluşturmak için kırınım sınırlı binlerce görüntüyü bir araya getirmek, her yuvarlanan hücrenin binlerce mikron uzunluğundaki yapışma ayak izinin çıkarılmasını sağlamak, (2) floresan izlerinin süper çözünürlüklü görüntülerini küçük bir görüş alanı içinde yeniden oluşturmak için DNA-PAINT gerçekleştirmek. Bu çalışmada, farklı kesme gerilmelerinde yuvarlanan HL-60 hücrelerini incelemek için yapışkan ayak izi tahlili kullanılmıştır. Bunu yaparken, P-selectin: PSGL-1 etkileşiminin mekansal dağılımını görüntüleyebildik ve floresan yoğunluğu ile moleküler güçleri hakkında fikir edindik. Bu nedenle, bu yöntem moleküler düzeyde yuvarlanan yapışmada yer alan çeşitli hücre-yüzey etkileşimlerinin nicel olarak araştırılması için zemin hazırlar.

Yukarıdaki protokol, yapışkan ayak izi testinin deneysel prosedürünü açıklar. Genel deney iş akışı Şekil 1'de, akış odası montajından (Şekil 1A) yüzey fonksiyonelleştirmesine (Şekil 1B) ve deney ve görüntüleme adımlarına (Şekil 1C) kadar gösterilmiştir.
Şekil 2 , ProtG-ssDNA biyokonjugasyon karakterizasyonu için tem...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay at JoVE.com

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Bu protokol, moleküler düzeyde yuvarlanan yapışma ve uzamsal haritalama ve ölçmeye izin vermenin yanı sıra moleküler kuvvet ve hücre yuvarlanma davranışı arasındaki bağlantıyı kurmaya yardımcı olur. Bu teknik, gerçek hücre yuvarlanması sırasında bireysel yapışma olaylarını incelememizi sağlayarak fizyolojik ilgili moleküler yapışma kuvvetini doğrudan ölçmemizi sağlar. Her adımda uygun konsantrasyon ve kuluçka süresini kullanarak yüzey hazırlığı, yüksek kaliteli yüzey fonksiyonelleştirmesi elde etmek için çok önemlidir.Biyokonjugasyonların kalitesi ve uygun koşullar da çok önemlidir. Görsel gösterim, araştırmacıların bu protokolü çoğaltmasına yardımcı olmak için kritik öneme sahiptir. Özellikle, akış odası montajı ve işlem sonrası görüntüler gibi adımlar görsel bir gösteriden büyük fayda sağlayacaktır.Çift taraflı bandın her iki tarafına jiletle az miktarda epoksi serperek başlayın. Lazer kullanarak, dört kanal oluşturmak için epoksi kaplı bandı kesin. Epoksi bandı dört delikli bir slayt ve PEG kapak kapağı arasına sıkıştırarak akış çipini oluşturun.Pipet ucu kullanarak, iyi bir conta oluşturmak için kanalların uzunluğu boyunca hafif basınç uygulayın, ardından epoksiyi en az bir saat boyunca iyileştirin. Çipi, her kanalın açılması adaptörün merkezlerine yer olacak şekilde hizalayın. Ardından çipin üzerine iki şeffaf akrilik ara parça yerleştirin.Bloğun ortasına sıkı basınç uygulayın ve her ara çubuğun uçlarını vidalayın. Girişleri braketin diğer tarafındaki dişli deliklere vidaleyin ve şeffaf akrilik blok aracılığıyla sızdırmazlık durumunu izleyin. Sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için hazneye 200 mikrolitre yıkama tamponu akışı.Kanalda kabarcıklar oluşursa, kabarcıkları çıkarmak için agresif bir şekilde 200 mikrolitrelik ek bir yıkama tamponu itin. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için akış odasına 40 mikrolitre BSA ekleyin ve nem odasında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, akış odasına Tween 20'de 40 mikrolitre ekleyin ve spesifik olmayan bağlamayı daha da azaltmak için 10 dakika boyunca tekrar kuluçkaya yatırın.Ardından, tüm pasivasyon maddelerini çıkarmak için kanalı 200 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın. Oda yüzeyi fonksiyonelleştirme için, akış odasına 40 mikrolitre Streptavidin ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın, ardından odayı 200 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın. Şimdi, akış odasına 40 mikrolitre melezlenmiş protein G-TGT ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın.Yıkama tamponu ile yıkadıktan sonra, 40 mikrolitre protein G-TGT üst iplikçik ekleyin ve yüzeydeki herhangi bir yibridize edilmemiş TGT alt telini tamamlamak için 20 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından yıkama tamponu ile yıkayın. Son olarak, akış odasına 40 mikrolitre P-selectin-Fc ekleyin ve yıkama tamponu ile yıkamadan önce 60 dakika kuluçkaya yatırın. Beş mililitrelik bir cam şırınnayı yuvarlanan tamponla doldurun ve şırınnanın kenarlarına dokunarak dışarı çıkın ve kabarcıkları ulaya doğru yüzerken dışarı itin.200 milimetrelik bir polietilen boru parçasına steril bir iğne yerleştirdikten sonra, iğneyi cam şırıngaya bağlayın. Şırınd'ı şırındıcı pompaya sabitleyin ve şırınna pompasını, hava kabarcıklarının kanala girmesini önlemek için piston tarafı yükselecek şekilde eğin. Tüpün ucını akış odası girişine yerleştirin.Polietilen borunun 200 milimetrelik başka bir parçasının bir ucunu prize yerleştirin ve diğer ucunu atık bir kabın içine batırın. Hücreleri peletmek için hücre süspansiyon örneğinden bir ila iki mililitre alın ve santrifüj alın. Ortamı çıkarın ve hücreleri yuvarlanan tamponun 500 mikrolitresinde hafifçe yeniden biriktirin.Boruyu girişlerden ve hücre süspansiyonunun 40 mikrolitresini akış odasına çıkış ve pipetten dikkatlice çıkarın. Kabarcıkların akış kanalına sokulmamasını sağlamak için boruyu daha önce açıklandığı gibi yeniden bağlayın. Şırınd pompasını istediğiniz akış hızlarında başlatarak hücre haddeleme deneyine başlayın.10X hedefi olan karanlık alan mikroskobu kullanarak hücre yuvarlanma gözlemleyin. Deneme tamamlandıktan sonra, yüzey hücre serbest kalana kadar yuvarlanan arabelleği saatte 100 mililitrede aşılayarak hücreleri kanaldan çıkarın. Yerel parçaları DNA-PAINT ile görüntülemek için kanala DNA-PAINT tamponunda hazırlanmış 40 mikrolitre DNA-PAINT görüntüleyiç teli ekleyin.Metin el yazmasında belirtilen koşulları kullanarak toplam iç yansıma floresan mikroskopisi gerçekleştirin. Süper çözünürlüklü görüntüleri yerelleştirin ve işleyin. Uzun parçaları kalıcı etiketleme ile görüntülemek için kalıcı görüntüleyicİ telini ekleyin ve T50M5 tamponunda 120 saniye kuluçkaya yatırın.Daha sonra 200 mikrolitre yıkama tamponu aşılayarak kanalı yıkayın. Arka plan kamerası gürültüsü elde etmek için heyecan lazeri kapalıyken bir görüntü kaydedin. TIRF mikroskopisi ile ızgara deseninde geniş bir alanı görüntüleyin.Mikroskobu 400'e 50 görüntü alanını taramak ve raw verileri ImageJ programını kullanarak her biri en fazla 10.000 görüntü içeren tek tek TIP dosyalarına bölmek için programlayın. Aydınlatma profilini kullanarak tüm görüntüleri düzleştirin ve görüntüleri dikmek için MIST eklentisini kullanın. Protein G ssDNA biyokonjugasyon karakterizasyonu için sonuç, G Maleimide ssDNA ve imidazol elution tampon spektrumunun biyokonjugasyon ürün spektrumuna uyum sağlamak için ortogonal temelden geldiği protein G'nin ssDNA'ya bir oranına yakın olduğunu göstermiştir.Native PAGE, başarılı konjugasyon ve iyi verim gösteren monomerik protein G bandına denk gelen parlak yeşil bantları gösteren biyokonjugasyonu doğrulamak için kullanıldı. Tek modlu fiberden sunulan TIRF aydınlatma profili genellikle görüş alanının ortasında daha parlaktır ve kenarların etrafında karartıcıdır. Düzensiz aydınlatmayı telafi etmek ve nicel analiz için görüntüleri düzleştirmek için aydınlatma profili, ortalama binlerce ayrı çerçeve ile belirlendi.Düzleştirilmiş görüntüler, kamera gürültüsünün hem ham hem de aydınlatma profillerinden çıkarılması ve daha sonra aydınlatma profili ile normalleştirilmesiyle üretildi. Ham dikiş, düzeltilmemiş görüntülere karşılık gelen net periyodik desenler gösterirken, düzleştirilmiş görüntülerden dikilen aynı görüş alanı düz bir arka plan oluşturdu. Hücre yuvarlanması ve tipik bir tek hücreli yapışıklık ayak izinin görülebileceği floresan izleri ile sonuçlanan kesme stresi aralığını belirlemek için bir rampa yukarı akış profili kullanılmıştır.Yetersiz kontrast, aşırı iz yoğunluğu, optimum iz yoğunluğu ve kontrastı ile kırınım sınırlı ve DNA-PAINT görüntüleme ile floresan izlerin yetersiz ve optimum sonuçları gösterilmiştir. 60 dakikadan uzun kuluçka süresi, yüzey fonksiyonelleştirmesini sağlar ve uygun oda yapısı fonksiyonel yüzeye zarar veren kabarcıkların geçişini önler. Bu prosedür, yuvarlanan yapışmada rol oynayan moleküler kuvvetin nicel analizi için geçerlidir ve araştırmacıların farklı hücre tiplerinin yuvarlanma davranışını anlamalarını sağlar.Bu teknik, araştırmacıların tek molekül ve mekanobiyoloji araştırmalarının daha da ilerlemesine yol açan hızlı yapışma olaylarıyla ilgili yeni soruları keşfetmelerini sağlar.

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

S. cerevisiae yapışma ve Agar Invasion için Testi

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Organizatör ve Hayvan Kutbu eksplantlar Xenopus laevis Embriyolar ve Hücre Yapışma Testi Meclisi diseksiyonu

Title Cell Encapsulation by Droplets

Droplets tarafından Başlığı Hücre Kapsülleme

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Farelerde Aerobik Egzersiz ile Autophagy etkinleştirme

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...