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08:53 min
September 15th, 2021
DOI :
10.3791/63014-v
Chapters
0:04
Introduction
0:31
Cotransfection of HeLa Cells with the Reporter and U1 Small Nuclear RNA (snRNA) Plasmids
2:00
32P-Labeling of Oligonucleotides
2:52
Analysis of the Spliced Reporter Transcripts by Primer Extension
3:53
Analysis of the Spliced Reporter Transcripts by Fluorescent RT-PCR
5:08
Analysis of Variant U1 snRNA Expression by RT-qPCR
5:38
Setup and Running of Urea-PAGE Gels
6:27
Results: Reporter Based Splicing Efficiency of U1 snRNA Constructs
8:09
Conclusion
Transcript
このプロトコルは、適応可能な管理レポーターを使用して、スプライシング効率を監視するための細胞アッセイを記述します。このレポーターアッセイは、エクソンまたはスプライス部位における疾患関連変異の影響を研究し、5点スプライス部位への変異体の認識を改善するための治療、特に1つの粒子を設計するために使用することができる。Hela細胞での継代は、使用済み培地を吸引し、1ミリモルのEDTAを含む中で0.2 5%トリップの3ミリリットルで細胞を摂氏37度で3分間インキュベートする。
7ミリリッ
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Summary
このプロトコルは、スプライシングに対する5'-スプライス部位変異の影響をモニターするためのミニジーンレポーターアッセイを記述し、変異誘発スプライシング阻害のレスキューのためのサプレッサーU1 snRNAを開発する。レポーターおよびサプレッサーU1 snRNA構築物をHeLa細胞で発現させ、スプライシングをプライマー伸長またはRT-PCRによって分析する。
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