Name: a reporter based cellular assay for monitoring splicing efficiency
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00
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이 작품은 국립 보건원 (R21CA170786 및 R01GM127464)과 미국 암 학회 (기관 연구 보조금 74-001-34-IRG)와 밸리 연구 파트너십 프로그램 (P1-4009 및 VRP7)의 S.S. 및 W.M에 대한 자금으로 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

1. 시약 및 버퍼
참고: 진공 필터를 사용한 모든 멸균은 생물 안전 캐비닛에 0.2 μm polyethersulfone(PES) 멤브레인으로 수행해야 합니다.
<ol><li>1.0mL의 디틸피로카보네이트(DEPC)를 1.0L의 디에이온화된 물에 첨가하고, 실온(RT)에서 최소 1시간 이상 섞은 다음, 사용하기 전에 RT로 식힙니다.</li>
	<li>DMEM 분말 1패킷(13.4g), 중탄산나트륨 3.7g, 태아소 혈청(FBS), 페니실린 100mL, 멸균 데리온 화?...

<ol>
	<li>Zhuang, Y., Weiner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compensatory+base+change+in+U1+snRNA+suppresses+a+5'+splice+site+mutation.">A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation.</a> Cell. 46 (6), 827-835 (1986).</li><li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mis-splicing+in+disease.">RNA mis-splicing in disease.</a> Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).</li><li>Ward, A. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathobiology+of+splicing.">The pathobiology of splicing.</a> Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).</li><li>Scalet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-causing+variants+of+the+conserved++2T+of+5'+splice+sites+can+be+rescued+by+engineered+U1snRNAs.">Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs.</a> Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).</li><li>Yamazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+modified+U1+small+nuclear+RNA+for+rescue+from+exon+7+skipping+caused+by+5'-splice+site+mutation+of+human+cathepsin+A+gene.">Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene.</a> Gene. 677, 41-48 (2018).</li><li>Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+nuclear+RNA-mediated+modulation+of+splicing+reveals+a+therapeutic+strategy+for+a+TREM2+mutation+and+its+post-transcriptional+regulation.">Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation.</a> Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).</li><li>Balestra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+mutations+impairing+CDKL5+expression+and+activity+can+be+efficiently+rescued+by+U1snRNA-based+therapy.">Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).</li><li>Donadon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-specific+U1+snRNAs+improve+ELP1+exon+20+definition+and+rescue+ELP1+protein+expression+in+a+familial+dysautonomia+mouse+model.">Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).</li><li>Summer, H., Gramer, R., Droge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(Urea+PAGE).">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).</li><li>Dominski, Z., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+splice+sites+in+pre-mRNAs+with+short+internal+exons.">Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons.</a> Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).</li><li>Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+repression+by+polypyrimidine+tract+binding+protein.">Exon repression by polypyrimidine tract binding protein.</a> RNA. 11 (5), 699-716 (2005).</li><li>Le Guedard-Mereuze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+contexts+that+determine+the+pathogenicity+of+base+substitutions+at+position++3+of+donor+splice-sites.">Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites.</a> Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).</li><li>Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-loop+4+of+U1+snRNA+is+essential+for+splicing+and+interacts+with+the+U2+snRNP-specific+SF3A1+protein+during+spliceosome+assembly.">Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly.</a> Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).</li><li>Steitz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).</li><li>Fortes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+expression+of+specific+genes+in+mammalian+cells+with+5'+end-mutated+U1+small+nuclear+RNAs+targeted+to+terminal+exons+of+pre-mRNA.">Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).</li><li>Roca, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+recognition+of+5'+splice+sites+by+noncanonical+base-pairing+to+U1+snRNA+involving+bulged+nucleotides.">Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides.</a> Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).</li><li>Roca, X., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+atypical+5'+splice+sites+by+shifted+base-pairing+to+U1+snRNA.">Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA.</a> Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).</li><li>Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splice-switching+small+molecules:+A+new+therapeutic+approach+to+modulate+gene+expression.">Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression.</a> Methods. 167, 134-142 (2019).</li><li>Hamid, F. M., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+underlying+position-specific+regulation+of+alternative+splicing.">A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).</li><li>Martelly, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+roles+for+human+U1+snRNA+stem-loops+in+pre-mRNA+splicing.">Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-18 (2021).</li></ol>

분석은 HeLa 이외의 세포주에서 접합 분석을 위해 적응될 수 있지만, 세포 합류 및 DNA의 양과 같은 형질 응력에 영향을 미치는 요인은 최적화될 필요가 있다. 리포터에서 U1 구문비는 다른 세포 유형에서 관찰된 발현 수준에 따라 결정되어야 할 수 있는 또 다른 중요한 매개 변수이다. 추출된 RNA의 품질은 접합 분석에 중요합니다. 따라서 RNase 비활성화 제의 로 RNase 가없는 물 및 표면의 오염 제거를 ?...

pre-mRNA 접합은 비코딩 인트론을 제거하고 코딩 엑손을 정확하게 리게이트하여 성숙한 mRNA를 형성하는 필수적인 처리 단계입니다. 5′-스플라이스 사이트 및 3′-스플라이스 사이트라고 하는 엑손 인트론 교차로에서 컨센서스 시퀀스를 인식하는 것은 접합 기계의 구성 요소에 의해 접합 과정을 시작합니다. U1 소형 핵리보뉴클레오프로틴(snRNP)은 U1 snRNA를 사전 mRNA1에 기본 페어링하여 5′-스플라이스 부위를 인식합니다. 5′-스플라이스 사이트 서열을 변경하는 유전적으로 승계한 돌연변이는 많은 질병2,3와 연관됩니다. U1 snRNA의 염기 페어링을 돌연변이 5′-스플라이스 사이트로 손상하면 비정상적인 접합이 발생하여 영향을 받는 성적증명서의 번역을 손상시킬 수 있습니다. 접합 결함을 해결하기 위한 잠재적인 치료 접근법은 5′-splice 사이트와 기초가 되는 5′-지구에 있는 보상 뉴클레오티드 변경을 운반하는 수정된 U1 snRNA에 의하여 돌연변이의 억제를 관련시킵니다. 이러한 수정된 U1 snRNAs는 exon 특정 U1 snRNAs라고도 하며, 접합 결함을 반전시키는 데 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 그 결과 구조된 mRNA4,5,6,7,8에서 단백질 발현이 증가되는 것으로 나타났다.
여기에서, 우리는 U1 snRNP 보완 분석, 엑슨의 접합에 5′ss 돌연변이의 효과의 평가를 허용하고 또한 엑슨 포함의 구조를 가능하게 하는 수정된 U1 snRNAs의 발달에 사용될 수 있는 기자 기지를 둔 세포 접면 분석서를 기술합니다. 또한 프라이머 확장 및 RT-PCR에 의해 접합된 리포터 성적증명서를 모니터링하고, 프라이머 확장 및 RT-qPCR에 의해 수정된 U1 snRNAs의 발현을 결정하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent Grade Deionized Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-751628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2567-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Bottle Top Filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB12566510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x), no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection medium - Opti-MEM&#8482; I Reduced Serum Medium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent - Lipofectamine&#8482; 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#8482; Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2618-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEG035C001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion beands - Sephadex&#174; G-25</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2580-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion mini columns</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3032S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>76410 100 UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inactivating reagents - RNaseZAP&#8482;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM ea)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28025013</td>
			<td>used for primer extension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10342020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamers (50 &#181;M)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8080127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time PCR mix - SYBR&#8482; Select Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4472903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td>used for cDNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X First-Strand Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (&#8805;99.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td>Review Material Safety Data Sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114405-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene Cyanol FF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP168-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1406-1</td>
			<td>Review Material Safety Data Sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP169-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxodisulphate (APS) &#8805;98%, Pro-Pure, Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M133-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED) &#8805;99%, Ultrapure</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td>Review Material Safety Data Sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ASG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel Wrap&#8482; Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NGP-125NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel Wrap&#8482; Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NGP-200NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel Wrap&#8482; Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NGP-400NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon&#8482; FLA 7000 Biomolecular Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9610-73 AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reporter based cellular assay for monitoring splicing efficiency

유전자 발현 동안, pre-mRNA 접합의 중요한 단계는 성숙한 mRNA의 세포질 수출 의 앞에 엑손에 합류하고 인트론을 제거하기 위하여 스플라이스 사이트의 정확한 인식 및 pliceosomal 복합체의 능률적인 조립을 관련시킵니다. 접합 효율은 스플라이스 부위의 돌연변이 존재, 트랜스 작용 접합 인자의 영향 또는 치료제의 활동에 의해 변경될 수 있다. 여기에서는 주어진 exon의 접합 효율을 모니터링하기 위해 적용할 수 있는 셀룰러 분석프로토콜을 설명합니다. 분석법은 적응형 플라스미드 인코딩된 3-엑손/2-intron 미니진 리포터를 사용하며, 이는 일시적인 과도 경질에 의해 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 전염 후, 총 세포 RNA는 단리되고, 기자 mRNA에서 결합하는 엑슨의 효율은 프라이머 확장 또는 반정량 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 결정된다. 우리는 어떻게 관련된 질병의 충격을 설명합니다 5′ 스플라이스 사이트 돌연변이는 기자에 그(것)들을 소개하여 결정될 수 있습니다; 그리고 이러한 돌연변이의 억제는 U1 작은 핵 RNA (snRNA)와 의 결합에 의해 달성 될 수있는 방법 5′ 지역에서 보상 돌연변이를 운반 하는 구성 은 사전 mRNAs에 있는 엑손 인 트론 접합부에서 5′splice 사이트와 기질. 따라서, 리포터는 돌연변이 5′ 스플라이스 사이트의 인식을 향상시키기 위해 치료 U1 입자의 설계에 사용될 수 있다. 인핸서 또는 소음기 시퀀스를 접합하는 것과 같은 시스 작용 규제 사이트를 리포터에 삽입하여 특정 대체 접합 계자에 의해 중재된 규제에서 U1 snRNP의 역할을 검사하는 데도 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 세포를 발현하는 기자는 소분자로 배양하여 구성적인 사전 mRNA 접합 또는 돌연변이 5′ 스플라이스 부위를 운반하는 엑슨에 잠재적 인 치료법의 효과를 결정할 수 있습니다. 전반적으로, 리포터 분석은 기본적인 접합 기계장치 및 접합 관련 질병을 연구하기 위하여 다양한 조건에서 접합 효율을 감시하기 위하여 적용될 수 있습니다.

접합 기자 Dup51, 3 개의 엑손-2 인트론 미니진은 인간 β-글로빈 유전자로부터 유래되었으며 이전에 설명되었다(그림 1A)11,12. 우리는 돌연변이 기자, Dup51p, 프로토 카데린 의 엑슨 3에서 발생하는 Usher 증후군 과 관련된 5'splice 사이트 돌연변이를 도입하여 15 (PCDH15) gene13. 엑손 2-인트론 2 접합부에서의 5'splice 사...

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A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

이 프로토콜은 5'splice 사이트 돌연변이가 접합에 미치는 영향을 모니터링하기 위한 미니유전자 기자 분석체를 설명하고 돌연변이 유발 접합 억제를 위한 억제기 U1 snRNA를 개발한다. 리포터 및 억제기 U1 snRNA 구조는 HeLa 세포에서 발현되고, 접합은 프라이머 확장 또는 RT-PCR에 의해 분석된다.

접합 효율 모니터링을 위한 기자 기반 셀룰러 분석

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

이 프로토콜은 적응형 관리 리포터를 사용하여 접합 효율을 모니터링하기 위한 셀룰러 분석서를 설명합니다. 이 기자 분석은 엑손 또는 스플라이스 부위에 있는 질병 관련 돌연변이의 효력을 연구하고, 5점 스플라이스 사이트로 돌연변이의 인식을 향상시키기 위하여, 특정 한 입자를 디자인하기 위하여 이용될 수 있다. Hela 세포의 통로는 소비된 매체를 흡인하고 3분 동안 섭씨 37도에서 1밀리미터 EDTA를 포함하는 0.2 5%의 3밀리리터로 세포를 배양합니다.신선한 DMEM의 7 밀리리터에서 배양 후 10 밀리리터 튜브로 세포 현탁액을 전송합니다. 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 신선한 DMEM의 10 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 과도 성 과도 성 전환에 대한 20 %의 합류로 새로운 조직 배양 접시에 세포를 플레이트.깨끗한 헤모 세포계 슬라이드로 헬라 세포를 계산하고 밀리리터 당 5 세포에 2.5 배 10의 밀도로 현탁액을 준비하고, 셀 서스펜션의 1 밀리리터를 12 웰 플레이트의 각 우물로 시드하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 소비 된 매체를 흡인하고 접시에 세럼으로 신선한 DMEM 800 마이크로 리터를 추가합니다. 15초 동안 배분 믹스를 준비하고 소용돌이를 준비합니다.그런 다음 원심 분리를 혼합하고 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 배양 후 200 마이크로리터를 모두 12웰 헬라 세포 플레이트중 하나의 우물에 추가하여 1밀리리터당 1밀리리터의 최종 부피를 달성하고 48시간 동안 37°C에서 플레이트를 배양한다. 준비된 라벨링 반응이 인큐베이팅되고 있습니다.25킬로 달튼 분자량 컷오프 크기 제외 구슬을 10초 동안 부드럽게 소용돌이에 의해 재중단합니다. 다음으로 재매달된 구슬 600마이크로리터를 일회용 미니 컬럼으로 옮기고 1.5밀리리터 수집 튜브에 넣고 구슬 재고를 섭씨 4도로 되돌려 놓습니다. 열을 원심 분리하고 열을 통해 흐름을 삭제합니다.그런 다음 기둥에 RNA 프리 워터 300 마이크로리터를 추가하여 구슬을 두 번 씻는다. 두 번째 세척 후 미니 컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 컬럼에 키나아제 반응 믹스를 추가합니다. 원심분리기 컬럼을 원심분리하고 P32 표지된 올리고뉴클레오티드를 함유하여 흐름을 수집한다.헬리 세포에서 추출한 RNA 2마이크로그램을 200마이크로리터 마이크로 원심분리기 튜브에 추가하고 RNA 프리 워터를 추가하여 6.55 마이크로리터에 볼륨을 구성합니다. 다음으로 RNA 샘플을 포함하는 각 PCR 튜브에 마스터 믹스 1개를 추가하고, 튜브를 섭씨 65도에서 5분 동안 먼저 배양한 다음 얼음에 1분 동안 배양합니다. 다음으로 2.55 마이크로리터, 마스터 믹스 2, RNA및 마스터 믹스 를 포함하는 각 튜브에 10 분 동안 실온에서 튜브를 배양한다.인큐베이션 후 튜브를 열 사이클러로 옮기고 먼저 섭씨 50도에서 60분 동안 배양한 다음 섭씨 70도에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 각 샘플에 2X 폼아미드 RNA 로딩 염료의 10 마이크로리터를 추가하고 UIA 페이지별로 조각을 분리한다. 퍼시 DNA 합성.200 마이크로리터 미크론심심분리기 튜브에 대용량 헬라 세포에서 추출한 RNA 2마이크로그램을 추가하고, RNA가 없는 물을 추가하여 11마이크로리터에 부피를 만회합니다. 다음으로, 두 개의 마이크로리터를 추가하고, 마스터 믹스를 각 샘플에 하나씩 넣고 5분 동안 섭씨 65도에서 먼저 배양한 다음 1분 동안 얼음위에 누배합니다. 다음으로, 각 튜브에 마스터 믹스 2인 7개의 마이크로리터를 추가하고 실온에서 10분 동안 튜브를 배양한 다음, 60분 동안 50도, 섭씨 70도에서 15분 동안 인큐베이션을 합니다.다음으로, PCR의 경우 C DNA 반응을 희석하여 마이크로리터당 100나노그램의 농도를 산출하고 각 CDNA 샘플의 마이크로리터 1개를 새로운 PCR 튜브로 전송한다. CDNA를 포함하는 각 튜브에 마스터 믹스의 10.5 마이크로리터를 추가하고 PCR을 수행합니다. PCR이 완료된 후 열순환기 사용.각 튜브에 2X 폼아미드 DNA 로딩 염료의 12.5 마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 가열하고 UIA 페이지를 진행합니다. 96웰 qpcr 플레이트 트리플리케이트의 개별 우물에 희석 된 CDNA의 파이펫 5 마이크로 리터.다음으로 각 웰에 실시간 PCR 믹스 10 마이크로리터를 추가하고, 광학 필름으로 플레이트를 밀봉하고, 원심분리기를 사용하여 우물 바닥에 대한 반응을 수집한 다음, 대상 앰플리콘의 임계 정량화 주기 값을 수집하는 동안 qpcr를 수행합니다. 마커와 샘플을 로드하기 전에 TBE 버퍼로 우물을 플러시하여 정착된 우레아를 제거합니다. 그런 다음 각 샘플당 10 마이크로리터를 적재하고 2~3시간 동안 300~500볼트로 젤을 실행하거나 자일렌이 바닥에 닿을 때까지 실행합니다.전기전도후 전기포고가소장치에서 유리판을 제거하고 두 판을 조심스럽게 분리하여 젤이 유리 표면에 평평하게 놓이도록 한 다음, 젤을 필터 용지에 옮기고 플라스틱 랩으로 덮어 젤 건조기 진공을 사용하여 30분 동안 젤을 건조시하고, 그런 다음 건조 된 젤을 실내 온도에서 하룻밤 잠식용 인광 화상 진찰 카세트에 놓습니다. 헬라 세포에서 발현되면, 슬라이스 리포터 dup 51 minnijean은 엑손 2가 효율적으로 접합되는 성숙한 전체 길이 의 성적 증명서를 표현한다. 5개의 주요 스플라이스 사이트 돌연변이 및 dup 51 P는 엑손2개의 포함을 95에서 30%로 감소시켜 더 짧은 성적증명서의 형성으로 이끌어 냅니다.U15A SNRNA를 가진 dup 51 P의 공동 발현은 엑손2개의 접합을 구출하고, 전체 길이 성적증명서의 형성을 복원합니다. 대조적으로, 야생 형 U1 또는 U15G 변종과의 공동 발현은 dup 51P 접합에 유사한 영향을 미치지 않습니다. U15A 변이체 전사체의 검출은, 1차 연장에 의하여 U1 7~26개의 올리고 뉴클레오티드를 사용하며, 이는 U1 SNRNA의 다섯 번째 위치에서 아데닌 근처의 20개의 뉴클레오티드 및 기저쌍이다.DATP단독으로, U1 7 내지 26은 내인성 야생형 U1 SNRNA에 대해 2내지 3개의 뉴클레오티드를 통합하여 22 또는 23뉴클레오티드 롱 생성물을 산출할 수 있다. U15A 및 U15G 변이체의 경우 21개의 뉴클레오티드 생성물을 생산하는 단일 아데노신을 첨가한 후 확장이 종료된다. U2 SNRNA 발현으로 의정상화 한 후, 내생SNRNA를 통해 3~5배의 내생SNRNA를 통해 U1 야생형 U1 5g 및 U15A 변이체를 3~5배로 발현했다.추출된 RNA의 품질은 접합 분석에 매우 중요합니다. 따라서 RNA 가없는 물의 사용 및 RNA 비활성화 제로 서비스의 오염 제거가 매우 권장됩니다. 여기에 설명된 보고 시스템은 수정 U1SN RNA를 사용하여 유전자 침묵에 대한 돌연변이를 접합하기 위한 규정을 접합하기 위한 규정을 접합하는 U1 SN RNA의 역할을 연구하기 위하여 적용될 수 있다.

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Transcription: DNA to RNA

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