Name: a reporter based cellular assay for monitoring splicing efficiency
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21CA170786 ve R01GM127464) ve Amerikan Kanser Derneği'nden (Kurumsal Araştırma Hibesi 74-001-34-IRG) ve Vadi Araştırma Ortaklığı Programı'ndan (P1-4009 ve VRP77) S.S. ve W.M.'ye fonlarla desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

1. Reaktifler ve tamponlar
NOT: Vakum filtreleri kullanılarak yapılan tüm sterilizasyonlar biyogüvenlik kabininde 0,2 μm polietrülfon (PES) membran ile yapılmalıdır.
<ol><li>1,0 L deiyonize suya 1,0 mL dietilpirokarbonat (DEPC) ekleyerek RNase içermeyen su hazırlayın, oda sıcaklığında (RT) en az 1 saat karıştırın, iki kez otoklavlayın ve kullanmadan önce RT'ye soğutun.</li>
	<li>Bir paket DMEM tozu (13,4 g), 3,7 g sodyum bikarbonat, 100 mL fetal sığır serumu (FBS), ...

<ol>
	<li>Zhuang, Y., Weiner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compensatory+base+change+in+U1+snRNA+suppresses+a+5'+splice+site+mutation.">A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation.</a> Cell. 46 (6), 827-835 (1986).</li><li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mis-splicing+in+disease.">RNA mis-splicing in disease.</a> Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).</li><li>Ward, A. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathobiology+of+splicing.">The pathobiology of splicing.</a> Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).</li><li>Scalet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-causing+variants+of+the+conserved++2T+of+5'+splice+sites+can+be+rescued+by+engineered+U1snRNAs.">Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs.</a> Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).</li><li>Yamazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+modified+U1+small+nuclear+RNA+for+rescue+from+exon+7+skipping+caused+by+5'-splice+site+mutation+of+human+cathepsin+A+gene.">Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene.</a> Gene. 677, 41-48 (2018).</li><li>Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+nuclear+RNA-mediated+modulation+of+splicing+reveals+a+therapeutic+strategy+for+a+TREM2+mutation+and+its+post-transcriptional+regulation.">Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation.</a> Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).</li><li>Balestra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+mutations+impairing+CDKL5+expression+and+activity+can+be+efficiently+rescued+by+U1snRNA-based+therapy.">Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).</li><li>Donadon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon-specific+U1+snRNAs+improve+ELP1+exon+20+definition+and+rescue+ELP1+protein+expression+in+a+familial+dysautonomia+mouse+model.">Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).</li><li>Summer, H., Gramer, R., Droge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(Urea+PAGE).">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).</li><li>Dominski, Z., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+splice+sites+in+pre-mRNAs+with+short+internal+exons.">Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons.</a> Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).</li><li>Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+repression+by+polypyrimidine+tract+binding+protein.">Exon repression by polypyrimidine tract binding protein.</a> RNA. 11 (5), 699-716 (2005).</li><li>Le Guedard-Mereuze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+contexts+that+determine+the+pathogenicity+of+base+substitutions+at+position++3+of+donor+splice-sites.">Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites.</a> Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).</li><li>Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-loop+4+of+U1+snRNA+is+essential+for+splicing+and+interacts+with+the+U2+snRNP-specific+SF3A1+protein+during+spliceosome+assembly.">Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly.</a> Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).</li><li>Steitz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).</li><li>Fortes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+expression+of+specific+genes+in+mammalian+cells+with+5'+end-mutated+U1+small+nuclear+RNAs+targeted+to+terminal+exons+of+pre-mRNA.">Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).</li><li>Roca, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+recognition+of+5'+splice+sites+by+noncanonical+base-pairing+to+U1+snRNA+involving+bulged+nucleotides.">Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides.</a> Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).</li><li>Roca, X., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+atypical+5'+splice+sites+by+shifted+base-pairing+to+U1+snRNA.">Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA.</a> Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).</li><li>Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splice-switching+small+molecules:+A+new+therapeutic+approach+to+modulate+gene+expression.">Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression.</a> Methods. 167, 134-142 (2019).</li><li>Hamid, F. M., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+underlying+position-specific+regulation+of+alternative+splicing.">A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).</li><li>Martelly, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+roles+for+human+U1+snRNA+stem-loops+in+pre-mRNA+splicing.">Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-18 (2021).</li></ol>

Test, HeLa dışındaki hücre hatlarında birleştirme analizi için uyarlanabilir, ancak hücre konflüensi ve DNA miktarı gibi transeksiyon verimliliğini etkileyen faktörlerin optimize edilmesi gerekebilir. Muhabirden U1 yapı oranına, diğer hücre türlerinde gözlenen ifade düzeylerine bağlı olarak belirlenmesi gerekebilecek başka bir kritik parametredir. Çıkarılan RNA'nın kalitesi birleştirme analizi için kritik öneme sahiptir; bu nedenle, RNaz içermeyen su kullanımı ve RNase inaktivasyon ajanlar...

Pre-mRNA birleştirme, kodlamayan intronları kaldıran ve olgun mRNA oluşturmak için kodlama eksonlarını hassas bir şekilde lige eden önemli bir işlem adımıdır. Ekson-intron kavşaklarında konsensüs dizilerinin tanınması, 5′-splice bölgesi ve 3′-splice bölgesi olarak adlandırılır, birleştirme makinelerinin bileşenleri tarafından birleştirme işlemini başlatır. U1 küçük nükleer ribonükleoprotein (snRNP), U1 snRNA'nın mRNA1 öncesi ile baz eşleşmesi ile 5′-splice bölgesini tanır. 5′-splice bölge dizilerini değiştiren genetik kalıtsal mutasyonlar birçok hastalıkla ilişkilidir2,3. U1 snRNA'nın mutant 5′-splice siteleri ile temellenme kaybının, etkilenen transkriptin çevirisini tehlikeye atabilecek sapkın birleştirmeye neden olduğu öngörülebilir. Birleştirme kusurlarını düzeltmek için potansiyel bir terapötik yaklaşım, 5′-splice bölgesi ile temel alan 5′-bölgesinde telafi edici nükleotid değişiklikleri taşıyan modifiye U1 snRNA tarafından mutasyonların bastırılmasını içerir. Ekson spesifik U1 snRNA'ları olarak da adlandırılan bu tür modifiye U1 snRNA'larının, ekstifleme kusurlarının tersine çevrilmesinde etkili olduğu ve kurtarılan mRNA4,5,6,7,8'den protein ekspresyonunda artışa neden olduğu bulunmuştur.
Burada, U1 snRNP tamamlama testini, 5′-ss mutasyonunun bir ekzonun bir eklenmesi üzerindeki etkisinin değerlendirilmesine izin veren ve ayrıca akson dahil etmenin kurtarılmasını sağlamak için değiştirilmiş U1 snRNA'larının geliştirilmesi için de kullanılabilen muhabir tabanlı bir hücresel birleştirme tahlili olarak tanımlıyoruz. Ayrıca, bir aradaki muhabir transkriptlerinin primer uzantısı ve RT-PCR ile izlenmesi ve değiştirilmiş U1 snRNA'ların primer uzantısı ve RT-qPCR ile ifadesinin belirlenmesi için protokoller sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent Grade Deionized Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23-751628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2567-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Bottle Top Filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB12566510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x), no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection medium - Opti-MEM&#8482; I Reduced Serum Medium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent - Lipofectamine&#8482; 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#8482; Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2618-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEG035C001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion beands - Sephadex&#174; G-25</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2580-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion mini columns</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-0600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBR322 DNA-MspI Digest</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3032S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>76410 100 UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inactivating reagents - RNaseZAP&#8482;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (10 mM ea)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#8482; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28025013</td>
			<td>used for primer extension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10342020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamers (50 &#181;M)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8080127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time PCR mix - SYBR&#8482; Select Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4472903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript&#8482; III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td>used for cDNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X First-Strand Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (&#8805;99.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP228-100</td>
			<td>Review Material Safety Data Sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114405-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene Cyanol FF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP168-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1406-1</td>
			<td>Review Material Safety Data Sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP169-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxodisulphate (APS) &#8805;98%, Pro-Pure, Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M133-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED) &#8805;99%, Ultrapure</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0761-25ML</td>
			<td>Review Material Safety Data Sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ASG-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel Wrap&#8482; Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NGP-125NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel Wrap&#8482; Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NGP-200NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel Wrap&#8482; Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NGP-400NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE28-9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon&#8482; FLA 7000 Biomolecular Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9610-73 AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8043-30-1194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reporter based cellular assay for monitoring splicing efficiency

Gen ekspresyonu sırasında, mRNA öncesi birleştirmenin hayati adımı, olgun mRNA'nın sitoplazmik ihracatından önce eksonları birleştirmek ve intronları çıkarmak için spliceosomal komplekslerin doğru tanınmasını ve spliceosomal komplekslerin verimli bir şekilde birleştirilmesini içerir. Birleştirme verimliliği, splice bölgelerinde mutasyonların varlığı, trans-etkili birleştirme faktörlerinin etkisi veya terapötiklerin aktivitesi ile değiştirilebilir. Burada, herhangi bir eksonun birleştirme verimliliğini izlemek için uygulanabilecek hücresel bir test protokolünü açıklıyoruz. Tahlil, memeli hücrelerinde geçici transfeksiyon ile ifade edilebilen uyarlanabilir bir plazmid kodlu 3-exon/2-intron minigene reporter kullanır. Transfeksiyon sonrası, toplam hücresel RNA izole edilir ve muhabir mRNA'daki ekson birleştirmenin verimliliği primer uzatma veya yarı nicel ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile belirlenir. 5′ splice-site mutasyonları ile ilişkili hastalığın etkisinin muhabirde tanıtılarak nasıl belirlenebileceğini anlatıyoruz; ve bu mutasyonların bastırılmasının U1 küçük nükleer RNA (snRNA) yapısı ile birlikte transfeksiyon ile nasıl sağlanabileceği, mRNA öncesi bölgelerdeki exon-intron kavşaklarında 5′-splice bölgeleri ile temel alan 5′ bölgesinde telafi edici mutasyonlar taşıyan yapı. Böylece, muhabir mutant 5′ splice-sites tanıma geliştirmek için terapötik U1 parçacıklarının tasarımı için kullanılabilir. Artırıcı veya susturucu dizilerini birleştirme gibi CIS etkili düzenleyici sitelerin muhabire eklenmesi, U1 snRNP'nin belirli bir alternatif birleştirme faktörünün aracılık ettiği düzenlemedeki rolünü incelemek için de kullanılabilir. Son olarak, hücreleri ifade eden muhabir, potansiyel terapötiklerin konsitutive pre-mRNA birleştirme veya mutant taşıyan eksonlar üzerindeki etkisini belirlemek için küçük moleküllerle inkübe edilebilir 5′ splice siteleri. Genel olarak, muhabir tahlilleri, temel birleştirme mekanizmalarını ve birleştirme ile ilişkili hastalıkları incelemek için çeşitli koşullarda birleştirme verimliliğini izlemek için uygulanabilir.

Üç ekson-iki intron minigene olan birleştirme muhabiri Dup51, insan β-globin geninden türetilmiştir ve daha önce tanımlanmıştır (Şekil 1A)11,12 . Protocadherin 15 (PCDH15) geni13'ün ekson 3'lüğünde meydana gelen Usher sendromu ilişkili 5'-splice bölgesi mutasyonlarını tanıtarak dup51p adlı bir mutant muhabir oluşturduk. Ekson 2-intron 2 kavşağında 5'-splice site dizisi CAG/GU...

Watch this Scientific Journal Video about A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency at JoVE.com

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

Bu protokol, 5'-splice bölgesi mutasyonlarının birleştirme üzerindeki etkisini izlemek için bir minigene muhabiri testini açıklar ve mutasyona bağlı birleştirme inhibisyonunun kurtarılması için bastırıcı U1 snRNA geliştirir. Muhabir ve bastırıcı U1 snRNA yapıları HeLa hücrelerinde ifade edilir ve birleştirme astar uzantısı veya RT-PCR ile analiz edilir.

Birleştirme Verimliliğini İzlemek için Muhabir Tabanlı Hücresel Test

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Bu protokol, uyarlanabilir bir yönetici muhabir kullanarak Birleştirme Verimliliğini İzlemek için hücresel bir Test'i açıklar. Bu muhabir Tahlil, Exxon veya splice bölgelerinde ilişkili mutasyonların etkilerini incelemek ve mutantların beş noktalı splice bölgelerine tanınmasını iyileştirmek için özellikle bir parçacık olmak üzere tedavi tasarlamak için kullanılabilir. Hela hücrelerindeki geçit harcanan ortamı aspire eder ve hücreleri üç dakika boyunca 37 santigrat derecede bir milimolar EDTA içeren üç mililitre % 0.2 5 yolculukla kuluçkaya yatırır.Yedi mililitre taze DMEM'de inkübasyondan sonra hücre süspansiyonunu 10 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri santrifüjle. Daha sonra hücre peletini 10 mililitre taze DMEM'de yeniden biriktirin ve geçici transsfeksiyon için hücreleri% 20 izdihamda yeni bir doku kültürü çanatı üzerine plakalayın.Hela hücrelerini temiz bir hemo sitometre kaydırağı ile sayın ve mililitre başına beşinci hücrelere 2,5 çarpı 10 yoğunlukta bir süspansiyon hazırlayın, hücre süspansiyonunun bir mililitresini 12 kuyu plakasının her kuyusuna tohumlayın ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkalayın. Ertesi gün harcanan ortamı aspire edin ve plakaya serumlu 800 mikrolitre taze DMEM ekleyin. Transfeksiyon karışımlarını hazırlayın ve 15 saniye boyunca Vortex edin.Daha sonra karışımları santrifüjleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçkadan sonra, transfeksiyon karışımının 200 mikrolitresini, kuyu başına bir mililitrelik son bir hacim elde etmek için 12 kuyu hela hücre plakasının bir kuyusuna ekleyin ve plakayı 48 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hazırlanan etiketleme reaksiyonları kuluçkaya yatırılıyor.25 kilo Dalton moleküler ağırlık kesme boyutu dışlama boncuklarını 10 saniye boyunca nazik girdapla yeniden depolayın. Daha sonra, yeniden sulandırılmış boncukların 600 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirilen tek kullanımlık bir mini sütuna aktarın ve boncuk stoğunu dört santigrat dereceye geri döndürün. Sütunu santrifüjle ve içlerinden akışı atın.Daha sonra sütuna 300 mikrolitre RNA içermeyen su ekleyerek boncukları iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, mini sütunu yeni bir 1,5 mililitre santrifüj tüpüne aktarın ve kinaz reaksiyon karışımını sütuna ekleyin. Sütunu santrifüjlayın ve P32 etiketli oligonükleotidleri içeren akışı toplayın.Heli hücrelerinden çıkarılan iki mikrogram RNA'yı 200 mikrolitre mikro santrifüj tüpüne ekleyin ve hacmi 6,55 mikrolitreye çıkarmak için RNA içermeyen su ekleyin. Daha sonra RNA örneklerini içeren her PCR tüpüne 0,9 mikrolitre bir ana karışım ekleyin ve tüpleri önce 65 santigrat derecede beş dakika, sonra bir dakika buzda kuluçkaya yatırın. Daha sonra 2.55 mikrolitrede, RNA ve master mix bir içeren her tüpe iki ana karışım yapın ve tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra tüpleri bir termal çevrime aktarın ve önce 50 santigrat derecede 60 dakika, daha sonra 70 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. İnkübasyondan sonra, her numuneye 10 mikrolitre 2X formamid RNA yükleme boyası ekleyin ve parçaları UIA sayfasına ayırmaya devam edin. Percy DNA sentezi.Transkine edilmiş hela hücrelerinden çıkarılan iki mikrogram RNA'yı 200 mikrolitre mikroncentrifuge tüpüne ekleyin ve hacmi düşük 11 mikrolitreye uydurmak için RNA'lar içermeyen su ekleyin. Daha sonra, iki mikrolitre ekleyin, her numuneye bir ana karışım ekleyin ve önce 65 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın, sonra bir dakika buzda. Daha sonra, yedi mikrolitre ekleyin, her tüpe iki ana karışım yapın ve tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya bırakın, ardından 50 santigrat derecede 60 dakika ve 70 santigrat derecede 15 dakika kuluçka yapın.Daha sonra, PCR için C DNA reaksiyonu mikroliter başına 100 nanogram konsantrasyon elde etmek için seyreltin ve her CDNA örneğinin bir mikroliterini yeni PCR tüplerine aktarın. CDNA içeren her tüpe 10,5 mikrolitre ana karışım ekleyin ve PCR'yi gerçekleştirin. PCR tamamlandıktan sonra termosikleyici kullanma.Her tüpe 12,5 mikrolitre 2X formamid DNA yükleme boyası ekleyin. Numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın ve bir UIA sayfası gerçekleştirmeye devam edin. Pipet 96-well qpcr plaka triplikat bireysel Wells içine seyreltilmiş CDNA beş mikrolitre.Daha sonra her kuyuya 10 mikrolitre gerçek zamanlı PCR karışımı ekleyin, plakaları bir optik filmle kapatın ve Kuyuların dibine tepkileri toplamak için santrifüjleyin, ardından hedef amplicon'un eşik nicelik döngüsü değerlerini toplarken qpcr'ı gerçekleştirin. İşaretleyicileri ve numuneleri yüklemeden önce, yerleşik üreyi çıkarmak için Wells'i TBE tamponu ile boşaltın. Daha sonra her numuneden kuyu başına 10 mikrolitre yükleyin ve jeli iki ila üç saat boyunca veya ksilen dibe ulaşana kadar 300 ila 500 voltta çalıştırın.Elektroforezikten sonra cam plakaları elektroforez aparatından çıkarın ve jelin her iki cam yüzeye düz bir şekilde uzanması için iki plakayı dikkatlice ayırın, ardından jeli bir filtre kağıdına aktarın ve bir jel kurutucu vakum kullanarak plastik bir sargı ile örtün, jeli 80 santigrat derecede 30 dakika kurutun, daha sonra kurutulmuş jeli oda sıcaklığında gece boyunca inkübasyon için bir fosfor görüntüleme kasetine yerleştirin. Hela hücrelerinde ifade edildiğinde, dilimleme muhabiri dup 51 minnijean, Exxon iki'nin verimli bir şekilde bir eklendiğini olgun tam uzunlukta transkriptini ifade eder. Beş prime splice bölgesi mutasyonu ve dup 51 P, Exxon iki dahil etmeyi% 95'ten% 30'a düşürür ve daha kısa bir transkript oluşumuna yol sağlar.Dup 51 P'nin U15A SNRNA ile birlikte ifade edilerek Exxon iki birleştirme kurtarılır ve tam uzunlukta transkriptin oluşumunu geri yükler. Buna karşılık, U1 veya U15G varyantı türüne sahip ortak ifade dup 51P birleştirme üzerinde benzer bir etkiye sahip değildir. U15A varyant transkriptlerinin tespiti, birincil uzantıya göre U1 yedi ila 26 oligo nükleotid kullanır, bu da U1 SNRNA'nın beşinci pozisyonunda adenin yakınında 20 nükleotid uzunluğunda ve baz çifttir.Sadece DATP varlığında, U1 yedi ila 26, 22 veya 23 nükleotid uzunluğunda bir ürün veren endojen vahşi tip U1 SNRNA için iki ila üç nükleotid içermesine izin verir. U15A ve U15G varyantları için uzantı, 21 nükleotid ürünü üreten tek bir adenozin ekledikten sonra sona erer. U2 SNRNA ekspresyona normale döndükten sonra, transfected U1 vahşi tip U1 5g ve U15A varyantları endojen SNRNA üzerinde üç ila beş kat olarak ifade edildi.Çıkarılan RNA'nın kalitesi birleştirme analizi için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, RNA içermeyen suyun kullanılması ve RNA'larla hizmetlerin dekontaminasyonu ajanları devre dışı bırakma şiddetle tavsiye edilir. Burada açıklanan rapor sistemi, U1SN RNA'larını modifiye ederek gen susturma için flaş fiyat birleştirme mutasyonlarının etkisini tersine çevirmek için U1 SN RNA'larının birleştirme yönetmeliklerindeki rolünü incelemek için uygulanabilir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Biyokimya

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Elektrokimyasal algılama döteryum Kinetik izotop etkisi üzerinde ekstraselüler elektron taşıma Shewanella Corynebacterium Bay-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyon ile Hücresel Proteinlerin Karakterizasyonu

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Boncuklar Üzerinde Galectin-3 - U1 snRNP Kompleksi ile Birleştirme Etkinliğinin Tamamlayıcısı

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Minimum numune ancak maksimum otomasyon modunda NMR tabanlı parça taraması

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...