Name: digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Oezkan Keles, Josephine Jüttner e il Prof. Botond Roska, Istituto di Oftalmologia Molecolare e Clinica di Basilea, Complex Viruses Platform per il loro aiuto e supporto per la produzione di AAV. Vorremmo anche ringraziare il Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, l'Università della Pennsylvania per il ceppo AAV8 / BP2. Il lavoro sugli animali viene eseguito presso la struttura per animali della Gebze Technical University. Per questo, ringraziamo Leyla Dikmetas e il Prof. Uygar Halis Tazebay per l'assistenza tecnica e il supporto alla zootecnia. Vorremmo anche ringraziare la dottoressa Fatma Ozdemir per i suoi commenti sul manoscritto. Questo lavoro è supportato da TUBITAK, grant numbers 118C226 e 121N275, e Sabanci University Integration grant.

Tutti i protocolli sperimentali sono stati accettati dal comitato etico dell'Università Sabanci e gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la dichiarazione di "The Association for Research in Vision and Ophthalmology" per l'uso di animali nella ricerca
1. Produzione AAV su piccola scala12
<ol><li>Colture di cellule HEK293T utilizzando piastre da 15 cm in 10 ml completi di DMEM/10% FBS fino al 70-80% di confluenza.</li>
	<li>Preparare la...

<ol>
	<li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions:+The+fast+and+the+curious.">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li><li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry.">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids.">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li><li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+structure+and+cell+interactions.">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li><li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+(intravitreal,+subretinal,+or+suprachoroidal)+in+rats.">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li><li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle.">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li><li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter.">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li><li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors.">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells.">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR.">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice,+non-human+primates+and+humans.">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li><li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing.">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li><li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia.">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+tools+for+biological+image+analysis.">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li><li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression.">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration.">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li><li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates.">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss.">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li><li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+with+CRISPR-Cas13.">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li></ol>

In questo protocollo, abbiamo generato due vettori AAV che hanno diverse proteine del capside e poi li abbiamo titolati di conseguenza. Uno dei passaggi più cruciali di questo protocollo è quello di produrre quantità sufficienti di AAV che produrranno un'espressione reporter rilevabile dopo la trasduzione12,13. 
Il titering degli AAV è anche un fattore importante per regolare i dosaggi di AAV per le iniezioni intravitreali. Una v...

I virus associati all'adeno (AAV) sono ora comunemente usati per una varietà di studi di terapia genica retinica. Gli AAV forniscono un modo sicuro ed efficiente di consegna genica con meno immunogenicità e meno integrazioni del genoma. L'ingresso di AAV nella cellula bersaglio avviene attraverso l'endocitosi, che richiede il legame di recettori e co-recettori sulla superficie cellulare1,2. Pertanto, l'efficienza di trasduzione degli AAV per diversi tipi di cellule dipende principalmente dal capside e dalle sue interazioni con i recettori delle cellule ospiti. Gli AAV hanno sierotipi e ogni sierotipo può avere tropismi cellulari / tissutali distinti ed efficienze di trasduzione. Esistono anche sierotipi e varianti AAV artificiali generati dalla modifica chimica del capside virale, dalla produzione di capsidi ibridi, dall'inserimento di peptidi, dal rimescolamento del capside, dall'evoluzione diretta e dalla mutagenesi razionale3. Anche piccoli cambiamenti nella sequenza aminoacidica o nella struttura del capside possono avere un'influenza sulle interazioni con i fattori delle cellule ospiti e provocare diversi tropismi4. Oltre alle varianti di capside, altri fattori come la via di iniezione e la variazione da lotto a lotto della produzione di AAV possono influenzare l'efficienza di trasduzione degli AAV nella retina neuronale. Pertanto, sono necessari metodi affidabili per il confronto dei tassi di trasduzione per diverse varianti.
La maggior parte dei metodi per determinare l'efficienza di trasduzione AAV si basa sull'espressione genica del reporter. Questi includono imaging fluorescente, immunoistochimica, western blot o analisi istochimica del prodotto del gene reporter5,6,7. Tuttavia, a causa del vincolo dimensionale degli AAV, non è sempre possibile includere geni reporter per monitorare l'efficienza di trasduzione. L'uso di promotori forti come l'ibrido CMV enhancer/chicken beta-actin o Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE) come sequenza di stabilizzatori di mRNA complica ulteriormente il problema delle dimensioni8. Pertanto, sarà anche utile definire il tasso di trasduzione degli AAV iniettati con una metodologia più diretta.
La PCR a goccia digitale (dd-PCR) è una potente tecnica per quantificare il DNA bersaglio da piccole quantità di campioni. La tecnologia dd-PCR dipende dall'incapsulamento del DNA bersaglio e dalla miscela di reazione PCR da parte di goccioline d'olio. Ogni reazione dd-PCR contiene migliaia di goccioline. Ogni goccia viene elaborata e analizzata come reazione PCR indipendente9. L'analisi delle goccioline consente di calcolare il numero assoluto di copie delle molecole di DNA bersaglio in qualsiasi campione semplicemente utilizzando l'algoritmo di Poisson. Poiché l'efficienza di trasduzione degli AAV è correlata al numero di copie dei genomi AAV nella retina neuronale, abbiamo usato il metodo dd-PCR per quantificare i genomi AAV.
Qui, descriviamo una metodologia dd-PCR per calcolare l'efficienza di trasduzione di vettori AAV dal DNA genomico retinico6,10. In primo luogo, gli AAV che esprimono il reporter tdTomato sono stati generati utilizzando il protocollo su piccola scala e titered dal metodo dd-PCR11. In secondo luogo, gli AAV sono stati iniettati per via intravitreale nella retina neuronale. Per dimostrare l'efficienza di trasduzione, abbiamo prima quantificato l'espressione di tdTomato utilizzando la microscopia fluorescente e il software ImageJ. Questo è stato seguito dall'isolamento del DNA genomico per la quantificazione dei genomi AAV nelle retine iniettate utilizzando la dd-PCR. Il confronto dei livelli di espressione di tdTomato con i genomi AAV trasdotti quantificati dalla dd-PCR ha mostrato che il metodo dd-PCR ha quantificato accuratamente l'efficienza di trasduzione dei vettori AAV. I nostri protocolli hanno dimostrato una descrizione dettagliata di una metodologia basata su dd-PCR per quantificare le efficienze di trasduzione AAV. In questo protocollo, mostriamo anche il numero assoluto di genomi AAV che vengono trasdotti dopo iniezioni intravitreali semplicemente utilizzando il fattore di diluizione dopo l'isolamento del DNA genomico e i risultati della dd-PCR. Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo potente, che sarebbe un'alternativa all'espressione del reporter per quantificare le efficienze di trasduzione dei vettori AAV nella retina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-Well Semi-Skirted ddPCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6JRj mice strain</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 gaskets</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863009</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864008</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604Q</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>L 1825</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generation oil eva green</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864006</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>p30-3306</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seals for PX1 PCR Plate sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320933</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>ADEKA <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />LA&#199; SANAY<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" /> VE T<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />CARET A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>N01AB06</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector MM33</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>82-42-101-0000</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Labs</td>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01FB01</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Syringe 10 &#956;l</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle RN G36, 25 mm, PST 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BL-2</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-MAX</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pHGT1-Adeno1</td>
			<td>PlasmidFactory</td>
			<td>PF1236</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040032</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864034</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864001</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPLITTER FORCEP WATCHER 
			MAKER - LENGTH = 13.5 CM</td>
			<td>endostall medical</td>
			<td>EJN-160-0155</td>
			<td>Retina isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril Syringe Filter</td>
			<td>AISIMO</td>
			<td>ASF33PS22S</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Genomic DNA Kit</td>
			<td>EcoSpin</td>
			<td>E1070</td>
			<td>gDNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01CA01</td>
			<td>anti-inflammatory / antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropamid (% 0.5 tropicamide)</td>
			<td>Bilim <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />la&#231; Sanayi ve Ticaret A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>S01FA06</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbonuclease</td>
			<td>Accelagen</td>
			<td>N0103L</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears (carbomer 2 mg/g)</td>
			<td>Bausch+Lomb</td>
			<td>S01XA20</td>
			<td>lubricant eye drop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina

Molti laboratori di biologia cellulare retinica ora utilizzano abitualmente virus adeno-associati (AAV) per l'editing genetico e le applicazioni regolatorie. L'efficienza della trasduzione AAV è solitamente critica, il che influisce sui risultati sperimentali complessivi. Uno dei principali determinanti per l'efficienza di trasduzione è il sierotipo o la variante del vettore AAV. Attualmente, sono disponibili vari sierotipi e varianti AAV artificiali con diverse affinità con i recettori di superficie delle cellule ospiti. Per la terapia genica retinica, ciò si traduce in vari gradi di efficienza di trasduzione per diversi tipi di cellule retiniche. Inoltre, la via di iniezione e la qualità della produzione di AAV possono anche influenzare le efficienze di trasduzione AAV retinica. Pertanto, è essenziale confrontare l'efficienza di diverse varianti, lotti e metodologie. Il metodo digital droplet PCR (dd-PCR) quantifica gli acidi nucleici con elevata precisione e consente di eseguire la quantificazione assoluta di un dato target senza alcuno standard o riferimento. Utilizzando la dd-PCR, è anche possibile valutare le efficienze di trasduzione degli AAV mediante quantificazione assoluta dei numeri di copia del genoma AAV all'interno di una retina iniettata. Qui, forniamo un metodo semplice per quantificare il tasso di trasduzione degli AAV nelle cellule retiniche utilizzando la dd-PCR. Con piccole modifiche, questa metodologia può anche essere la base per la quantificazione del numero di copie del DNA mitocondriale e per valutare l'efficienza dell'editing di base, fondamentale per diverse malattie della retina e applicazioni di terapia genica.

La produzione di AAV su piccola scala è un metodo veloce ed efficiente che fornisce vettori per iniezioni intravitreali (Figura 1). La produzione di AAV su piccola scala di solito fornisce titoli nell'intervallo 1 x 1012 GC / ml che è sufficiente per rilevare l'espressione del reporter nella retina (Figura 2). Il titering di AAV utilizzando dd-PCR dà risultati coerenti. I primer specifici ITR2 e WPRE vengono utilizzati di routine e la concentrazion...

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Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

Questo protocollo presenta come quantificare l'efficienza di trasduzione AAV nella retina del topo utilizzando la PCR a goccia digitale (dd-PCR) insieme alla produzione di AAV su piccola scala, all'iniezione intravitreale, all'imaging retinico e all'isolamento del DNA genomico retinico.

Metodo Digital Droplet PCR per la quantificazione dell'efficienza di trasduzione AAV nella retina murina

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

In questo video, mostreremo come quantificare la trasduzione AAV nella retina del topo utilizzando il metodo della PCR a goccia digitale, che è estremamente sensibile e fa la quantificazione assoluta del DNA bersaglio. Abbiamo sviluppato questo metodo principalmente per grandi costrutti AVV che non ci consentono di utilizzare un gene reporter come i costrutti basati su CRISPR. Utilizzando questo metodo, possiamo semplicemente quantificare il tasso di trasduzione degli AAV nella retina.Questo metodo si basa sulla sensibilità e sulla quantificazione assoluta della PCR a goccia digitale e produce risultati diretti. In questo video, mostreremo come quantificare la trasduzione AAV nella retina del topo utilizzando il metodo della PCR a goccia digitale, che è estremamente sensibile e fa la quantificazione assoluta del DNA bersaglio. Abbiamo sviluppato questo metodo principalmente per costrutti di grandi aree che non ci consentono di utilizzare un gene reporter come i costrutti basati su CRISPR.Utilizzando questo metodo, possiamo semplicemente quantificare il tasso di trasduzione degli AAV nella retina. Questo metodo si basa sulla sensibilità e sulla quantificazione assoluta della PCR a due goccioline e produce risultati diretti. A causa dell'efficienza della metodologia DIGITAL DROPLET PCR, diversi laboratori passano già dalla PCR quantitativa in tempo reale alla PCR a goccia digitale o alla titolazione AAV.Questo metodo può anche fornire una base per la quantificazione del DNA mitocondriale nella retina, oltre a verificare l'efficienza della correzione delle mutazioni basata su CRISPR per la terapia genica nella retina del topo. Preparare la miscela di trasfezione con plasmide helper AAV, plasmide capside AAV, vettore AAV e soluzione PI in cinque millilitri richiesti. Aggiungere la miscela di trasfezione preparata per cinque millilitri nei terreni di coltura.Incubare le cellule trasfettate a 37 gradi Celsius. Raccogli i media a 48-60 ore dopo la trasfezione. Digerire il fluido con DNA ad una concentrazione finale di 250 unità per millilitro per 30 minuti a 37 gradi Celsius e centrifugarlo a 4.000 g quattro gradi Celsius per 30 minuti.Pre-bagnare la membrana di cellulosa rigenerata con PBS. Filtrare il fluido con un filtro a siringa da 0,22 micrometri nella membrana di cellulosa rigenerata pre-bagnata per 100 chili di Dalton. Centrifugare la membrana di cellulosa rigenerata a 4.000 G a quattro gradi Celsius per 30 minuti e scartare il mezzo.Lavare e centrifugare la membrana di cellulosa rigenerata con PBS contenente 0,001% Pluronic F68 tre volte a 4000 G quattro gradi Celsius per 30 minuti. Raccogliere AAV concentrati dalla parte superiore della membrana di cellulosa rigenerata e allocarli per un ulteriore utilizzo. Qui abbiamo mostrato come realizzare una produzione AAV su scala ridotta.Dopo aver esaminato questo protocollo, dovresti essere in grado di creare AVV sufficienti per vedere l'espressione del reporter nella retina. È inoltre possibile seguire il protocollo per la PCR digitale per essere in grado di titer la produzione AAV. Applicare una goccia di 0,5% tropicamide e 2,5% fenilefrina cloridrato contenente collirio prima dell'anestesia per dilatare le pupille.Anestetizzare i topi con isoflurano e verificare i riflessi. Applicare lo 0,3% di tobramicina e lo 0,1% di desametasone soluzione oftalmica sterile di collirio su ciascun occhio prima della procedura di iniezione. Utilizzare il gancio chirurgico per stabilizzare la palpebra superiore.Tirare leggermente indietro per esporre la parte dorsale dell'occhio. Fissare il gancio alla fascia per tenerlo in posizione. Rimuovere la congiuntiva con le forbici dell'iride curva per esporre la sclera dell'occhio.Utilizzare una siringa da insulina da 30 G fresca e sterile per perforare la sclera. Inserire l'ago della micro siringa attraverso la stessa puntura utilizzando il micropolpatore. Posizionare la punta dell'ago dietro la lente al centro della coppa dell'occhio.Iniettare lentamente un micro litro di soluzione AAV nel vitreo dell'occhio. Lasciare l'ago in posizione per un minuto e ritirare lentamente l'ago. Applicare un trattamento topico in gel antinfiammatorio e antibatterico contenente lo 0,3% di tobramicina e lo 0,1% di desametasone sul padiglione oculare.Applicare una goccia allo 0,5% di tropicamide. E il 2,5% di fenilefrina cloridrato contenente collirio prima dell'anestesia per dilatare le pupille. Applicare carbamide due milligrammi per grammo di gel topico sulla superficie degli occhi.Regolare il supporto del mouse in base alle esigenze per centrare l'occhio del mouse. Eseguire l'imaging del fondo e della fluorescenza su entrambi gli occhi per seguire l'espressione di TdTomato una settimana e due settimane dopo l'iniezione intravitreale. Eutanasia degli animali usando l'inalazione di anidride carbonica prima della procedura.Sposta il bulbo oculare in avanti con l'aiuto di una pinza splitter di 13,5 centimetri. Rimuovere la lente insieme al vitreo rimanente. Tagliare la connessione del bulbo oculare al nervo ottico con una pinza curva di precisione e spremere delicatamente la retina con la stessa pinza curva.Isolare il DNA genomico con un kit di DNA genomico tissutale basato su film di sintesi della proteinasi K commercializzato. Digerire completamente la retina a 55 gradi Celsius 200 G per 30 minuti con la proteinasi K.Lyse retina e seguire il proprotocolo del produttore. In questi protocolli, abbiamo mostrato l'imaging della florescenza del fondo di iniezione intravitreale, nonché l'isolamento della retina e del DNA genomico.Queste sono procedure molto critiche per la retina e, seguendo questo protocollo, dovresti essere in grado di iniettare gli AAV prodotti e seguire il loro profilo di espressione. E mestolare l'efficienza di trasduzione quantificando i genomi AAV nel DNA genomico retinico. Qui, puoi vedere l'applicazione di base della PCR a goccioline digitali, dove puoi fare una quantificazione assoluta del genoma AAV che trasduce nelle cellule retiniche.Diluire i DNA genomici dalle retine iniettate in soluzione F 68 pluronica allo 0,05% per raggiungere una concentrazione finale di un nanogrammo per microlitro per ciascun campione. Esegui la generazione di goccioline in un mix di reazione PCR da 20 microlitri, tra cui un nanogrammo di dna genomico 125 primer nanomolari e 2X evergreen super mix. Caricare la miscela di campioni nella parte centrale della cartuccia per la generazione di goccioline.Successivamente aggiungere 70 microlitri di olio di generazione di goccioline nella fila inferiore della cartuccia. Mettere la guarnizione sopra la cartuccia. Assicurarsi che non vi sia spazio tra la guarnizione e la cartuccia.Quindi posizionarlo nel generatore di gocce. Prelevare delicatamente circa 40 microlitri di goccioline che vengono generate nella campana superiore. Aggiungere la soluzione di goccioline alla piastra di reazione PCR semi-gonna a 96 pozzetti.Sigillare la piastra PCR con un sigillante a piastre PCR utilizzando un foglio di tenuta in alluminio. Posizionare la piastra PCR nel termociclatore termosaldato a 96 pozzetti. Utilizzare il protocollo ddPCR indicato nell'articolo.Posizionare la piastra PCR nel lettore di gocce per analizzare i dati. Dopo aver guardato questo video, dovresti essere in grado di eseguire la tecnica PCR digitale di base. È inoltre possibile utilizzare celle esercitate con piccole quantità di materiale, ideale per la tecnica PCR digitale.Tuttavia, è necessario regolare attentamente la quantità di DNA target per non superare il limite della PCR a goccia digitale. Ecco il diagramma di flusso per la procedura sperimentale. Abbiamo eseguito la produzione di AAV su piccola scala, seguita dalla titolazione AAV.Quindi abbiamo eseguito l'iniezione intravitreale. Successivamente, abbiamo quantificato l'intensità fluorescente mediante l'imaging a fluorescenza del fondo. Quindi isolato le retine di topo ed estratto il DNA genomico dalle retine per la ddPCR.Anche il titering AAV è fondamentale per essere in grado di quantificare correttamente la trasduzione AAV. ddPCR dipende dalla generazione di goccioline che hanno diluito il genom AAV bersaglio. I risultati rappresentativi della ddPCR mostrano goccioline positive e negative per il genoma AVV.Positivo sopra la soglia e negativo è sotto. Dopo essersi moltiplicato con i fattori di diluizione, il titolo degli AAV è risultato essere compreso tra 10 e 12 copie del genoma per millilitro. Al fine di quantificare correttamente l'efficienza di trasduzione AAV, sono state iniettate diverse retine.Gli animali iniettati sono stati ripresi e l'intensità media della fluorescenza è stata calcolata. A due settimane di tempo, le retine sono state isolate. E ddPCR è stato eseguito utilizzando WPRE e primer 18 S.L'intensità di fluorescenza delle retine iniettate da AAV è stata correlata con i calcoli del genoma AAV, mostrando la potenza della metodologia. Qui, abbiamo mostrato diverse tecniche, tra cui l'iniezione intravitreale di preparazione AAV su piccola scala.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neuroscienze

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