Name: digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

우리는 Oezkan 켈레스, 조세핀 Jüttner, 교수 보톤드 로스카, 분자 및 임상 안과 바젤, AAV 생산에 대한 그들의 도움과 지원을위한 복잡한 바이러스 플랫폼에 감사드립니다. 우리는 또한 교수 장 베넷, 의학의 페렐만 학교, AAV8 / BP2 균주에 대한 펜실베니아 대학에게 감사드립니다. 동물 작업은 Gebze 기술 대학 동물 시설에서 수행됩니다. 이를 위해, 우리는 기술 지원과 축산에 대한 지원을 위해 라일라 디크메타스와 교수 Uygar Halis Tazebay 교수에게 감사드립니다. 우리는 또한 원고에 대한 그녀의 의견에 대한 박사 Fatma 오즈데미르에게 감사드립니다. 이 작품은 TUBITAK, 교부금 번호 118C226 및 121N275, 사반치 대학 통합 보조금에 의해 지원됩니다.

모든 실험 프로토콜은 사반치 대학 윤리위원회에 의해 받아들여졌으며 연구에 동물을 사용하기위한 '비전 및 안과 연구 협회'의 성명에 따라 실험을 수행했습니다.
1. 소규모 AAV 생산12
<ol><li>문화 HEK293T 세포는 DMEM/10% FBS의 완전한 10mL에서 15cm 플레이트를 사용하여 70-80% 수렴성까지.</li>
	<li>도우미 플라스미드(pHGT1-Adeno1), 캡시드 플라스미드 7μg, ...

<ol>
	<li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions:+The+fast+and+the+curious.">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li><li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry.">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids.">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li><li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+structure+and+cell+interactions.">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li><li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+(intravitreal,+subretinal,+or+suprachoroidal)+in+rats.">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li><li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle.">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li><li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter.">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li><li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors.">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells.">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR.">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice,+non-human+primates+and+humans.">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li><li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing.">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li><li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia.">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+tools+for+biological+image+analysis.">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li><li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression.">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration.">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li><li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates.">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss.">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li><li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+with+CRISPR-Cas13.">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li></ol>

이 프로토콜에서, 우리는 다른 capsid 단백질을 가진 2개의 AAV 벡터를 생성하고 그에 따라 그(것)들을 titered. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나는 변환12,13후에 감지 가능한 리포터 발현을 산출하는 충분한 양의 AAV를 생성하는 것입니다.
AAV의 Titering 또한 intravitreal 주사에 대 한 AAV의 복용량을 조정 하는 중요 한 요소. 이러한 중?...

Adeno 관련 바이러스 (AAV)는 지금 일반적으로 망막 유전자 치료 연구의 각종을 위해 이용됩니다. AAV는 면역genicity및 적은 게놈 통합을 가진 유전자 전달의 안전하고 효율적인 방법을 제공합니다. 표적 세포로의 AAV 진입은 세포 표면1,2에수용체 및 공동 수용체의 결합을 요구하는 내분비증을 통해 발생합니다. 따라서, 상이한 세포 유형에 대한 AAV의 변환 효율은 주로 캡시드 및 숙주 세포 수용체와의 상호 작용에 달려 있다. AAV는 혈청형을 가지고 있으며 각 혈청형은 뚜렷한 세포/조직 트로피즘과 전관 효율을 가질 수 있습니다. 또한 바이러스 캡시드의 화학적 변형, 하이브리드 캡시드 생산, 펩타이드 삽입, 캡시드 셔플, 지향진화, 합리적 돌연변이발생3의화학적 변형에 의해 생성된 인공 AAV 혈청형 및 변이체도 있다. 아미노산 서열 또는 캡시드 구조의 사소한 변화조차도 숙주 세포 인자와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있으며 다른 트로피4를 초래할 수 있다. 캡시드 변이체 외에도, AAV 생산의 사출 경로 및 배치 간 변화와 같은 다른 요인은 신경 망막에서 AAV의 변환 효율에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 다른 변종에 대한 변환 속도의 비교를위한 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다.
AAV 트랜스듀션 효율을 결정하는 대부분의 방법은 리포터 유전자 발현에 의존한다. 이들은 리포터 유전자생성물의형광 화상 진찰, 면역히스토케, 서양 얼룩, 또는 화학적 분석을포함5,6,7. 그러나, AAV의 크기 제약으로 인해, 트랜스듀션 효율을 모니터링하기 위해 기자 유전자를 포함하는 것이 항상 가능하지는 않다. mRNA 안정기 서열로서 하이브리드 CMV 증강제/닭 베타-액틴 또는 우드척 형 간염 조절 원소(WPRE)와 같은 강력한 프로모터를 사용하면 크기 문제를 더욱 복잡하게 만든다8. 따라서 보다 직접적인 방법론으로 주입된 AAV의 트랜스듀션 속도를 정의하는 것도 도움이 될 것이다.
디지털 물방울 PCR (dd-PCR)은 미세한 양의 샘플에서 표적 DNA를 정량화하는 강력한 기술입니다. dd-PCR 기술은 오일 방울에 의한 표적 DNA 및 PCR 반응 혼합물의 캡슐화에 의존한다. 각 dd-PCR 반응에는 수천 개의 물방울이 포함되어 있습니다. 각 액적은 독립적인 PCR 반응9로처리되고 분석된다. 물방울의 분석은 푸아송 알고리즘을 사용하여 모든 샘플에서 표적 DNA 분자의 절대 복사 수를 계산할 수 있습니다. AAV의 트랜스듀션 효율은 뉴런 망막에서 AAV 게놈의 카피 수와 상관관계가 있기 때문에 DD-PCR 방법을 사용하여 AAV 게놈을 정량화했습니다.
여기서, 우리는 망막 게놈 DNA6,10로부터AAV 벡터의 트랜스듀션 효율을 계산하기 위해 dd-PCR 방법론을 설명한다. 먼저, tdTomato 리포터를 표현하는 AAV는 소규모 프로토콜을 사용하여 생성되었고, dd-PCR방법(11)에의해 적발되었다. 둘째, AAV는 신경 망막에 주입되었습니다. 트랜스듀션 효율을 입증하기 위해, 우리는 먼저 형광 현미경 검사법과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 tdTomato 발현을 정량화했습니다. 이것은 dd-PCR를 사용하여 주입된 망막에 있는 AAV 게놈의 정량화를 위한 게놈 DNA의 격리에 선행되었습니다. dd-PCR에 의해 정량화된 변환된 AAV 게놈과 tdTomato 발현 수준을 비교한 결과 dd-PCR 방법은 AAV 벡터의 트랜스듀션 효율을 정확하게 정량화한 것으로 나타났다. 당사의 프로토콜은 AAV 변환 효율성을 정량화하기 위해 dd-PCR 기반 방법론에 대한 자세한 설명을 보여 주어. 이 프로토콜에서, 우리는 또한 단순히 게놈 DNA 격리 및 dd-PCR 결과 후에 희석 인자를 사용하여 인트라비티리얼 주사 후에 유도되는 AAV 게놈의 절대 수를 보여줍니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 망막에서 AAV 벡터의 트랜스듀션 효율성을 정량화하기 위한 기자 표현의 대안이 될 강력한 방법을 제공한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-Well Semi-Skirted ddPCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6JRj mice strain</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 gaskets</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863009</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864008</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604Q</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>L 1825</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generation oil eva green</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864006</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>p30-3306</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seals for PX1 PCR Plate sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320933</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>ADEKA <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />LA&#199; SANAY<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" /> VE T<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />CARET A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>N01AB06</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector MM33</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>82-42-101-0000</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Labs</td>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01FB01</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Syringe 10 &#956;l</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle RN G36, 25 mm, PST 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BL-2</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-MAX</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pHGT1-Adeno1</td>
			<td>PlasmidFactory</td>
			<td>PF1236</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040032</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864034</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864001</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPLITTER FORCEP WATCHER 
			MAKER - LENGTH = 13.5 CM</td>
			<td>endostall medical</td>
			<td>EJN-160-0155</td>
			<td>Retina isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril Syringe Filter</td>
			<td>AISIMO</td>
			<td>ASF33PS22S</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Genomic DNA Kit</td>
			<td>EcoSpin</td>
			<td>E1070</td>
			<td>gDNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01CA01</td>
			<td>anti-inflammatory / antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropamid (% 0.5 tropicamide)</td>
			<td>Bilim <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />la&#231; Sanayi ve Ticaret A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>S01FA06</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbonuclease</td>
			<td>Accelagen</td>
			<td>N0103L</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears (carbomer 2 mg/g)</td>
			<td>Bausch+Lomb</td>
			<td>S01XA20</td>
			<td>lubricant eye drop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina

많은 망막 세포 생물학 실험실은 지금 일상적으로 유전자 편집 및 규제 응용을 위해 Adeno 관련 바이러스 (AAV)를 이용합니다. AAV 트랜스듀션의 효율성은 일반적으로 중요하며, 이는 전반적인 실험 결과에 영향을 미칩니다. 트랜스듀션 효율을 위한 주요 결정요인 중 하나는 AAV 벡터의 혈청형 또는 변형이다. 현재, 다양한 인공 AAV 혈청형 및 변이체는 세포 표면 수용체를 호스트하기 위해 상이한 친화력으로 사용할 수 있다. 망막 유전자 치료를 위해, 이것은 다른 망막 세포 모형을 위한 transction 효율성의 다양한 정도에서 초래합니다. 또한, 사출 경로 및 AAV 생산의 품질은 또한 망막 AAV 변환 효율성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 다양한 변형, 배치 및 방법론의 효율성을 비교하는 것이 필수적입니다. 디지털 물방울 PCR(dd-PCR) 방법은 핵산을 고정밀으로 정량화하고 표준이나 기준 없이 주어진 표적의 절대 정량화를 수행할 수 있게 한다. dd-PCR을 사용하면 주입된 망막 내에서 AAV 게놈 카피 번호를 절대적인 정량화하여 AAV의 트랜스듀션 효율성을 평가하는 것도 가능하다. 여기서, 우리는 dd-PCR를 사용하여 망막 세포에서 AAV의 변환 속도를 정량화하는 간단한 방법을 제공합니다. 사소한 수정으로, 이 방법론은 또한 미토콘드리아 DNA의 복사 수 정량화뿐만 아니라 여러 망막 질환 및 유전자 치료 응용 프로그램에 중요한 기본 편집의 효율성을 평가하기위한 기초가 될 수 있습니다.

소규모 AAV 생산은 인트라비리얼주사(도 1)에대한 벡터를 제공하는 빠르고 효율적인 방법입니다. 소규모 AAV 생산은 일반적으로 망막에서 리포터 발현을 감지하기에 충분한 1 x10 12 GC/ml 범위 내에서 티터를 제공한다(도2). dd-PCR을 사용하여 AAV를 사용하면 일관된 결과가 생성됩니다. ITR2 및 WPRE 특이적 프라이머는 정기적으로 사용되고 각 표적 분자...

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Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

이 프로토콜은 작은 규모의 AAV 생산, 인트라비탈 주사, 망막 이미징 및 망막 게놈 DNA 격리와 함께 디지털 액적 PCR (dd-PCR)을 사용하여 마우스 망막에서 AAV 변환 효율을 정량화하는 방법을 제시합니다.

뮤린 망막에서 AAV 변환 효율의 정량화를위한 디지털 물방울 PCR 방법

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

이 비디오에서는 매우 민감하고 대상 DNA의 절대 적인 정량화를 수행하는 디지털 물방울 PCR 방법을 사용하여 마우스 망막에서 AAV 변환을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 우리가 CRISPR 기반 구조같이 기자 유전자를 사용하는 것을 허용하지 않는 큰 AVV 구조물을 위해 주로 이 방법을 개발했습니다. 이 방법을 사용하면 망막에서 AAV의 변환 속도를 정량화할 수 있습니다.이 방법은 디지털 물방울 PCR의 감도 및 절대 정량화에 의존하며 곧바로 결과를 산출합니다. 이 비디오에서는 매우 민감하고 대상 DNA의 절대 적인 정량화를 수행하는 디지털 물방울 PCR 방법을 사용하여 마우스 망막에서 AAV 변환을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 우리가 CRISPR 기반 구조같이 기자 유전자를 사용하는 것을 허용하지 않는 큰 지역 구조물을 위해 주로 이 방법을 개발했습니다.이 방법을 사용하면 망막에서 AAV의 변환 속도를 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 두 방울 PCR의 감도 및 절대 정량화에 의존하며 곧바로 결과를 산출합니다. 디지털 물방울 PCR 방법론의 효율성 때문에 여러 실험실은 이미 정량적 실시간 PCR에서 디지털 물방울 PCR 또는 AAV 티팅으로 전환됩니다.이 방법은 또한 망막에서 미토콘드리아 DNA 정량화에 대한 기초를 제공할 뿐만 아니라 마우스 망막에서 유전자 치료를 위한 CRISPR 기반 돌연변이 교정의 효율을 확인할 수 있다. 5밀리리터 수요에 AAV 도우미 플라스미드, AAV 캡시드 플라스미드, AAV 벡터 및 PI 용액으로 트랜스페션 혼합물을 준비합니다. 5 밀리리터를 제조한 트랜스페션 혼합물을 배양 매체에 추가합니다.섭씨 37도에서 감염된 세포를 배양합니다. 48~60시간 후 의 미디어를 수집합니다. DNA로 미디어를 37도에서 30분 동안 밀리리터당 250유닛, 30분간 원심분리기로 30분간 소화합니다.PBS를 통해 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 미리 습식합니다. 0.22 마이크로미터 주사기 필터로 미디어를 100킬로 달톤에 대한 미리 습식 재생셀룰로오스 멤브레인에 넣습니다. 30분 동안 섭씨 4, 000 G에서 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 원심분리하고 미디어를 폐기합니다.PBS로 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 세척하고 원심분리하여 30분 동안 섭씨 4000G에서 0.001%의 플루론 F68을 3회 세척한다. 재생된 셀룰로오스 멤브레인의 상부에서 농축 된 AAV를 수집하고 추가 사용을 위해 할당하십시오. 여기서 우리는 작은 규모의 AAV 생산을 만드는 방법을 보여 주었다.이 프로토콜을 검사한 후 망막에서 기자 의표정을 보기에 충분한 AvV를 만들 수 있어야 합니다. 또한 디지털 PCR의 프로토콜을 따라 생산 된 AAV를 titer할 수 있습니다. 마취 전에 안약이 함유된 0.5%의 열대아미드와 2.5%의 페닐레프린 염산염1방울을 적용하여 동공을 증식합니다.이소플루란으로 마우스를 마취시키고 반사 신경을 확인합니다. 주입 시술 전에 각 눈에 0.3%의 토브라마이신과 0.1%덱사메타손 멸균 안과 용액 안과 액액을 적용합니다. 수술 후크를 사용하여 눈꺼풀 상부를 안정화시하십시오.눈의 등대 부분을 노출시키기 위해 약간 뒤로 당깁니다. 후크를 밴드에 테이프로 테이프로 고정합니다. 눈의 clera를 노출하기 위해 곡선 홍채 가위로 결막을 제거합니다.신선하고 멸균된 30G 인슐린 주사기를 사용하여 clera를 뚫습니다. 마이크로 조작기로 동일한 펑크를 통해 마이크로 주사기의 바늘을 삽입합니다. 바늘 끝을 렌즈 뒤에 두는 눈컵 중간에 놓습니다.AAV 용액 1리터를 눈의 유리체에 천천히 주입합니다. 바늘을 1분 동안 제자리에 두고 천천히 바늘을 철회하십시오. 안구컵에 0.3%토브라마이신과 0.1%의 덱사메타손이 함유된 항염증제 및 항균 국소 젤 트리트먼트를 적용하십시오.0.5%의 트로피아미드를 한 방울 떨어뜨리면 됩니다. 그리고 마취 전에 안약이 함유된 2.5%의 페닐레프린 염산염으로 동공을 팽창시. 카르바미드를 그램 국소 젤당 2밀리그램을 눈 표면에 바이런을 발라주세요.마우스 눈을 중심으로 필요에 따라 마우스 스탠드를 조정합니다. TdTomato 발현을 1주일 및 2주 후에 는 두 눈에 fundus 및 형광 이미징을 수행합니다. 절차 전에 이산화탄소 흡입을 사용하여 동물을 안락사시하십시오.13.5센티미터 스플리터 포셉의 도움으로 눈공을 앞으로 이동합니다. 렌즈를 남은 유리체와 함께 제거합니다. 정밀 곡선 포셉으로 안구의 연결을 시신경과 잘라내고 동일한 곡선 포셉으로 망막을 부드럽게 짜냅니다.유전체 DNA를 상용화된 단백질아제 K 다이제스트 필름 기반 조직 게놈 DNA 키트로 분리한다. 단백질Ase K.Lyse 망막으로 30 분 동안 섭씨 55도 200 G에서 망막을 소화하고 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 이러한 프로토콜에서, 우리는 망막과 게놈 DNA 격리뿐만 아니라 intravitreal 주입 fundus 꽃집 화상 진찰을 보여주었습니다.이들은 망막에 대 한 매우 중요 한 절차, 그리고이 프로토콜을 따라, 생산 된 AAV를 주입 하 고 그들의 식 프로필을 후속 수 있어야 합니다. 그리고 망막 게놈 DNA에서 AAV 게놈을 정량화하여 그 변환 효율을 국자. 여기에서 망막 세포에서 트랜스듀스하는 AAV 게놈의 절대적인 정량화를 할 수 있는 디지털 물방울 PCR의 기본 적용을 볼 수 있습니다.각 샘플에 대해 마이크로리터 당 1 나노그램의 최종 농도에 도달하기 위해 0.05%의 플루론 F 68 용액으로 주입된 망막으로부터 게놈 DNA를 희석시합니다. 나노그램 게놈 DNA 125 나노몰라 프라이머와 2X 상록 슈퍼 믹스를 포함한 20마이크로리터 PCR 반응 믹스에서 액적 생성을 수행한다. 물방울 생성을 위해 카트리지의 중간 부분에 샘플 믹스를 로드합니다.그 후 70개의 마이크로리터 액적 생성 오일을 카트리지의 맨 아래 줄에 넣습니다. 개스킷을 카트리지 위에 놓습니다. 개스킷과 카트리지 사이에 간격이 없는지 확인합니다.그런 다음 액적 생성기에 넣습니다. 상단 종에서 생성되는 약 40 마이크로 리터의 물방울을 부드럽게 가져 가라. 세미 스커트 96-Well PCR 반응 플레이트에 액적 용액을 추가합니다.알루미늄 밀봉 호일을 사용하여 PCR 플레이트 실러로 PCR 플레이트를 밀봉하십시오. PCR 플레이트를 96-Well 열 밀봉 열 사이클러에 넣습니다. 문서에 표시된 ddPCR 프로토콜을 사용합니다.데이터를 분석하기 위해 PCR 플레이트를 액적 판독기에 배치합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 기본적인 디지털 PCR 기술을 수행할 수 있어야 합니다. 또한 디지털 PCR 기술에 이상적인 소량의 재료로 가전 된 세포를 사용할 수 있습니다.그러나 대상 DNA 양을 디지털 방울 PCR의 한계를 초과하지 않도록 신중하게 조정해야 합니다. 실험 절차에 대한 흐름 차트는 다음과 같습니다. 우리는 AAV 티터링 다음에 작은 규모의 AAV 생산을 수행했습니다.그런 다음 우리는 인트라비티리얼 주사를 수행했습니다. 그 후, 우리는 fundus 형광 화상 진찰에 의해 형광 강도를 정량화했습니다. 그런 다음 마우스 망막을 분리하고 ddPCR에 대한 망막에서 게놈 DNA를 추출했습니다.Titering AAV는 AAV 변환을 올바르게 정량화할 수 있어야 합니다. ddPCR은 타겟 AAV 제놈을 희석한 액적생성에 따라 달라집니다. 대표적인 ddPCR 결과는 AVV 게놈에 대한 양수 및 음수 액적을 나타낸다.임계값보다 양수 및 음수는 아래입니다. 희석 인자를 곱한 후, AAV의 티터는 밀리리터 당 게놈 사본에서 10에서 12로 나타났습니다. AAV 대납 효율을 올바르게 정량화하기 위해 여러 망막이 주입되었습니다.주입된 동물을 이미지화하고, 형광평균 강도가 계산되었다. 2주 시점에서 망막은 고립되었습니다. 및 ddPCR은 WPRE 및 18 S 프라이머를 사용하여 수행되었다.AAV 주입망막의 형광 강도는 방법론의 힘을 보여주는 AAV 게놈 계산과 상관관계가 있었다. 여기에서, 우리는 몇몇 기술을 보여주었습니다, 소규모 AAV 준비 intravitreal 주입을 포함하여.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

연구

신경과학

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

눈 기구학 생체 외에서 거북이에 두개골 신경의 자극에 의해 측정

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

거미 막 밑 출혈의 Murine 모델에 대뇌 Vasospasm의 정량화에 대 한 체적 메서드

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 단리를 위한 두 가지 박리 방법

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

생체 내 재현성 촉진을 위한 마우스 망막의 혈관 손상 판독

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

마우스 Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

저자 스포트라이트: 녹내장 진단 및 치료 개선을 위한 In Vivo 및 Ex Vivo 망막 영상의 발전 

Align of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina(가시광선 광간섭 단층 촬영 파이버그램과 동일한 마우스 망막의 컨포칼 이미지 정렬)

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...