هذا البروتوكول مهم لأن العمل بنجاح مع المواد العضوية يكمن في التفاصيل ، ويفتقد الحقل إلى بروتوكولات مفصلة واضحة للآخرين للبناء عليها. أكبر ميزة لهذه التقنية هي الجدول الزمني ، ومتطلبات الكتلة الحيوية المنخفضة ، وقابلية التوسع منخفضة التكلفة. في حين أن هناك حاجة إلى مزيد من العمل ، يمكن أن تساعد هذه التقنية في تحسين علاج سرطان الرئة من خلال السماح باختبار علاجات فردية أو مركبة أكثر دقة يمكن ترجمتها سريريا.
التحدي الأكبر هو التعامل مع BME2 ، المعروف على نطاق واسع باسم Matrigel. أوصي بشدة بممارسة السحب والتعامل مع BME2 السائل قبل تقديم المواد العضوية الثمينة. ابدأ بفصل الثقافة العضوية BME2 المغمورة عن طريق شفط الوسائط بعناية من لوحات الثقافة لتجنب لمس الثقافة.
التريبسين ثقافة BME2 العضوية المغمورة بإنزيم مؤتلف مناسب عن طريق إضافة ملليلتر من الإنزيم المؤتلف لكل بئر في صفيحة من ستة آبار. كسر ميكانيكيا BME2 عن طريق السحب المتكرر لأعلى ولأسفل واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة ، انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي بسرعة 600 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
شفط الإنزيم المؤتلف supernatant بعناية دون لمس بيليه العضوية وإعادة تعليق بيليه العضوية في وسط النمو. بعد إضافة DNase 1 ، احتضن التعليق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وأجهزة الطرد المركزي عند 600 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الوسائط بعناية دون لمس الكريات العضوية وأعد تعليق الكريات في وسط نمو جديد.
قم بتسخين صفيحة بئر سوداء جديدة ذات قاع شفاف 96 عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 10 دقائق ، ثم قم بإعداد تعليق خلوي في PBS لحساب الخلايا باستخدام محلل الخلايا. بعد حساب حجم تعليق الخلية المطلوب للتجربة ، قم باقتباس الخلايا من تعليق خلية واحدة وتحريكها عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح سابقا. بمجرد التخلص من الوسائط ، احتفظ بالخلايا على الجليد لمدة دقيقة واحدة تقريبا قبل تعليقها في BME2.
قم بإمالة صفيحة البئر 96 السوداء الصافية التي تم تسخينها مسبقا نحو الجسم وزرع خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية لكل بئر ، تليها بذر قباب الخلية في موضع الساعة السادسة من البئر. املأ الآبار الخارجية على حافة صفيحة البئر 96 ب PBS وزرع قباب الخلية في الآبار الداخلية المتبقية. احتضن قباب الخلايا ذات البذور الطازجة في غطاء التدفق الرقائقي لزراعة الخلايا لمدة خمس دقائق دون تحريك الصفيحة ، ثم انقل الصفيحة إلى حاضنة زراعة الخلايا للحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
أضف بعناية 100 ميكرولتر من متوسط النمو لكل بئر إلى جميع الآبار التي تحتوي على عضويات و 100 ميكرولتر من PBS إلى الآبار الخارجية على حافة اللوحة. استزراع المواد العضوية عند 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام ، وتغيير الوسائط وفقا للتوجيهات المذكورة في مخطوطة النص ، وفحص نمو المواد العضوية تحت المجهر الضوئي بانتظام. قم بإعداد تخفيف دوائي تسلسلي في وسائط عامل النمو المنخفض ل osimertinib لعلاج الخلايا العضوية غير الصغيرة من سرطان الرئة المتحور EGFR.
قم بتضمين عنصر تحكم سلبي عن طريق إضافة وسائط عامل نمو منخفض و 0.1٪ DMSO. قم بتدوير الصفيحة العضوية في اتجاه عقارب الساعة بمقدار 180 درجة بحيث تكون المواد العضوية الآن في وضع الساعة 12 وقم بشفط وسائط النمو بعناية باستخدام جهاز متعدد القنوات بشكل مفضل. أضف 100 ميكرولتر من محلول التحكم أو الدواء لكل بئر.
احتضان المواد العضوية المعالجة مرة أخرى عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا لمدة خمسة أيام. ابدأ في إجراء فحص البقاء على قيد الحياة عن طريق إذابة الكاشف بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. قم بموازنة الكاشف في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام واخلطه عن طريق العكس.
أضف 100 ميكرولتر من الكاشف إلى كل بئر واخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل مع وضع طرف الماصة في موضع القبة العضوية. احتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل ما يقرب من 150 ميكرولترا من الليزات إلى صفيحة بئر بيضاء بيضاء جديدة غير شفافة من القاع 96 ثم احتضن اللوحة لمدة 25 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
سجل التلألؤ باستخدام قارئ لوحة ELISA. احفظ البيانات بتنسيق جدول بيانات مناسب يحتوي على جميع القراءات والتسجيلات الأولية لتخطيط اللوحة والأدوية المستخدمة. أظهرت المواد العضوية TH107 الإيجابية المتحورة EGFR حساسية لعلاج osimertinib مع نصف تركيز مثبط أقصى يبلغ 56 نانومولار في حين أن المواد العضوية TH116 الإيجابية المتحولة EGFR كانت مقاومة للعلاج osimertinib مع نصف تركيز مثبط أقصى يزيد عن ميكرومولار واحد.
كانت حساسية خلايا سرطان الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة TH107 إيجابية EGFR مصحوبة بتغييرات نسخية كبيرة ، بما في ذلك انخفاض في التعبير عن التوقيعات الجينية المرتبطة بدورة الخلية وزيادة في التعبير عن التوقيع الجيني المرتبط بموت الخلايا المبرمج. تتأثر استجابة TH330 الإيجابية الحساسة ل EGFR للمثبطات المستهدفة بشكل كبير في وسائط النمو مقابل وسائط عامل النمو المنخفضة. أدت العلاجات التوافقية في TH330 الإيجابي ل EGFR إلى زيادة استجابة العلاج.
يعمل هذا النهج على تحسين الاستراتيجيات الشخصية للعلاج الجزيئي أو أنظمة العلاج التوافقي. ويساعد هذا الأخير على استهداف آليات تحمل الأدوية ومقاومتها في وقت مبكر لتعميق الاستجابة السريرية وتحسين نتائج المرضى.
