Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da die erfolgreiche Arbeit mit Organoiden in den Details liegt und dem Feld klare detaillierte Protokolle fehlen, auf denen andere aufbauen können. Der größte Vorteil dieser Technik ist der Zeitrahmen, der geringe Biomassebedarf und die kostengünstige Skalierbarkeit. Während viel mehr Arbeit erforderlich ist, könnte diese Technik dazu beitragen, die Behandlung von Lungenkrebs zu verbessern, indem sie die Erprobung präziserer Einzel- oder Kombinationstherapien ermöglicht, die klinisch übersetzt werden könnten.
Die größte Herausforderung ist der Umgang mit BME2, weithin bekannt als Matrigel. Ich empfehle dringend, das Pipettieren und den Umgang mit flüssigem BME2 zu üben, bevor Sie Ihre wertvollen Organoide einführen. Beginnen Sie mit der Dissoziation der untergetauchten BME2-Organoidkultur, indem Sie die Medien vorsichtig von den Kulturplatten absaugen und vermeiden, die Kultur zu berühren.
Trypsinisieren Sie die eingetauchte BME2-Organoidkultur mit einem geeigneten rekombinanten Enzym, indem Sie zwei Milliliter rekombinantes Enzym pro Well in eine Sechs-Well-Platte geben. Brechen Sie das BME2 mechanisch durch, indem Sie wiederholt auf und ab pipettieren und Platten bei 37 Grad Celsius im Zellkulturinkubator für fünf Minuten inkubieren. Am Ende der Inkubation die Suspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang bei 600-fachem G zentrifugieren.
Saugen Sie den rekombinanten Enzymüberstand vorsichtig ab, ohne das Organoidpellet zu berühren, und resuspendieren Sie das Organoidpellet in Wachstumsmedium. Nach Zugabe von DNase 1 die Suspension fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und bei Raumtemperatur drei Minuten lang bei 600 g zentrifugieren. Entsorgen Sie das Medium vorsichtig, ohne das Organoid-Pellet zu berühren, und suspendieren Sie das Pellet in einem frischen Wachstumsmedium.
Vorwärmen Sie eine neue schwarze, klare Bodenplatte mit 96 Bohrloch bei 37 Grad Celsius im Zellkulturinkubator für 10 Minuten vor und bereiten Sie dann eine Zellsuspension in PBS vor, um die Zellen mit einem Zellanalysator zu zählen. Nach der Berechnung des für das Experiment erforderlichen Zellsuspensionsvolumens aliquotieren Sie die Zellen aus Einzelzellsuspension und pelletieren Sie sie durch Zentrifugation ab, wie zuvor gezeigt. Sobald das Medium entsorgt ist, halten Sie die Zellen etwa eine Minute lang auf Eis, bevor Sie sich in BME2 wieder aufhalten.
Kippen Sie die vorgewärmte schwarze, klare untere 96-Wellplatte in Richtung Körper und säen Sie fünf Mikroliter Zellsuspension pro Well, gefolgt von der Aussaat der Zellkuppeln an der Sechs-Uhr-Position des Wells. Füllen Sie die äußeren Vertiefungen am Rand der 96-Well-Platte mit PBS und säen Sie die Zellkuppeln in den verbleibenden inneren Wells. Inkubieren Sie frisch ausgesäte Zellkuppeln fünf Minuten lang in der Zellkultur-Laminar-Flow-Haube, ohne die Platte zu bewegen, und übertragen Sie die Platte dann zur Inkubation bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten in den Zellkultur-Inkubator.
Fügen Sie vorsichtig 100 Mikroliter Wachstumsmedium pro Vertiefung zu allen Vertiefungen hinzu, die Organoide enthalten, und 100 Mikroliter PBS zu den äußeren Vertiefungen am Rand der Platte. Sieben Tage lang die Organoide bei 37 Grad Celsius kultivieren, Medien gemäß den im Textmanuskript genannten Anweisungen wechseln und das Wachstum der Organoide regelmäßig unter dem Lichtmikroskop untersuchen. Bereiten Sie eine serielle Arzneimittelverdünnung in Medien mit niedrigem Wachstumsfaktor für Osimertinib zur Behandlung von EGFR-mutierten nicht-kleinzelligen Lungenkrebsorganoiden vor.
Schließen Sie eine Negativkontrolle ein, indem Sie Medien mit niedrigem Wachstumsfaktor und 0,1% DMSO hinzufügen. Drehen Sie die Organoidplatte im Uhrzeigersinn um 180 Grad, so dass sich die Organoide nun in einer 12-Uhr-Position befinden, und aspirieren Sie die Wachstumsmedien vorzugsweise vorsichtig mit einer Mehrkanalvorrichtung. Fügen Sie 100 Mikroliter Kontroll- oder Arzneimittellösung pro Vertiefung hinzu.
Inkubieren Sie behandelte Organoide erneut bei 37 Grad Celsius im Zellkultur-Inkubator für fünf Tage. Beginnen Sie mit der Durchführung des Überlebensassays, indem Sie das Reagenz über Nacht bei vier Grad Celsius auftauen. Das Reagenz vor Gebrauch 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei Raumtemperatur ausgleichen und durch Umwälzen mischen.
Fügen Sie 100 Mikroliter des Reagenzes zu jeder Vertiefung hinzu und mischen Sie gründlich, indem Sie mit der Pipettenspitze, die an der Position der Organoidkuppel platziert ist, auf und ab pipettieren. Fünf Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette etwa 150 Mikroliter des Lysats auf eine neue weiße, undurchsichtige Bodenplatte mit 96 Vertiefungen und inkubieren Sie die Platte dann für weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
Zeichnen Sie die Lumineszenz mit einem ELISA-Plattenleser auf. Speichern Sie die Daten in einem geeigneten Datentabellenformat, das alle Rohlesevorgänge und Aufzeichnungen des Plattenlayouts und der verwendeten Arzneimittel enthält. Die EGFR-mutierten positiven TH107-Organoide zeigten eine Empfindlichkeit gegenüber der Behandlung mit Osimertinib mit einer halben maximalen inhibitorischen Konzentration von 56 Nanomolaren, während EGFR-mutierte positive TH116-Organoide mit einer halben maximalen inhibitorischen Konzentration von mehr als einem Mikromolar gegen die Behandlung mit Osimertinib resistent waren.
Die Sensitivität von EGFR-positiven TH107-nichtkleinzelligen Lungenkrebszellen wurde von signifikanten transkriptionellen Veränderungen begleitet, einschließlich einer Verringerung der Expression von Zellzyklus-assoziierten Gensignaturen und einer Zunahme der Expression der Apoptose-assoziierten Gensignatur. Die Reaktion von empfindlichem EGFR-mutiertem positivem TH330 auf zielgerichtete Inhibitoren wird signifikant in Wachstumsmedien im Vergleich zu Medien mit niedrigem Wachstumsfaktor beeinflusst. Kombinatorische Behandlungen bei EGFR-mutiertem positivem TH330 führten zu einem erhöhten Ansprechen auf die Behandlung.
Dieser Ansatz verbessert personalisierte Strategien für die molekulare Therapie oder kombinatorische Behandlungsschemata. Letzteres hilft, Arzneimitteltoleranz und Resistenzmechanismen frühzeitig zu bekämpfen, um das klinische Ansprechen zu vertiefen und die Patientenergebnisse zu verbessern.
