Detta protokoll är viktigt eftersom framgångsrikt arbete med organoider ligger i detaljerna, och fältet saknar tydliga detaljerade protokoll för andra att bygga från. Den största fördelen med denna teknik är tidsskalan, de låga biomassakraven och lågkostnadsskalbarheten. Medan mycket mer arbete behövs, kan denna teknik bidra till att förbättra lungcancerbehandlingen genom att möjliggöra testning av mer exakta individuella eller kombinationsbehandlingar som kan översättas kliniskt.
Den största utmaningen är hanteringen av BME2, allmänt känd som Matrigel. Jag rekommenderar starkt att du övar pipettering och hantering av vätska BME2 innan du introducerar dina värdefulla organoider. Börja med att separera nedsänkt BME2-organoidkultur genom att noggrant aspirera media från odlingsplattorna och undvik att röra vid kulturen.
Prova den nedsänkta BME2-organoidkulturen med ett lämpligt rekombinant enzym genom att tillsätta två milliliter rekombinant enzym per brunn i en sex välplatta. Mekaniskt bryta BME2 genom att upprepade gånger pipettera upp och ner och inkubera plattor vid 37 grader Celsius i cellodlingsinkubatorn i fem minuter. I slutet av inkubationen överför du suspensionen till ett 15 ml centrifugrör och centrifug vid 600 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur.
Aspirera det rekombinanta enzymet supernatant försiktigt utan att röra den organoida pelleten och återanvända den organoida pelleten i tillväxtmediet. Efter tillsats av DNase 1, inkubera suspensionen i fem minuter vid rumstemperatur och centrifugera vid 600 gånger G i tre minuter vid rumstemperatur. Kassera mediet försiktigt utan att röra vid den organoida pelleten och återanvänd pelleten i ett nytt tillväxtmedium.
Förvärm en ny svart klar botten 96 brunnsplatta vid 37 grader Celsius i cellodlingsinkubatorn i 10 minuter och förbered sedan en cellupphängning i PBS för att räkna cellerna med hjälp av en cellanalysator. Efter beräkning av den cellfjädringsvolym som krävs för experimentet, aliquot cellerna från encells suspension och pellet ner genom centrifugering som visats tidigare. När mediet har kasserats ska cellerna förvaras på is i ungefär en minut innan de återanvänds i BME2.
Luta den förvärmda svarta klara botten 96 välplattan mot kroppen och frö fem mikroliter av cellfjädring per brunn, följt av sådd av cellkupolerna vid brunnens läge klockan sex. Fyll de yttre brunnarna vid kanten av 96-brunnsplattan med PBS och frö cellkupolerna i de återstående inre brunnarna. Inkubera nysådda cellkupoler i cellkulturens laminära flödeshuv i fem minuter utan att flytta plattan och överför sedan plattan till cellodlingsinkubatorn för inkubation vid 37 grader Celsius i 10 minuter.
Tillsätt försiktigt 100 mikroliter tillväxtmedium per brunn till alla brunnar som innehåller organoider och 100 mikroliter PBS till de yttre brunnarna vid plattans kant. Odla organoiderna vid 37 grader Celsius i sju dagar, ändra media enligt de anvisningar som nämns i textmanuskriptet och inspektera tillväxten av organoider under ljusmikroskopet regelbundet. Förbered en seriell läkemedelsutspädning i medier med låg tillväxtfaktor för osimertinib för behandling av EGFR-mutanta icke-småcelliga lungcancerorganoider.
Inkludera en negativ kontroll genom att lägga till media med låg tillväxtfaktor och 0,1 %DMSO. Rotera den organoida plattan medurs med 180 grader så att organoiderna nu är i position klockan 12 och aspirerar försiktigt tillväxtmedier med hjälp av en flerkanalsapparat helst. Tillsätt 100 mikroliter av kontroll eller läkemedelslösning per brunn.
Inkubera behandlade organoider igen vid 37 grader Celsius i cellodlingsinkubatorn i fem dagar. Börja utföra överlevnadsanalysen genom att tina reagenset över natten vid fyra grader Celsius. Balansera reagenset i ett vattenbad i rumstemperatur i 30 minuter före användning och blanda genom invertering.
Tillsätt 100 mikroliter av reagenset till varje brunn och blanda noggrant genom pipettering upp och ner med pipettenspetsen placerad vid den organoida kupolens position. Inkubera i fem minuter vid rumstemperatur i mörkret. Med hjälp av en flerkanalig pipett överför du cirka 150 mikroliter av lysat till en ny vit ogenomskinlig botten 96 brunnsplatta och inkuberar sedan plattan i ytterligare 25 minuter vid rumstemperatur i mörkret.
Spela in luminiscens med en ELISA-plattläsare. Spara data i ett lämpligt datatabellformat som innehåller alla råa avläsningar och inspelningar av plattans layout och läkemedel som används. EGFR-mutanta positiva TH107 organoider visade känslighet för osimertinib behandling med en halv maximal hämmande koncentration av 56 nanomolar medan EGFR-mutanta positiva TH116 organoider var resistenta mot osimertinib behandling med en halv maximal hämmande koncentration av mer än en mikromolar.
Känsligheten hos EGFR-positiva TH107 nonsmall cell lungcancer celler åtföljdes av betydande transkriptionella förändringar, inklusive en minskning av uttrycket av cell cykel-associerade gen signaturer och en ökning av uttrycket av apoptos-associerade gen signatur. Svaret från känsliga EGFR-mutanta positiva TH330 på riktade hämmare påverkas avsevärt i tillväxtmedier jämfört med medier med låg tillväxtfaktor. Kombinatoriska behandlingar i EGFR- muterade positiva TH330 resulterade i ökat behandlingssvar.
Detta tillvägagångssätt förbättrar personliga strategier för molekylär terapi eller kombinatoriska behandling regimer. Det senare hjälper till att rikta in sig på läkemedelstolerans och resistensmekanismer tidigt för att fördjupa klinisk respons och förbättra patientens resultat.
