Name: spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

يود المؤلف أن يشكر كارولين ديتمر وأندرو بريتنغهام على رؤيتهما والعديد من المناقشات المفيدة. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من صندوق أيوا للتعليم والبحث في تقويم العظام (IOER 03-17-05 و 03-20-04).

1. تحديد نشاط سينسيز الجليكوجين
<ol><li>تحضير محاليل المخزون من الكواشف المطلوبة كما هو موضح في الجدول 1 (قبل اليوم التجريبي).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>مكون</td>
			<td colspan="2">اتجاهات</td>
		</tr><tr><td>50 مللي متر تريس درجة الحموضة 8.0</td>
			<td co...

<ol>
	<li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria.">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li><li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists.">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li><li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism.">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li><li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase,+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose.">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li><li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li><li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases.">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li><li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase.">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li><li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1,6-glucosidase.">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li><li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose.">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li><li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis.">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li><li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases.">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li><li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues.">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li><li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates.">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li><li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,+6-diphosphatase,+phosphofructokinase,+glycogen+synthetase,+phosphorylase,+and+protein+kinase+from+swine+kidney.">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li><li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis.">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, 129-132 (1990).</li><li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li><li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification,+properties+and+physiological+role.">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li><li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain:+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain.">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li><li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J., Boyer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Enzymes Vol. 5. , 191-234 (1971).</li><li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+of+amylose+and+iodine.">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li><li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1,4,-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltansferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine.">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li><li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence.">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li><li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate.">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li><li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties.">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li><li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation.">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li><li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases.">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li><li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis:+An+unusual+member+of+the+starch/glycogen+synthase+family.">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-1,4-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver.">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li><li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+oyster+glucogen.">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li><li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis.">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li></ol>

بشكل عام ، تتمثل المزايا الرئيسية لجميع الطرق المقدمة في تكلفتها المنخفضة وسهولتها وسرعتها وعدم الاعتماد على المعدات المتخصصة. العيب الرئيسي الذي يشتركون فيه جميعا هو الحساسية مقارنة بالطرق الأخرى المتاحة. من السهل تقدير حساسية الإجراءات التي تنطوي على إنتاج أو استهلاك NADH / NADPH. بالنظر إ?...

ينتشر الجليكوجين على نطاق واسع في الطبيعة ، حيث يوجد المركب في البكتيريا والعديد من الطلائعيات والفطريات والحيوانات. في الكائنات الحية الدقيقة ، يكون الجليكوجين مهما لبقاء الخلية عندما تكون العناصر الغذائية محدودة ، وفي الكائنات الحية العليا مثل الثدييات ، يعمل تخليق وتدهور الجليكوجين على تخزين مستويات الجلوكوز في الدم1،2،3. وبالتالي ، فإن دراسة استقلاب الجليكوجين لها أهمية في مجالات متنوعة مثل علم الأحياء الدقيقة وعلم وظائف الأعضاء في الثدييات. يتطلب فهم استقلاب الجليكوجين دراسة الإنزيمات الرئيسية لتخليق الجليكوجين (سينسيز الجليكوجين والإنزيم المتفرع) وتدهور الجليكوجين (فسفوريلاز الجليكوجين وإنزيم debranching). تستخدم المقايسات القياسية الذهبية لأنشطة إنزيم الجليكوجين سينسيز ، والفوسفوريلاز ، والتفرع ، وأنشطة الإنزيم المتفرعة نظائر مشعة. على سبيل المثال ، يتم قياس سينسيز الجليكوجين بشكل عام في مقايسة كيميائية إشعاعية متوقفة باتباع دمج الجلوكوز من UDP- [14 C] الجلوكوز (في حالة الإنزيمات الحيوانية والفطرية) أو ADP- [14C] الجلوكوز (في حالة الإنزيمات البكتيرية) في الجليكوجين 4,5. وبالمثل ، يتم قياس فسفوريلاز الجليكوجين في اتجاه تخليق الجليكوجين ، بعد دمج الجلوكوز من [14C] الجلوكوز -1-فوسفات في الجليكوجين6. يتم فحص الإنزيم المتفرع عن طريق قياس قدرة هذا الإنزيم على تحفيز دمج [14 C] الجلوكوز من الجلوكوز -1-فوسفات في سلاسل مرتبطة α1،4 بواسطة الجليكوجين فسفوريلاز7 ، ويتم تحديد نشاط إنزيم إزالة التفرع باتباع قدرة الإنزيم على دمج [14C] الجلوكوز في الجليكوجين8 . في حين أن الركائز المشعة حساسة للغاية ، مما يسمح باستخدامها في مستخلصات الخلايا الخام ذات المستويات المنخفضة من نشاط الإنزيم ، إلا أنها باهظة الثمن وتخضع للمتطلبات التنظيمية المصاحبة لاستخدام النظائر المشعة. هذه الحواجز تضع استخدام بعض المقايسات بعيدا عن متناول العديد من العمال. ومع ذلك ، على مدار سنوات عديدة ، تم وصف مجموعة متنوعة رائعة من الأساليب الطيفية لقياس هذه الإنزيمات. بشكل عام ، تعتمد هذه الأساليب في نهاية المطاف على قياس إنتاج أو استهلاك NADH / NADPH ، أو توليد مجمعات ملونة بين الجليكوجين واليود. وبالتالي ، فهي واضحة ويمكن تنفيذها باستخدام مقاييس الطيف الضوئي البسيطة المجهزة بمصابيح فلاش التنغستن أو الزينون فقط.
تعتمد المقايسات الطيفية لسينسيز الجليكوجين على قياس ثنائي فوسفات النيوكليوزيد المنطلق من مانح نيوكليوتيدات السكر حيث يضاف الجلوكوز إلى سلسلة الجليكوجينالمتنامية 9,10. الإجراء الخاص بقياس نشاط سينسيز الجليكوجين الموصوف في القسم 1 من البروتوكول ، أدناه ، هو تعديل لذلك الذي حدده Wayllace et al.11 ، ويظهر مخطط الاقتران أدناه:
(الجلوكوز) n + UPD-الجلوكوز → (الجلوكوز) ن + 1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + فوسفوينول بيروفات → بيروفات + ATP
بيروفات + NADH + H + → لاكتات + NAD+
يضيف سينثيز الجليكوجين الجلوكوز من UDP-glucose إلى الجليكوجين. يتم تحويل UDP المتولد في هذه العملية إلى UTP بواسطة كيناز ثنائي فوسفات النوكليوزيد (NDP kinase) ، في تفاعل يولد ADP. يعمل جزيء ADP بدوره كركيزة لكيناز البيروفات، الذي يفسفر جزيء ADP باستخدام فوسفوينول بيروفات كمتبرع بالفوسفات. يتم تحويل البيروفات الناتجة إلى لاكتات بواسطة إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات في تفاعل يستهلك NADH. وبالتالي ، يمكن إجراء الفحص بطريقة مستمرة ، ومراقبة انخفاض الامتصاص عند 340 نانومتر عند استهلاك NADH. يتم تكييفه بسهولة للاستخدام مع الإنزيمات التي تتطلب ADP-glucose كمتبرع بالجلوكوز. هنا ، تكون خطوات الاقتران أبسط لأن ADP الصادر عن عمل سينثيز الجليكوجين يعمل عليه مباشرة بواسطة كيناز البيروفات.
هناك مجموعة متنوعة من المقايسات الطيفية المتاحة لتحديد نشاط فسفوريلاز الجليكوجين. في الإصدار الكلاسيكي ، يتم دفع الإنزيم للخلف ، في اتجاه تخليق الجليكوجين ، كما هو موضح أدناه:
(الجلوكوز) n + الجلوكوز -1-فوسفات → (الجلوكوز) ن + 1 + Pi
على فترات زمنية محددة ، تتم إزالة حصص خليط التفاعل ، ويتم تحديد كمية الفوسفات المحررة12,13. في أيدينا ، كان هذا الفحص ذا فائدة محدودة بسبب وجود فوسفات حر قابل للقياس بسهولة في العديد من المستحضرات التجارية للجلوكوز -1 فوسفات ، جنبا إلى جنب مع التركيزات العالية من الجلوكوز -1 فوسفات اللازمة لعمل الفوسفوريلاز. بدلا من ذلك ، استخدمنا بشكل روتيني مقايسة بديلة تقيس الجلوكوز 1-فوسفات المنطلق عندما يتحلل الجليكوجين بواسطة فسفوريلاز13. يتم استخدام مخطط تفاعل مقترن ، موضح أدناه.
(الجلوكوز) n + Pi → (جلوكوز) n-1 + جلوكوز -1-فوسفات
جلوكوز-1-فوسفات → جلوكوز-6-فوسفات
جلوكوز-6-فوسفات + NADP+ → 6-فوسفوغلوكونولاكتون + NADPH + H+
يتم تحويل الجلوكوز-1-فوسفات إلى جلوكوز-6-فوسفات بواسطة فوسفوغلوكوموتاز ، ثم يتأكسد الجلوكوز-6-فوسفات إلى 6-فوسفوغلوكونولاكتون ، مع ما يصاحب ذلك من اختزال NADP + إلى NADPH. الإجراء المفصل في القسم 2 من البروتوكول ، أدناه ، مشتق من الطرق التي وصفها Mendicino et al.14 و Schreiber & Bowling15. يمكن إجراء الفحص بسهولة بطريقة مستمرة ، مع زيادة الامتصاص عند 340 نانومتر بمرور الوقت ، مما يسمح بتحديد معدل التفاعل.
يعتمد التحديد الطيفي لنشاط إنزيم debranching على قياس الجلوكوز المنبعث من عمل الإنزيم على حد الفوسفوريلاز دكسترين16. يتكون هذا المركب عن طريق معالجة الجليكوجين بشكل شامل مع فسفوريلاز الجليكوجين. نظرا لأن عمل فسفوريلاز الجليكوجين يوقف 4 بقايا جلوكوز بعيدا عن نقطة α1,6 ، فإن الدكسترين الحد يحتوي على الجليكوجين ، وقد تم تقصير السلاسل الخارجية إلى ~ 4 بقايا جلوكوز. يوصف هنا تحضير دكسترين حد الفوسفوريلاز ، باستخدام إجراء مشتق من تلك التي طورها Taylor et al.17 و Makino & Omichi18.
التفكيك هو عملية من خطوتين. ينقل نشاط 4-α-glucanotransferase لإنزيم debranching ثنائي الوظيفة أولا ثلاثة بقايا جلوكوز من نقطة الفرع إلى الطرف غير المختزل لسلسلة جلوكوز α1,4 مرتبطة قريبة. ثم يتم تحلل بقايا الجلوكوز المرتبطة α1,6 المتبقية عند نقطة الفرع بواسطة نشاط α1,6-glucosidase19. عادة ما يتم إجراء الفحص بطريقة متوقفة ، حيث يتم قياس الجلوكوز المنطلق بعد وقت معين (أو سلسلة من الأوقات) في مقايسة إنزيم مقترنة كما هو موضح أدناه:
(الجلوكوز) ن → (جلوكوز) ن-1 + جلوكوز 
الجلوكوز + ATP → الجلوكوز-6-فوسفات + ADP
جلوكوز-6-فوسفات + NADP+ → 6-فوسفوغلوكونولاكتون + NADPH + H+
يعطي تحديد NADPH المنتج مقياسا لإنتاج الجلوكوز. ويستند الإجراء المبين في القسم 3 من البروتوكول أدناه إلى إجراء وصفه نيلسون وآخرون.16. مثل الطرق الأخرى التي تعتمد على استهلاك أو توليد NADH / NADPH ، فإن الفحص حساس للغاية. ومع ذلك ، فإن وجود الأميليز أو الجلوكوزيداز الأخرى ، والتي يمكن أن تحرر أيضا الجلوكوز الحر من دكسترين حد الفوسفوريلاز ، سوف يسبب تداخلا كبيرا (انظر المناقشة).
يعتمد التحديد اللوني لنشاط الإنزيم المتفرع على حقيقة أن سلاسل الجلوكوز المرتبطة ب α1,4 تتبنى هياكل حلزونية ترتبط باليود ، وتشكل مجمعات ملونة20. يعتمد لون المجمع المتشكل على طول السلاسل المرتبطة α1,4. وبالتالي ، فإن الأميلوز ، الذي يتكون من سلاسل طويلة غير متفرعة إلى حد كبير من الجلوكوز المرتبط ب α1,4 ، يشكل مركبا أزرق عميقا مع اليود. في المقابل ، تشكل الجليكوجينات ، التي تكون سلاسلها الخارجية بشكل عام في حدود 6 إلى 8 بقايا جلوكوز فقط ، مجمعات برتقالية حمراء. إذا تم تحضين محلول الأميلوز بإنزيم متفرع ، فإن إدخال الفروع في الأميلوز يؤدي إلى توليد سلاسل جلوكوز مرتبطة α1,4 أقصر. وبالتالي ، فإن الحد الأقصى لامتصاص مجمعات الأميلوز / اليود يتحول نحو أطوال موجية أقصر. الإجراء الذي تمت مناقشته هنا مشتق من الإجراء المفصل بواسطة Boyer & Preiss21 ويتم تحديد نشاط الإنزيم المتفرع كميا على أنه انخفاض في امتصاص مركب الأميلوز / اليود عند 660 نانومتر بمرور الوقت.
كما ينبغي أن يكون واضحا بسهولة من المناقشة أعلاه ، فإن حقيقة أن ألوان المعقدات التي تشكلت بين سلاسل اليود والجلوكوز α1,4 تختلف باختلاف طول السلسلة تعني أن أطياف الامتصاص لمجمعات الجليكوجين / اليود يجب أن تختلف مع درجة تفرع الجليكوجين. هذا هو الحال بالفعل ، وتمتص الجليكوجينات / الجليكوجينات الأقل تشعبا ذات السلاسل الخارجية الأطول الضوء بطول موجي أطول من الجليكوجينات الأكثر تشعبا / لها سلاسل خارجية أقصر. لذلك يمكن استخدام تفاعل تلطيخ اليود للحصول على بيانات نوعية سريعة عن درجة تفرع الجليكوجين22. يتشكل اللون البرتقالي والبني عندما لا تكون مجمعات الجليكوجين مع اليود شديدة بشكل خاص. ومع ذلك ، يمكن تعزيز تطوير اللون من خلال إدراج محلول كلوريد الكالسيوم المشبع22. هذا يعزز حساسية الطريقة حوالي 10 أضعاف ويسمح بتحليل جاهز لكميات ميكروغرام من الجليكوجين. تم تكييف مقايسة تحديد التفرع الموصوفة في القسم 4 من البروتوكول أدناه من إجراء طوره Krisman22. يتم إجراؤه ببساطة عن طريق الجمع بين عينة الجليكوجين ومحلول اليود وكلوريد الكالسيوم في كوفيت وجمع طيف الامتصاص من 330 نانومتر إلى 800 نانومتر. يتحول الحد الأقصى للامتصاص نحو أطوال موجية أطول مع انخفاض درجة التفرع.
بشكل جماعي ، توفر الطرق الموضحة هنا وسائل بسيطة وموثوقة لتقييم أنشطة الإنزيمات الرئيسية لعملية التمثيل الغذائي للجليكوجين ، وللحصول على بيانات نوعية عن مدى تفرع الجليكوجين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A0456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose</td>
			<td>Biosynth Carbosynth</td>
			<td>YA10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G6893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10127655001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, Type II from oyster</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexokinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11426362001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>43420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside 5&#39;-diphosphate kinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-glucose, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>U4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism

يتم تصنيع الجليكوجين كشكل من أشكال تخزين الجلوكوز بواسطة مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، بدءا من البكتيريا إلى الحيوانات. يتكون الجزيء من سلاسل خطية من بقايا الجلوكوز المرتبطة α1,4 مع فروع يتم إدخالها من خلال إضافة روابط α1,6. يتطلب فهم كيفية تنظيم تخليق الجليكوجين وتدهوره وكيف يصل الجليكوجين إلى تركيبته المتفرعة المميزة دراسة إنزيمات تخزين الجليكوجين. ومع ذلك ، فإن الطرق الأكثر استخداما لدراسة أنشطة الإنزيم هذه تستخدم عادة الكواشف أو التقنيات غير المتاحة لجميع الباحثين. هنا ، نناقش مجموعة من الإجراءات البسيطة تقنيا والفعالة من حيث التكلفة ، ومع ذلك لا تزال قادرة على توفير نظرة ثاقبة قيمة للتحكم في تخزين الجليكوجين. تتطلب التقنيات الوصول إلى مقياس الطيف الضوئي ، الذي يعمل في نطاق 330 إلى 800 نانومتر ، ويتم وصفها على افتراض أن المستخدمين سيستخدمون مطبات بلاستيكية يمكن التخلص منها. ومع ذلك ، فإن الإجراءات قابلة للتطوير بسهولة ويمكن تعديلها للاستخدام في قارئ الصفائح الدقيقة ، مما يسمح بتحليل متوازي للغاية.

تحديد نشاط سينسيز الجليكوجين يوضح الشكل 1 نتائج تمثيلية من مقايسات سينثيز الجليكوجين باستخدام إنزيمات منقاة. في اللوحة A ، بعد تأخر طفيف ، كان هناك انخفاض خطي في الامتصاص عند 340 نانومتر بمرور الوقت لمدة حوالي 12 دقيقة. كان معدل التغير في الامتصاص في الش?...

Watch this Scientific Journal Video about Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism at JoVE.com

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

يتم تقديم تقنيات لقياس نشاط الإنزيمات الرئيسية لعملية التمثيل الغذائي للجليكوجين ، باستخدام مقياس طيف ضوئي بسيط يعمل في النطاق المرئي.

الطرق الطيفية لدراسة استقلاب الجليكوجين حقيقي النواة

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

البروتوكولات مهمة ، لأنها تتجنب استخدام النظائر المشعة وتزيل حاجزا قد يمنع العديد من العمال من دراسة إنزيمات استقلاب الجليكوجين. الإجراءات الموصوفة غير مكلفة ، ولا تتطلب سوى الوصول إلى مقياس الطيف الضوئي البسيط. للبدء في تحديد نشاط سينسيز الجليكوجين ، قم بإذابة محاليل المخزون المعدة مسبقا من الجلوكوز UDP و ATP و phosphoenolpyruvate و NDP kinase على الجليد.قبل تسخين حمام مائي إلى 30 درجة مئوية. عندما تكون محاليل المخزون جاهزة ، قم بإعداد خليط فحص كاف وفقا لعدد مقايسات سينسيز الجليكوجين عن طريق إضافة الكواشف إلى أنبوب 15 ملليلتر ، كما هو موضح في بروتوكول النص. تحضير تفاعل فارغ عن طريق استبدال NADH من خليط التفاعل بالماء ، ونقل التفاعل إلى كوفيت ميثاكريلات يمكن التخلص منه.استخدم التفاعل الفارغ لتعيين صفر على مقياس الطيف الضوئي عند الطول الموجي 340 نانومتر. خذ حصة 770 ميكرولتر من خليط التفاعل في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف بالتتابع اثنين ميكرولتر من كل من خليط نازعة هيدروجين كيناز NDP وبيروفات كيناز لاكتات إلى الأنبوب. بعد الخلط ، احتضن الأنبوب برفق عند 30 درجة مئوية في حمام مائي لمدة ثلاث دقائق لتسخين خليط التفاعل.ثم أضف 30 ميكرولتر من العينة التي تحتوي على سينسيز الجليكوجين في محلول تريس 20 مليمولار عند درجة الحموضة 7.8 ، واخلطها برفق قبل نقل خليط التفاعل إلى كوفيت ميثاكريليت للتخلص منه. ضع الكوفيت في مقياس الطيف الضوئي ، وسجل الامتصاص عند 340 نانومتر على فترات زمنية محددة لمدة 10 إلى 20 دقيقة. ثم ، ارسم الامتصاص الذي تم الحصول عليه مقابل الوقت.لقياس الجلوكوز المنطلق ، انقل 40 ميكرولترا من المادة الطافية من عينات الجليكوجين المسخنة إلى كوفيت ميثاكريلات يمكن التخلص منها. وأضف الأحجام المقاسة من ثلاثي إيثانولامين ، ومحلول كبريتات المغنيسيوم الهيدروكلوريد ، وخليط NADP ATP والماء كما هو موضح في المخطوطة. امزج الخليط عن طريق السحب لأعلى ولأسفل برفق دون تكوين فقاعات هواء.أضف 0.5 ميكرولتر من نازعة هيدروجين الجلوكوز 6 فوسفات إلى كل كوفيت. بعد الخلط عن طريق السحب ، احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم سجل الامتصاص عند 340 نانومتر. بعد ذلك ، امزج 0.5 ميكرولتر من الهيكسوكيناز مع كل كوفيت كما هو موضح سابقا ، واحتضانه لمدة 15 دقيقة قبل تسجيل المجموعة الماصة 340 نانومتر.ثم استمر في الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، متبوعا بتسجيل الامتصاص. إذا زاد الامتصاص عن ذلك المسجل في 15 دقيقة ، استمر في الحضانة لمدة خمس دقائق قبل تسجيل الامتصاص النهائي عند 340 نانومتر. لتحديد تفرع الجليكوجين ، امزج 650 ميكرولتر من مخزون كاشف لون كلوريد الكالسيوم اليود مع 100 ميكرولتر من الماء في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، واخلط المحلول جيدا قبل نقله إلى كوفيت ميثاكريلات يمكن التخلص منه.ضع الكوفيت في مقياس الطيف الضوئي لإجراء تشغيل في وضع مسح الطول الموجي لجمع طيف الخلفية من 330 إلى 800 نانومتر. في أنبوب منفصل 1.5 ملليلتر ، يمزج 650 ميكرولتر من كاشف لون كلوريد الكالسيوم اليود العامل مع 50 ميكروغرام من جليكوجين المحار ، ويشكل الحجم النهائي إلى 750 ميكرولتر بالماء. بعد مزج الخليط جيدا ، انقل المحلول إلى كفيت ميثاكريلات يمكن التخلص منه لجمع طيف امتصاص من 330 إلى 800 نانومتر.وبالمثل ، احصل على طيف امتصاص يحتوي على 50 ميكروغرام من الأميلوبكتين و 30 ميكروغرام من الأميلوز كما هو موضح من قبل. للحصول على إشارة إلى البنية المتفرعة لعينة الجليكوجين غير المميزة ، ادمج 25 إلى 50 ميكروغرام من الجليكوجين مع 650 ميكرولتر من كاشف لون كلوريد الكالسيوم باليود العامل ، وتابع كما هو موضح سابقا للحصول على طيف الامتصاص. في مقايسات سينسيز الجليكوجين ، لوحظ انخفاض خطي في الامتصاص عند 340 نانومتر بمرور الوقت.أدت إضافة الكثير من سينسيز الجليكوجين إلى الفحص إلى اكتمال التفاعل خلال أول دقيقتين. لا يظهر تفاعل التحكم ، الذي لا يحتوي على سينثيز الجليكوجين ، أي انخفاض قابل للقياس في الامتصاص. البيانات من مقايسة فسفوريلاز الجليكوجين باستخدام إنزيم منقى لها طور خطي يستمر لمدة ثلاث دقائق.معدل زيادة الامتصاص من حوالي 0.01 إلى 0.04 وحدة في الدقيقة هو الأمثل. في مقايسة إنزيم إزالة التفرع الجليكوجين ، أظهر التفاعل طورا خطيا يستمر لمدة 10 دقائق على الأقل. أظهرت البيانات التمثيلية من مقايسات الإنزيم المتفرع للجليكوجين الفرق في الامتصاص بين عينات التحكم التي تفتقر إلى الإنزيم المتفرع ، والتفاعلات التي تحتوي على إنزيم متفرع.يتم توضيح النطاق الديناميكي الضيق للفحص. الحد الأقصى للتغير في الامتصاص الذي يمكن إنتاجه هو 0.4 وحدة امتصاص ، وتفقد الخطية عندما يكون التغيير في الامتصاص حوالي 0.2 وحدة امتصاص. أظهرت كتل الجليكوجين والأميلوبكتين والأميلوز المستخدمة في تقييم تفرع الجليكوجين قراءة امتصاص قصوى تبلغ حوالي 0.7 إلى 0.8 ، كل منها عند حد أقصى امتصاص مختلف.أنتجت عينة الجليكوجين قمتين عند حوالي 400 نانومتر و 460 نانومتر. كاشف لون كلوريد الكالسيوم اليود كثيف للغاية. من المهم التأكد من خلط عينات الجليكوجين بالكامل مع الكاشف قبل جمع طيف الامتصاص.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Anatomy and Physiology

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Biochemistry of the Cell

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

تحديد المحتوى فيكوبيليبروتين في سيانوباكتيريوم سينيتشوسيستيس سبيكتروفوتوميتريك

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

إجراء جنبا إلى جنب على أساس اليغنوكليوتيد عزل الحمض النووي الريبي لاسترداد مجمعات البروتين مرناً حقيقية النواة

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

التعبير، سولوبيليزيشن، وتنقية من الناقلين بورات حقيقية النواة

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

دراسة عن الأيض من المبيدات الحشرية النظامية الستة في ثقافة تعليق الخلية المنشأة حديثا المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) يترك

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

كيانات السومو الملزمة (SUBEs) كاداات لإثراء وعزل وتحديد وتوصيف بروتين السومو في سرطان الكبد

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

والتحليل الطيفي رامان المتكاملة وكتله الطيف الكتلي لدراسة امتصاص المخدرات خليه واحده, الأيض, والآثار

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...